Лазерно-флуоресцентные малоинвазивные методы дозиметрии распределения света и концентрации глюкозы в биологических тканях

Вступление.

Лазеры и лазерные технологии за последние три десятка лет вошли во все сферы человеческой деятельности. Одной из наиболее важных для общества областей применения лазеров является медицина [1, 2, 3]. Благодаря высокой плотности мощности излучения и низкой расходимости пучка, лазер является наилучшим источником света для работы с оптоволоконной техникой. В зависимости от длины волны, плотности мощности и времени импульса излучения, лазер может быть как скальпелем с минимальной шириной «лезвия», так и аппаратом точечного выпаривания сколь угодно малых участков биологической ткани [4]. Высокая спектральная и пространственная плотность мощности позволяет использовать лазеры для измерения, как люминесцентных свойств ткани, так и таких тонких явлений, как доплеровский сдвиг спектра при отражении луча от движущихся молекул гемоглобина в кровеносных сосудах.

Ярким примером медицинского применения лазеров и флуоресцентной спектроскопии является бурно развивающаяся область фотодинамической терапии (ФДТ) [5] злокачественных новообразований. Для корректного проведения ФДТ одним из важнейших критериев является точная информация о пространственном и временном распределении света внутри биологической ткани, которое зависит от типа ткани, геометрии органа, его кровенаполненности, степени оксигенации [6], расположения сосудов [7], выгорания препарата [8, 9] и пр. и т. п. [10, 11].

Существует множество подходов, позволяющих либо в явном виде измерить, либо посредством математической модели [12 13] предсказать распределение плотности мощности внутри органа при ФДТ, однако, явное измерение зачастую неприемлемо по причине высокой степени инвазии в ткань, что недопустимо при лечении онкологических заболеваний, а модельные приближения не всегда дают точный ответ, что чревато неэффективным ходом лечения.

В настоящей работе предлагается явный и, в то же время, малоинвазивный метод дозиметрии пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения в биологической ткани при ФДТ с использованием флуоресцентной спектроскопии [14, 15]. Низкая степень инвазии достигается за счет размещения нескольких флуоресцентных сенсоров на одном оптоволокне достаточно маленького диаметра (200мкм), чтобы не вызвать патологические процессы.

В качестве другого применения лазерно-флуоресцентной спектроскопии для малоинвазивной диагностики, в работе предлагается оригинальная методика измерения сахара в крови человека путем получения межклеточной жидкости при лазерной перфорации поверхности кожи с последующим флуоресцентным анализом капли на содержание глюкозы.

Актуальность темы

.

В настоящее время активно развиваются и находят широкое применение малоинвазивные лазерно-спектроскопические методы исследования и диагностики различных патологий на различных тканях [16].

Одной из наиболее важных проблем является проведение точной пространственной дозиметрии и мониторинга во времени лазерного излучения внутри биологической ткани в процессе фотодинамической терапии [17]. Связано это в том числе с тем, что в последнее время в фотодинамической терапии все больше используются фотосенсибилизаторы сосудистого типа, имеющие относительно низкий контраст накопления в опухоли относительно нормальной ткани, в частности, Тукад, Визудин, пр. В этом случае лазерное излучение должно доставляться так и в том объеме, чтобы не повредить здоровые ткани, особенно жизненно важных органов. Особенную актуальность задача приобрела при все более широком внедрении ФДТ в лечение внутритканевых глубокозалегающих опухолей, соседствующих с жизненно-важными органами. К примеру, при лечении рака предстательной железы, который в современном мире выходит на первое место по частоте встречаемости среди онкологических заболеваний, с помощью ФДТ, очень важно, чтобы лазерное излучение не повредило расположенную рядом уретру, являющуюся легко подверженным повреждению органом. С другой стороны, если доза лазерного излучения окажется ниже пороговой величины для ФДТ в какой-либо части опухоли, то раковые клетки останутся неповрежденными и с высокой вероятностью вызовут рецидив, что недопустимо.

Другой актуальной проблемой, которой посвящена вторая часть работы, является малоинвазивная диагностика и мониторинг сахара в крови человека [18]. Широкая распространенность, ранняя инвалидизация и высокая смертность больных определили сахарный диабет как острую медико-социальную проблему современного мира. По данным ВОЗ, диабетом в той или иной форме страдают до 10% населения (приблизительно 4,6 млн. чел. в России по состоянию на 2000г) [19], и это число продолжает расти. Больные диабетом должны регулярно (мин 2 раза в сутки) измерять уровень сахара в крови. В настоящее время для этого используется метод прокола пальца ланцетом и анализ полученной капли крови. Эта процедура болезненна, неудобна, может вызвать проникновение инфекции, вид крови у многих (особенно у детей) вызывает стрессовое состояние. Актуальность предлагаемого в работе малоинвазивного и бескровного метода получения и анализа малых капель межклеточной жидкости не вызывает сомнений.

Цель исследования:

Основной целью диссертационной работы является развитие малоинвазивных методов дозиметрии пространственного распределения плотности мощности света при лазерном облучении биологических тканей в процессе фотодинамической терапии и малоинвазивных методов дозиметрии содержания глюкозы в крови путем лазерной перфорации кожного покрова и анализа межтканевой жидкости с помощью лазерно-флуоресцентной спектроскопии.

Задачи исследования.

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

1. Разработка, расчет, моделирование и экспериментальные исследования оптоволоконных флуоресцентных многосенсорных зондов с пространственно разнесенными флуорофорами для контроля пространственной плотности мощности лазерного терапевтического излучения с длиной волны 670 нм, возбуждаемых терапевтическим излучением и обеспечивающих за счет спектральных различий флуоресценции используемых флуорофоров возможность определения парциальных вкладов каждого из них.

2. Разработка физической модели (подхода) и математического алгоритма для расчета пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения внутри биологической ткани из спектрально-флуоресцентных данных, полученных с оптоволоконных зондов.

3. Разработка многоканальной волоконно-оптической регистрирующей системы для изучения спектров излучения, выходящего из оптоволоконных зондов, и специального математического обеспечения для сбора и обработки получаемых спектральных данных. и.

4. Проведение модельных и экспериментальных исследований по определению плотности мощности лазерного излучения в тканях предстательной железы экспериментальных животных в процессе ФДТ.

5. Экспериментальное исследование взаимодействия с поверхностью кожи лазерного излучения с длиной волны 2.9 мкм, имеющего различную длительность и энергию импульсов.

6. Исследование методами лазерно-флуоресцентной спектроскопии процессов, происходящих при взаимодействии глюкозы в хроматографической бумаге, пропитанной специальными химическими реагентами.

7. Спектрально-флуоресцентное определение концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости человека, полученной при лазерной перфорации кожи.

Научная новизна исследования.

• Впервые проведены исследования, показывающие принципиальную возможность определения пространственного распределения света в биологической ткани с помощью моноволоконного датчика с 4-мя разными флуорофорами путем одновременной передачи флуоресцентного сигнала от них по одному оптическому волокну с возможностью последующей дешифровки вклада каждого из флуорофоров в общий спектр при возбуждении флуоресценции флуорофоров внутри биологической ткани изучаемым при ФДТ лазерным излучением низкой интенсивности.

• Впервые метод спектральных координат применен для расшифровки спектральных данных, получаемых с флуоресцентных зондов.

• Впервые обнаружен и изучен эффект образования капли внутритканевой жидкости на поверхности кожи человека из кратера, образованного при перфорации верхних слоев кожи лазерным импульсом.

• Методами лазерно-флуоресцентного анализа была изучена кинетика протекания реакции глюкозы, содержащейся в межклеточной жидкости, с химическими реагентами (Amplex Red, кислород, глюкозоксидаза, пероксидаза), результатом которой является сильно-флуоресцирующее вещество Резоруфин.

Практическая значимость.

Результаты, полученные в процессе проведенных исследований, позволяют существенно улучшить качество дозиметрии ФДТ, тем самым, с одной стороны, уменьшить количество возникновений рецидивов, с другой стороны, не повреждать жизненно важные органы, находящиеся в непосредственной близости от опухоли. Созданная в рамках работы установка может служить прототипом системы для клинического применения.

Разработанная методика определения концентрации глюкозы во внутритканевой жидкости может послужить основой для создания клинической диагностической малоинвазивной системы измерения сахара в крови человека.

Разработанное в процессе выполнения данной работы программное обеспечение по получению и разностороннему анализу и формализации спектральной информации нашло широкое применение в различных областях спектроскопии и вошло в стандартную комплектацию серийного спектрометра ЛЭСА-01-Биоспек [20], успешно функционирует в более чем 20-и лабораториях России, а также Канаде, Словакии, США, Южной Корее, Польше.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались на Международной конференции «Лазерные технологии в медицине XXI века» (С.-Петербург, 2001), Международном симпозиуме по биомедицинской оптике (Сан-Хосе, США, 2001), десятом Конгрессе Европейского Фотобиологического Общества (10 Congress of the European Society for Photobiology, Vienna, Austria, September 611, 2003), Международной школе для молодых ученых и студентов по оптике, лазерной физике и биофизике (Saratov fall meeting 2005, Саратов, 2005), Международной конференции Photonics in Medicine, (Торонто, Канада, 13 — 14 сентября, 2005).

Публикации.

По результатам диссертационной работы опубликовано 14 печатных работ, включая патент РФ (№ 2 258 452 от 20.08.05 с приоритетом от 03.09.03), две статьи в рецензируемых изданиях, 3 статьи в иностранных журналах, 5 публикаций в материалах российских конференций и 3 публикации в материалах зарубежных конференций.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения и 5-и глав. Содержание диссертации изложено на 125 страницах, иллюстрировано 48-ю рисунками. Список цитируемой литературы включат 107 источников. Приводятся 2 приложения общим объемом 28 страниц, иллюстрированные 12-ю рисунками.

5.4 Выводы.

Полученные в результате исследования результаты дают основания полагать, что флуоресцентный метод определения концентрации глюкозы в маленьких каплях раствора с применением Amplex Red может быть применен в биологических и медицинских диагностических системах, тем не менее, 'остаются неразрешенные до конца вопросы. Использование возбуждающего излучения с длиной волны 580−590 нм должно снизить влияние перепоглощения флуоресценции. Для уменьшения минимально допустимого размера капли целесообразно воспользоваться диагностической бумагой меньшей толщины. Кроме того, метод может быть легко модифицирован для измерения концентрации холестерола в растворах путем замены глюкозоксидазы на холестеролоксидазу при приготовлении тестовых полосок.

Заключение

.

1. Предложена модель, проведены исследования и расчеты, на основе которых разработана методика и аппаратура для определения плотности мощности излучения внутри биологической ткани методом флуоресцентной спектроскопии пространственно разнесенных флуорофоров, нанесенных на оптические волокна:

• разработаны оптимальная конструкция волоконно-оптического зонда на основе полимерного волокна с 4-мя флуорофорными фрагментами и процедура выбора флуорофоров с наиболее подходящими спектрами флуоресценции из промышленно выпускаемых веществ;

• разработана многоканальная высокочувствительная система на основе ПЗС матрицы для одновременной регистрации спектров флуоресценции с восьми волоконно-оптических зондов, включающая систему и алгоритм калибровки зондов на основе специально модифицированной интегрирующей сферы;

• разработан математический алгоритм определения пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения внутри биологической ткани, включающий методику калибровки и декомпозиции спектров с использованием метода спектральных координат.

2. Проведены модельные исследования и исследования на экспериментальных животных, подтвердившие эффективность системы для мониторинга параметров лазерного излучения в биологических тканях при фотодинамической терапии:

• проведены спектральные исследования, подтвердившие применимость выбранных флуоресцирующих веществ, и осуществлено численное моделирование эксперимента с целью оценки влияния шумов на сходимость используемого алгоритма;

• проведены исследования по мониторингу пространственного распределения плотности мощности лазерного излучения внутри ткани в условиях реальной процедуры ФДТ предстательной железы на экспериментальных животныхисследования показали адекватность используемой модели для интерпретации экспериментальных данных.

3. Определены оптимальные значения энергии импульса лазерного излучения с длиной волны 2.94 мкм для получения межтканевой жидкости из верхних слоев кожи человека, не приводящие к повреждению капиллярного русла, и исследован процесс взаимодействия такого излучения с кожей и другими биологическими тканями.

4. Методом лазерно-флуоресцентной спектроскопии исследованы кинетика реакции взаимодействия глюкозы с группой специальных реагентов на хроматографической бумаге. На основе проведенных исследований разработан алгоритм для количественного определения глюкозы с концентрациями физиологического диапазона 3−20 [мМ] в малых объемах жидкости.

5. Проведены калибровка метода для количественного определения содержания глюкозы в межклеточной жидкости кожи человека и исследования на пациентах, подтвердившие применимость метода для мониторинга монотонных изменений уровня сахара в крови человека.