Свойства связывающих центров альбумина: метод исследования в биологических жидкостях и опыт его применения для оценки состояния организма

Определение показателей ЭКА и ОКА.149.

Определение концентрации неэстерифицированных жирных кислот.149.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.151.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.158.

БЛАГОДАРНОСТИ.180.

Сокращения и обозначения.

АНС — 1,8-анилинонафталинсульфонат (флуоресцентный зонд).

А+ПК) — молекула альбумина, лигандированная пальмитиновой кислотой.

БКЗ — бромкрезоловый зеленый (абсорбционный краситель).

БКП — бромкрезоловый пурпурный (абсорбционный краситель).

БПЭ — безызлучательный перенос энергии.

БР — билирубин.

БСА — бычий сывороточный альбумин.

ВВ — водянистая влага.

ЖК — жирная кислота.

ИБ — ибупрофен.

ИТ — индекс токсичности.

К-35 — N-карбоксифенилимид диметиламинонафталевой кислоты 2-МЭ — 2-меркаптоэтанол.

НЭЖК — неэстерифицированные жирные кислоты ОФА — ортофталевый диальдегид.

ОФА-А — продукт реакции ОФА с альбумином в присутствии 2-меркаптоэтанола (изоиндольная флуоресцентная метка) РП — распространенный перитонит СЖ — слезная жидкость ФБ — фенилбутазон ФЗ — флуоресцентный зонд ЧСА — сывороточный альбумин человека.

В данной работе, если специально не оговорено иное, термин «альбумин» употребляется з значении «сывороточный альбумин человека».

СКУ.

Физиологические и патологические процессы проявляются в виде физико-химических изменений на разных уровнях организации живой системы, в том числе на молекулярном. Изучение этих изменений, раскрытие их медико-биологического значения, является фундаментальной задачей медико-биологической науки. Получаемые результаты являются основой для создания новых методов диагностики, лечения и профилактики различных заболеваний.

Физико-химические изменения при различных состояниях организма затрагивают и белки. Нарушение структуры белка может быть обусловлено генетически, и в этом случае изменяется его первичная или вторичная структура. Оно может быть посттрансляционым, когда синтезируется нормальный белок, структура которого и, соответственно, функционирование, изменяются в процессе жизни этого белка в организме. В ряде случаев химическое изменение белков является специфическим диагностическим признаком патологического процесса, например, их гликозилирование при диабете.

Большую и важную группу белков в организме составляют транспортные белки. Они не проявляют заметной ферментативной активности. Главная функция этих белковобратимое связывание низкомолекулярных веществ (лигандов) и доставка их в виде образовавшегося комплекса к клеткам-мишеням. К таким белкам относится и сывороточный альбумин человека (ЧСА), составляющий около 50% (по массе) белков плазмы и присутствующий также в тканях. Альбумин способен обратимо связывать большое количество низкомолекулярных (примерно до 600 Да) метаболитов (билирубин, жирные кислоты, холестерин и др.) и ксенобиотиков гидрофобной и амфифильной природы. Для выполнения этой функции на молекуле альбумина есть специальные участки — связывающие центры [1,2].

Различные вещества — метаболиты и ксенобиотики — могут конкурировать за общие места связывания на альбумине, и учет этой конкуренции необходим при назначении лекарственной терапии [3−6].

Однако конкуренция может быть не единственным процессом, оказывающим влияние на состояние альбуминовых центров. В середине 1990;х годов сформировалось представление о том, что связывающие центры в молекуле альбумина сформированы до взаимодействия с лигандом, могут приспосабливаться и изменяться в процессе взаимодействия с ним [7,8]. То есть в процессе выполнения транспортной функции конформация и свойства альбуминовых центров изменяются.

Возникает вопрос: каково медико-биологическое значение этой реакции, и может ли количественное ее тестирование оказаться полезным в практическом плане — для целей медицинской диагностики? Не могут ли различные по своей природе физико-химические воздействия, в частности, связывание лигандов даже в разных центрах приводить к сходным изменениям в молекуле альбумина или, по крайней мере, в каком-то ее участке? К моменту начала данной работы ответа на эти вопросы не было. Их решение могло открыть новые подходы к пониманию патогенеза заболеваний, пути к созданию принципиально новых методов диагностики и оценки эффективности лечения больных.

Для решения поставленной проблемы было необходимо создать метод для исследования свойств альбуминовых центров в биологических жидкостях. Состояние альбуминовой глобулы весьма чувствительно к различным физико-химическим воздействиям, в том числе, к процедуре фракционирования сыворотки. Поэтому важно было создать метод, который позволил бы изучать альбумин без его выделения из биологической жидкости. Этот метод должен быть чувствителен к воздействиям на альбумин, в том числе к присоединению к нему лигандов.

К началу работы были созданы предпосылки для создания такого метода на основе флуоресцентных зондов. В результате сотрудничества между НИИ физико-химической медицины (чл.-корр. РАМН, профессор Г. Е. Добрецов) и НПО «Монокристалл» (проф. Б.М.Красовицкий) был синтезирован флуоресцентный зонд, получивший название К-35 (N-карбоксифенилимид диметиламинонафталевой кислоты). Особенностью этого вещества является то, что при добавлении в плазму крови более 95% наблюдаемого сигнала флуоресценции происходит от молекул зонда, связанных с альбумином. Эти результаты открыли возможность изучения альбуминовых центров непосредственно в сыворотке, без выделения из нее альбумина. Однако к началу работы отсутствовал метод и стабильные реактивы, с помощью которых можно было бы изучать состояние альбуминовых центров независимо от концентрации этого белка в биологической жидкости.

Первые исследования зонда К-35, выполненные Р. К. Айдыралиевым и Ю. И. Миллером, показали высокую чувствительность его флуоресценции к состоянию альбуминовой глобулы. Однако молекулярные механизмы этой чувствительности раскрыты не были.

Предварительные результаты, полученные в НИИ ФХМ МЗ РФ, показали, что при ряде заболеваний флуоресценция зонда из сыворотки меняется. Однако широкого исследования не было проведено, в том числе из-за отсутствия удобной технологии метода. Информативность наблюдаемых изменений флуоресценции у больных также была не изучена.

В соответствии с поставленными вопросами были сформулированы цель и задачи данной работы.

Цель работы — изучение молекулярных механизмов и медико-биологической значимости изменений связывающих центров альбумина.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Создать метод для исследования свойств центров альбумина в нефракционированных биологических жидкостях.

2. Раскрыть механизмы чувствительности флуоресценции молекулярного зонда К-35 (N-карбоксифенилимида диметиламинонафталевой кислоты) к состоянию альбуминовой глобулы.

3. Исследовать информативность изменений свойств альбумина, выявляемых флуоресцентным методом, при различных заболеваниях человека.

Выводы.

1. На основе молекулярного флуоресцентного зонда К-35 (N-карбоксифенилимид диметиламинонафталевой кислоты) создан новый флуоресцентный метод исследования альбумина в биологических жидкостях. Метод включает определение двух показателей. Один — «общая концентрация альбумина» (ОКА) — является аналогом концентрации ЧСА,. измеряемой унифицированными биохимическими методами. Второй — «эффективная концентрация альбумина» (ЭКА) — зависит как от ОКА, так и от состояния альбуминовых центров. Индекс ЭКА/ОКА зависит только от состояния альбуминовых центров. Метод может быть применен для исследования как сыворотки, так и жидкостей с низкой концентрацией альбумина (водянистая влага, слезная жидкость).

2. Предложенный метод был адаптирован для использования в клинической лаборатории. Созданная технология флуоресцентного альбуминового теста высоко стабильна, воспроизводима, проста в исполнении и может быть реализована на серийно выпускаемых реактивах и оборудовании. Разработанные наборы реактивов стабильны при хранении не менее 10 лет. Погрешность определения ОКА в сыворотке не превышает 5%, при анализе контрольных материалов — 2,9%.

3. Взаимодействие между участком молекулы ЧСА, связывающим зонд, и четырьмя альбуминовыми центрами (центры I и И, центры жирных кислот и билирубина) приводит к изменению флуоресценции К-35 и показателя ЭКА. Оно происходит главным образом по аллостерическому механизму, конкуренция наблюдается только в центре I. Связывание ' лигандов с высокоаффинным центром двухвалентных катионов и остатком Cys-34 не влияет на флуоресценцию К-35.

4. Длинноцепочечные неэстерифицированные жирные кислоты являются регуляторами как транспортной функции альбумина, так и его окислительно-восстановительной активности. При связывании с альбумином они аллостерически влияют на состояние «лекарственных» центров I и II и центра, взаимодействующего с К-35. Одновременно с этим жирные кислоты изменяют доступность остатка Cys-34 окружающему белок раствору и этим оказывают влияние на его окислительно-восстановительную активность.

5. Обсуждаемый в литературе вопрос о размерах молекулы сывороточного альбумина человека в растворе был изучен методом малоуглового рассеяния нейтронов. Радиус гирации альбуминовой глобулы составил 27,42 ± 0,35 А. Это свидетельствует о, том, что молекула альбумина больше, чем плотная сфера того же объема, но заметно меньше, чем предполагавшаяся ранее модель «сигары».

6. Исследования влияние лигандов — маркеров связывающих центров на взаимодействие К-35 с альбумином показало, что в основе чувствительности флуоресценции К-35 к состоянию центров ЧСА лежат следующие механизмы: 1) изменение микроокружения зонда в связывающих центрах, по-видимому, вследствие локальных изменений их конформации- 2) конкуренция между зондом и другими лигандами альбумина, главным образом, в связывающем центре I- 3) безызлучательный перенос энергии электронного возбуждения между зондом и некоторыми лигандами.

7. Молекулы К-35, связанные с альбумином, могут быть представлены в виде нескольких популяций, имеющих времена затухания флуоресценции от 8,2 не и ниже. С помощью нового метода анализа амплитуды затухания флуоресценции в наносекундном диапазоне был выявлен пул молекул К-35 с потушенной флуоресценцией (с недетектируемым временем жизни, менее 0,05 не), составляющий от 40 до 60% молекул зонда, связанных с альбумином. Воздействие на альбумин физико-химических факторов (связывание жирных кислот, динамическое тушение, изменение рН, ионной силы, температуры) приводит к изменению распределения молекул зонда по временам жизни возбужденного состояния. При стационарных измерениях это выражается в изменении квантового выхода флуоресценции К-35 в альбумине.

8. Изменения альбумина, выявляемые с помощью флуоресцентного теста, могут быть информативны в отношении прогноза течения ряда заболеваний. У больных психическими заболеваниями показатели теста могут быть использованы для оценки эффективности терапии. В области офтальмологии предложен новый способ прогноза развития катаракты при первичной открытоугольной глаукоме по величине показателя ЭКА/ОКА в слезной жидкости. В области реаниматологии впервые было показано, что у больных распространенным перитонитом комбинация двух показателей — ЭКА и уровня мочевины сыворотки — связана с исходом заболевания уже в первые сутки после оперативного вмешательства. Это создает основу для объективного раннего прогноза течения этого заболевания.

9. Данные, полученные при изучении состояния альбуминовых центров при более чем 30 заболеваниях у человека, а также при остром экспериментальном стрессе у животных, позволили предложить гипотезу. о конформационных изменениях связывающих центров альбумина как универсальной неспецифической реакции организма на патологический процесс.

Заключение

.

Задачи, поставленные в работе, решены.

1. Создан оригинальный метод.

2. Раскрыты его механизмы.

3. Показана информативность определяемых показателей.

Работа имеет как фундаментальный, так и практический, прикладной характер.

Фундаментальный характер работы заключается в раскрытии молекулярных механизмов чувствительности флуоресценции молекулярных зондов к изменениям физико-химических свойств сывороточного альбумина при физико-химических воздействиях. Установлено значение локальных конформационных изменений связывающих центров в реакции альбумина на развитие патологического процесса. Показано, что эта реакция затрагивает связывающую и антиокислительную функцию альбумина.

Практическое значение результатов работы нашло отражение в создании технологии нового оригинального флуоресцентного теста для исследования свойств альбумина в клинике. Создан флуоресцентный высоко чувствительный метод определения концентрации альбумина. Разработаны технические условия и выпущены опытная партия реактивов для исследования альбумина, отличающихся высокой стабильностью при хранении (не менее 10 лет). Все операции для проведения флуоресцентного альбуминового теста могут быть проведены на серийно выпускаемых клинических флуоресцентных анализаторах AKJI-01 и небиологических имитаторов состава сыворотки ГСО 6296−91.

Созданный флуоресцентный тест для оценки свойств альбумина был использован более чем в 60 клиниках России и СНГ. Его клиническое значение продолжает исследоваться при различных заболевания, о чем свидетельствуют защищенные недавно докторские (Д.Н.Дегтярев 1999, Н. И. Курьппева 2001) и кандидатские (O.JI Андреева 1998, Т. И. Черныш 1999, М. Н. Комарова 2000, Ю. А. Покровский 2001, Н.И.Кравченко-Бережная 2001, Л. А. Пестряева 2002, Т. И. Шалаева 2003) диссертации. Предложенное в работе понятие «эффективная концентрация альбумина» встречается в 41 документе в сети Интернет.

Разработанная технология позволила получить практические результаты в различных областях медицины.

В области хирургии, реаниматологии и критических состояний результаты ' многоцентрового исследования информативности альбуминового флуоресцентного теста при распространенном перитоните позволили выработать новый подход к раннему прогнозу течения этого заболевания. Показано, что использование двух показателей: флуоресцентного (ЭКА) и биохимического (уровня мочевины сыворотки) позволяет с эффективностью около 85% прогнозировать течение распространенного перитонита. Результаты этой части работы опубликованы в статье (2003 г.) и в методическом пособии МЗ РФ (Москва, 2002).

В области офтальмологии показано, что свойства альбумина водянистой влаги глаза могут быть оценены по результатам анализа слезной жидкости с помощью флуоресцентного альбуминового теста. Проведенные исследования позволили предложить новые способы для прогнозирования развития: 1) инволюционного офтальмотоксикоза- 2) катаракты при первичной открытоугольной глаукоме. Практические результаты этой части исследования закреплены в виде статей, патентов РФ ¦ и методических рекомендаций М 3 РФ [Н.И.Курышева и соавт. 2000, 2003].

В области психиатрии раскрытие механизмов чувствительности флуоресцентного теста и клинические наблюдения привели к созданию новых способов оценки эффективности проводимой терапии при психозах различного генеза. Результаты закреплены патентами РФ (Патенты РФ №№ 2 138 818 и 2 138 819).