Усовершенствование технологии изготовления и изучение свойств трипсина сухого для вирусологических целей

Актуальность проблемы. В вирусологической практике для диспергирования тканей животных и птиц наиболее широко используется трипсин и значительно реже другие протеолитические ферменты, в основном импортного производства (41, 60). Отечественные препараты, как правило, нестандартны по активности, производятся в незначительных количествах и не обеспечивают возрастающие объемы производства культур клеток и противовирусных пренара тов.

Анализ существующих технологий изготовления трипсина показал, что для производства препарата используются, в основном, несовершенные способы разделения суспензии, получения и высушивания конечного продукта, которые не отвечают современным требованиям по техническим и технологическим характеристикам и приводят к низкой активности и повышенной токсичности фермента.

Поэтому исследования, направленные на изыскание новых средств и технологических решений промышленного получения трипсина имеют для производства противовирусных препаратов бесспорную актуальность.

Большой вклад в решение указанных проблем внесли отечественные и зарубежные исследователи, труды которых определили общее направление и перспективы дальнейшего научного поиска (6, 15, 16, 48, 91). Многие вопросы еще не решены и нуждаются в теоретическом обосновании, разработке и внедрении в практику.

Цели и задачи исследований. Целью работы явилось усовершенствование технологии и оптимизация условий промышленного производства трипсина сухого для вирусологических целей с использованием современного оборудования, средств и методов контроля препарата, изучение его физико-химических и диспергирующих свойств, оценка эффективности применения препарата в вирусологической практике.

Для достижения цели работы потребовалось решить следующие задачи:

— изучить способы получения и контроля трипсина и изыскать возможные пути усовершенствования технологии производства препарата;

— определить общие требования к исходному сырыо и его подготовке к технологическому процессу;

— изучить влияние различных технологических параметров на эффективность производства и качество конечного продукта;

— разработать и оптимизировать технологию изготовления сухого трипсина с использованием современного оборудования;

— разработать технологическую линию производства трипсина для вирусологических целей;

— отработать методы контроля препарата, отвечающего требованиям квалификации «для культур клеток» ;

— оценить пригодность трипсина для получения широкого спектра культур клеток, вирусов и противовирусных препаратов;

— разработать нормативно-техническую документацию на получение, контроль и применение трипсина квалификации «для культур клеток» в вирусологической практике.

Научная новизна. Научно обоснован комплекс данных по характеристике биообъекта, общности и специфичности биотехнологических процессов, их оснащенности, выбору средств, методов и оптимальных условий получения трипсина сухого квалификации «для культур клеток» .

На основе применения отечественного оборудования разработана технологическая линия и определены оптимальные технологические параметры процессов промышленного производства трипсина. Выявлено влияние различных факторов на качество готового препарата.

Показана возможность применения сухого трипсина для получения широкого спектра культур клеток, вирусов и противовирусных препаратов.

Практическая ценность работы. Разработана промышленная технология получения трипсина сухого для вирусологических целей, оптимизированы условия его производства при применении технологической линии с использованием современного и модернизированного оборудования.

Определеньт общие требования к исходному сырью, подобрано высокопроизводительное отечественное оборудование, определены оптимальные режимы изготовления и методы контроля трипсина сухого квалификации «для культур клеток» .

Доказана пригодность и перспективность препарата для использования в вирусологической практике.

Разработана и утверждена нормативно-технологическая документация на изготовление, контроль и применение трипсина для вирусологических целей.

Апробация работы. Основные положения исследований доложены и получили положительную оценку на IV Всесоюзной и V Всероссийской конференциях «Научные основы технологии промышленного производства биологических препаратов» (Москва, 1991, 1996), Всероссийской научной конференции «Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных» (Москва, 1996), на Ц Международной научно-производственной конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции» (Москва, 1997), на Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 статей, утверждена нормативно-техническая документация.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения. Работа содержит 35 таблиц, 16 рисунков. Библиографический список включает 167 наименования, из них 101 отечественных и 66 зарубежных авторов.

В ы в о д ы.

I. В результате усовершенствования и оптимизации технологических процессов разработана высокоэффективная технология изготовления трипсина сухого для вирусологических целей, включающая:

— отбор и контроль исходного сырья;

— измельчение поджелудочной железы крупного рогатого скота;

— экстрагирование фермента и центрифугальное разделение суспензии ткани поджелудочной железы;

— высаливание балластных веществ и отделение их с помощью центрифугирования;

— высаливание трипсина и выделение его из суспензии центрифугированием;

— распылительное высушивание фермента;

— контроль препарата по физико-химическим и биологическим свойствам.

Разработанная технология позволяет1 получить трипсин с активностью не менее 200 ЕД по Шоу-Петиколас.

2. Определены общие требования к исходному сырью и его подготовке. Показана перспективность использования в качестве исходного сырья поджелудочной железы крупного рогатого скота со сроком хранения не менее 4 месяцев. Установлено, что двукратное замораживание и оттаивание сырья и измельчение ткани на фрагменты размером не менее 8 мм повышает активность препарата на 20−30%.

3. Отработаны технологические режимы, температурные и временные пае> раметры ведения процессов экстрагирования и высаливания трипсина. Показана целесообразность экстрагирования фермента при пониженных температурах (не выше 16 °С). Установлено, что плавное перемешивание суспензии в автоматическом режиме устраняет образование пены и устойчивой суспензии.

4. Определены эффективные способы разделения суспензии на стадиях экстрагирования и высаливания фермента, подобрано и модифицировано цен-трифугальное оборудование в зависимости ог физико-химических свойств суспензии ткани поджелудочной железы, стадии производства и массы исходною сырья. После экстрагирования отмечено эффективное разделение на жидкую и твердую фазы при использовании осадительной и осадительно-филътрующей центрифуг, после высаливания — при использовании суперцентрифуги, осади-тельно-фильтрующей центрифуги и центробежных жидкостных сепараторов. Замена простого фильтрования на методы центрифугирования и сепарирования суспензии позволяет снизить затраты рабочего времени в 2−3 раза.

5. Показана пригодность безасбестовых фильтр-пластин, мембранных фильтров для получения стерильных растворов трипсина и полых полупроницаемых ультрафильтрационных волокон для очистки, концентрирования и обессоливания растворов ферментного препарата методом диафильтрации.

6. Установлена равноценная активность трипсина в высоле и образцах ферментного препарата, высушенного распылением и сублимацией. Распылительный метод сушки трипсина позволил сократить длительность процесса сушки в сравнении с другими способами (сублимационным, калориферным, конвективным) и одновременно совместить процесс сушки, измельчения и стандартизации препарата.

7. Разработаны методы контроля трипсина сухого квалификации «для культур клеток» и определены предельно допустимые показатели качества, включающие определение внешнего вида, цвета, запаха, растворимости, массовой доли влаги, протеолитической активности, диспергирующих свойств и токсичности препарата в отношении ткани и Клеток куриных эмбрионов. Установлен срок хранения препарата в течение двух лет при температуре 2−6°С.

8. Разработана промышленная технологическая линия по производству трипсина с использованием современного оборудования. Технология изготов.

— ления сухого трипсина для вирусологических целей испытана в опытно-промышленных условиях на биопредприятиях, полученные партии трипсина с положительным эффектом применены в вирусологической практике.

9. Установлено, что растворы трипсина пригодны для диспергирования различных видов тканей при получении первичных культур клеток животных.

ФЭК, ФЭП, ПЭК, ТБ, ПК, ПКШ, П1Д) и поддержания перевиваемых линий / клеток (МДБК, МДСК, СПЭВ). Диспергент не оказывает влияние на адгезивные и ростовые свойства клеток, срок образования монослоя и морфологию клеток в культуре. Отмечено, что первичные и перевиваемые культуры клеток, изготовленные с использованием диспергента на основе трипсина сухого и контрольного коммерческого препарата обладают равноценной чувствительностью к вирусам и обеспечивают максимальное накопление вирусов в производстве вакцин против болезни Марека, инфекционного ринотрахеита и парагриппа — 3 крупного скога и парвовируса энтерита собак.

10. Определена пригодность трипсина сухого для производства культур клеток ФЭП и выращивания штамма ФС-126 вируса герпеса индеек и штамма ЭПМ вируса чумы плотоядных. Изготовлены опытно-промышленные серии вакцины, в хозяйствах установлена их безвредность, высокая иммуногенность, отмечен положительный эффект препаратов в вегеринарной практике.

11. Установлена экономическая эффективность технологии получения трипсина для вирусологических целей за счет снижения трудозатрат в результате интенсификации процессов разделения, сокращения времени сушки при использовании метода распыления.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

По результатам исследований разработана и утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода Российской Федерации нормативно-техническая документация:

— Технические условия ТУ 9358.013.8 064−96 «Трипсин сухой для вирусологических целей», утвержденные 04.03. 1996 г.;

— Технологический регламент производства трипсина сухого для вирусологических целей, утвержденный 01.06.1995 г.;

— Временные наставления по применению трипсина сухого для вирусологических целей, утвержденные 29.08.1991 г.

Предложена технология получения трипсина сухого для вирусологи-" ческих целей, которая отработана на базе ВНИТИБП, Омского и Алма-Атинского биокомбинатов, Курганского НПО «Синтез». t.

1.3.

Заключение

.

Анализ литературных данных показал, что ферментные препараты долгое время служили и продолжают служить моделью изучения кинетики и специфичности ферментных реакций. Изучению их свойств и структуры были посвящены работы 50−70 годов. Сведения о выделении отдельных ферментов носили общий характер.

Изучение вопроса получения ферментов показало, что дня разработки оптимизированных технологий важное значение имеет использование существующего опыта, а также применение интенсивных способов разделения, очистки, высушивания ферментных препаратов, методов контроля на всех этапах, оценка качества готового продукта и области применения.

1—Г «> ^ 1 V1.

Получаемый доя однослойных культур клеток аморфный трипсин весьма нестабилен, а сведения о получении его и использовании носят незавершенный характер. Поэтому усовершенствование технологии изготовления трипсина дня вирусологических целей, а также изучение его свойств и эффективности применения в вирусологической практике актуально. Получение высокоактивного препарата возможно. при использовании современных способов изготовления и высокоэффективного оборудования, разработки технологической линии, определения оптимальных технологических параметров, а также общих требований к сырью, его подготовке, выбору количественных методов контроля препарата.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Работа выполнялась в соответствии с планом НИР ОКР в отделе «Процессы и аппараты» ВНИТИБП по договору 04.03 и 4 г (1990;1998гг.) и в лаборатории культур тканей, питательных сред и растворов ВГНКИ, на биопредприятиях (Омском и Алма-Атинском биокомбинатах, Армавирской и Курской биофабриках и НПО Синтез (г. Курган).

Трипсин.' При проведении сравнительных исследований использовали трипсин производства фирм Дифко, Феррак, Мерк, трипсин, изготовленный по РСТ Латвийской ССР 424−84 ТУ ОКП 921.828.1500, трипсин производства ВНИТИБП по ТУ Л 0.07.194−9 ].

Исходное сырье для получения трипсина. Источником получения трипсина было животное сырье. В работе использовали поджелудочную железу (ГОК): крупного рогатого скота (КРС)-говяжыо (Г), свиную ©, куриную (К).

Реагенты для экстрагирования и высаливания. Для экстрагирования фермента были использованы: дистиллированная вода по ГОСТ 6709–72., серная кислота по ГОСТ 4207–77, а для высаливания балластных белков и трипсина — сульфат аммония по ГОСТ 3769–78.

Питательные среды, растворы и сыворотки. В работе использовали: растворы Хенкса (рН 7,2−7,4) и Эрла (рН 7,1−7,2), питательные среды: — с 0,25% ферментным гидролизатом мышц, сухим (ФГМС) — производства ВНИИЯИ, Щелковского биокомбината- - с 0,5% гидролизатом лактальбумина (ГЛА) фирмы Дифко и полученного по инструкции ВГНКИ- - Игла, изготовленную ИПиВЭ РАМН, 199 и ГЛА, изготовленные ИПиВЭ РАМН.

Сыворотки крови животных (крупного рогатого скота, плодов коров, телят, овец) добавляли в питательные среды до концентрации 1−10%. Питательные среды и растворы готовили в соответствии с требованиями «Методических рекомендаций по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов» .

Первичные культуры клеток. В экспериментах были использованы первичные культуры клеток (ПКК) различного происхождения — почек крольчат (ПК), щенков (ПЩ), кошек (ПКШ), эмбрионов коров (ПЭК), текстулы быка (ТБ), эмбрионов кур (ФЭК).

Перевиваемые линци клеток. В работе использованы перевиваемые линии клеток (ПЛК) — почек телят (МДБК), почек собак (МДСК), почек свиней ' (СПЭВ).

Доноры тканей. В качестве доноров тканей были взяты: 1−4 недельные крольчата, 1−2 месячные щенки и котята, эмбрионы коров (3−9 месячные), эмбрионы кур (7−12).

Вирусы. В работе исследования проводили с вирусами болезни Ауески (ВБА) — штамма БУК-682, парагриппа-3 (ПГ-3) — штамма MB, А 1/77, инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота — штамма МВА 1/80, энтерита собак (ПВЭС) — штамма С и Д, болезни Марека, герпеса индеек (ВГИ) — штамма ФС-126, чумы плотоядных — штамма (ЭПМ).

Контроль трипсина. По ГОСТ 202 642–89 определяли органолептические свойства препарата: внешний вид, цвет, запах. Массовую долю влаги — по ГОСТ 24 961–89. Растворимость — по ТУ 10.07.194−91.

Измерение концентрации водородных ионов проводили с помощью рНметра в диапазоне измерения 0−4 и 4−9 (+ 0,05) по инструкции к прибору. Контроль за солесодержанием раствора трипсина осуществляли кондуктометрическим методом с помощью кондуктометра ОК 102/1 (производства Венгрии) по величине электропроводности, выраженной в микросименсах или мега омах. Оптическую плотность растворов трипсина определяли с помощью фотоколориметра. ФЭК-56 М согласно инструкции к прибору (при длине волны 540 нм и использовании кюветы толщиной 10,007). Прозрачность не осветленных растворов трипсина (разведенных ФБР 1:2 — 1:128) определяли на нефелометре типаНФР.

Наличие фермента определяли с помощью экспресс метода с применением фотопленки (69), метода по РСТ Латвийской ССР 424−84 ТУ ОКГ1 921.828.1500.

Протеолитическуго активность трипсина оценивали по методу IIIоу-Петиколас, основанному на турбометрическом определении количества нерас-щепленного казеина после его инкубации с трипсином в строго регламентированных условиях. За единицу активности трипсина принято такое количество фермента, которое за 15−20 мин инкубации при 37 °C переводит в состояние неосаждаем ост и трихлоруксусной кислотой половину казеина, содержащегося в 0,25% растворе при реакции в равных объемах. Пробы колоримегрировали на фотоэлектроколориметре. Активность раствора трипсина определяли по графику, составленному по результатам экстинции исследуемых проб и контрольного раствора, и выражали величиной разведения пробы.

Диспергирующая активность определялась при трехкратном диспергировании тканей куриных эмбрионов с интервалом 30 мин в экспериментальных и контрольных растворах 0,25% трипсина. Клетки отделяли от трипсина центрифугированием при частоте вращения ротора 1000 об/мин. По выходу клеток с 1 г ткани (до центрифугирования) судили о эффективности диспергирования тканей с применением 0,25% раствора трипсина.

Токсичность оценивали по жизнеспособности клеток, ростовым свойствам, с учетом посевной дозы отдельно взятой культуры.

Подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Ростовые свойства клеток определяли по их адгезивной способности, сроку формирования монослоя, урожаю клеток монослойных культур, индексу пролиферации. с>

Чувствительность культур клеток к вирусам определяли на клетках полученных с использованием трипсина сухого (ТС) опытного и контрольного при заражении общепринятым методом и инкубировали в стандартных условиях при температуре 37 °C ± 0,5 С. Образцы культур заражали вирусологическим материалом (ВСМ) и проводили 3−5 пассажей опытных и контрольных культур клеток. Определение тигра вируса проводили по методу Рида и Менча и выражали в ТЦД 5о/мл.

Оборудование и материалы. В работе использовали оборудование, которое входило в технологическую линию по старой и новой технологии (табл.1). В лабораторных исследованиях использовали для разделения суспензии центрифугу 8−70. В технологическом процессе получения трипсина применяли центрифуги ОП11−325, Рапид, ОФСст, ОТР-Ю1К.

Для фильтрования растворов трипсина использовали различное оборудование: рамные фильтры, фильтродержатели, ультрафильтрационные установки, перечень этого оборудования представлен в табл.2.

В технологическом процессе получения ферментного препарата использовали различные фильтрующие материалы, которые указаны в табл.3.

Высушивание препарата проводили на калориферной, конвективной, распылительной и сублимационной установках. Для сублимационной сушки препарата использовали установки типа ТГ-15 и ТГ-50, а для распылительной сушки — установки «Минор» фирмы «Ниро-Атомайзер» и отечественную РСЦ-1,2/09 БК РСЦ-10.

Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки материалов использовали метод Стыодента (42). Различия считали достоверными при Р меньше 0,05.

Спецификация оборудования по старой и новой технологии.

Наименование оборудования.

Этапы Старая технология Новая технология.

1 2.

Подготовка сырья Холодильник или холодильи. комната Холодильник или холодильн. комната.

Измельчение Волчок (0= 1000) Электромясорубка.

Экстрагирование и 2 Реактор (У=5(Юл) Реактор (''=630л) (У=1000л).

Разделение суспензии после 1 и 2 экстрагирования Фильтрование через марлю Фильтрование на нутч-фильтре через капроновую сетку.

Центрифугирование Рапид ОГШ ОФС’е, ОФСег 200,¼) (р-200л/ч).

Высаливание 1 и 2 Реактор (¥-=300л) Реактор (У=450 л) (У=630 л).

Разделение суспензии после 1 высаливанщ Фильтрование через мешки из ткани Бета Фильтрование на нутч-филыре через бел ы и н г-ткань.

Центрифугирование: OTP- 10! К, ОФСст. Сепарирование: саморазгружающийся сепаратор

Разделение суспензии после 2 высаливания Фильтрование через фильтровальную бумагу Центрифугирование: ОТР-Ю1К, ОФСст. Сепарирование: камерный сепаратор

Сушка Калориферная Распылительная: РСЦ 1,2/09 БК РС. Ц-10- Минор. Сублимационная: ТГ-15-ТГ-50. Конвекционная.

Фильтровальное оборудование, используемое при очистке растворов трипсина.

Наименование Тип Используемые Цели оборудования оборудования материалы применения.

Рамные филмры ФС-3 Глубинные фильтры Предварительное,.

ФС-4 тонкое и.

• РФ-39 стерилизующее.

РФ-79 фильтрование.

Фильтродерлсатели 90 Мембранные фильтры, Предварительное,.

0 мм) 142 фильтр-пластины, тонкое и.

293 картон стерилизующее фильтрование.

Комплект ЛКСФ-1 Полупроницаемые Предварительное, оборудования для мембраны, тонкое и стерилизующего предфильтр-картон стерилизующее оборудования фильтрование.

Мультиплетная УСФ-293/7 Блок для глубинных Предварительное, установка фильтров и блок для тонкое и мембранных фильтров стерилизующее фильтрование.

Ультрафильтрацион-, УПЛ-06 Полые Очистка и ные установки на УГ1В-6 полупроницаемые концентрирование полых УФУ-6 ультрафильтрационные полупроницаемых волокна волокнах.