Вычислительные подходы к решению фазовой проблемы кристаллографии биополимеров при низком разрешении

2. Выравнивание карт. 75.

2.1. Группа Р1. 75.

2.2. Нетривиальные пространственные группы. 76.

3. Использование асимметричной части множества структурныхфакторов. 78.

1. «Перевернутые» карты. 80.

2. Разрешенные сдвиги начала координат. 81.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ. 84.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

85.

Изучение пространственной структуры биологических макромолекул и их комплексов является важным направлением современной биологии и создает предпосылки для детального понимания механизмов их функционирования. Метод рентгеноструктурного анализа монокристаллов является на сегодняшний день единственным экспериментальным методом, позволяющим получать детальное описание сложных макромолекулярных комплексов при атомном разрешении. Однако спецификой рентгеновского эксперимента является то, что он позволяет получить лишь часть информации (модули структурных факторов), необходимой для восстановления исследуемой структуры. Получение недостающей части информации (значений фаз структурных факторов) представляет собой центральную методологическую проблему рентгеноструктурного анализа. Основные подходы к решению фазовой проблемы, используемые в макромолекулярной кристаллографии, опираются либо на получение химическими методами изоморфных модификаций исследуемого объекта и проведение дополнительных рентгеновских экспериментов, либо на присутствие в объекте аномально рассеивающих атомов, либо на наличие известной атомной структуры гомологичного объекта. Попытки применения этих подходов встречаются с существенными сложностями при работе с макромолекулярными комплексами. В то же время разработаны математические методы, позволяющие решать фазовую проблему для низкомолекулярных соединений, основываясь лишь на данных рентгеновского эксперимента с не модифицированным (нативным) объектом. В связи с этим, в последнее десятилетие одной из актуальных задач макромолекулярной кристаллографии является разработка аналогичных методов решения фазовой проблемы, применимых к макромолекулярным объектам. Такие методы называются обычно прямыми или ab-initio методами, чтобы подчеркнуть, что они не требуют наличия ни изоморфных производных, ни известных гомологичных объектов.

Задачей данного исследования являлась разработка процедуры прямого решения фазовой проблемы макромолекулярной кристаллографии при низком разрешении. Решение фазовой проблемы при низком разрешении подразумевает определение значений фаз для нескольких десятков коэффициентов Фурье (структурных факторов) в разложении в ряд Фурье искомой функции распределения электронной плотности в исследуемом объекте. Наличие такой информации делает возможным расчет соответствующей части ряда Фурье и позволяет получить сведения о локализации объекта в элементарной ячейке кристалла и его внешних очертаниях, что является стартовой точкой для процедур расширения и уточнения набора фаз.

В программу работы входило: исследование степени неоднозначности решения фазовой проблемы при низком разрешении и разработка примененных для этого исследования процедур кластерного анализаразработка процедуры Монте-Карловского типа для решения фазовой проблемы при низком разрешенииразработка и создание соответствующего программного обеспечениятестирование метода с использованием объектов с известной структуройприменение разработанных методов к определению структуры рибосомной частицы Т50Б из Ткегтт (ИегторкИт при разрешении порядка 40А.

Математическая суть фазовой проблемы состоит в том, что стандартный эксперимент по дифракции рентгеновских лучей (либо нейтронов или электронов) на кристаллических образцах позволяет определить лишь модули | Т^у | комплексных коэффициентов (структурных факторов) в разложении в ряд Фурье функции распределения электронной плотности в исследуемом кристалле: Х^шехР[^ш]ехР[~ 2 т (Их + ку + Щ. (1) ш.

При этом значения фаз | (р^ | остаются неизвестными, делая невозможным прямой расчет функции распределения электронной плотности. Здесь () — относительные координаты точки в базисе, образованном периодами кристалла, а () — целочисленные индексы. Теоретически суммирование в (1) должно быть распространено на все целочисленные индексы, однако на практике используется конечный набор структурных факторов. Размеры использованного при расчете (1) набора структурных факторов принято характеризовать разрешением. При этом под разрешением, соответствующим отдельному структурному фактору, понимается длина с1 «плоской волны», отвечающей соответствующей гармонике Фурье ехр[- 2л1(Ьх + ку + /я)], а под разрешением набора структурных факторов — минимальное из разрешений для структурных факторов, входящих в набор.

Дополнительное предположение о том, что не является произвольной функцией, а может быть представлена как сумма вкладов отдельных атомов, позволяет получить соотношения (алгебраические и вероятностные) между значениями модулей и фаз структурных факторов. Эти соотношения лежат в основе методов расчета значений фаз для низкомолекулярных соединений. В последние годы эти методы были существенно развиты и позволяют в настоящее время при благоприятных обстоятельствах определять структуры небольших белков, содержащих до 1000 атомов в независимой части ячейки. Однако применимость этих методов к макромолекулярным объектам существенно ограничена размерами исследуемого объекта и необходимостью иметь в наличии набор экспериментальных данных очень высокого разрешения (лучше 1.0 А, что для белков является скорее исключением, чем правилом).

Основными подходами к решению фазовой проблемы в кристаллографии белка является использование изоморфного замещения, аномального рассеяния или известной атомной модели гомологичного белка. В первом из подходов ключом к решению фазовой проблемы являются различия в модулях структурных факторов, отвечающих исходному объекту и полученному путем его химической модификации изоморфному производному. Во втором подходе оказываются существенными разности в величинах модулей специальных пар структурных факторов, которые возникают при наличии в исследуемом объекте аномальных рассеивателей. Оба эти эффекта убывают по мере роста размеров исследуемых объектов, поэтому их применение начинает встречать существенные сложности при попытках определения структуры больших макромолекулярных комплексов (например, таких, как рибосома и составляющие ее субъединицы). Поэтому существенное значение приобретает создание для макромолекулярной кристаллографии ab-initio методов решения фазовой проблемы. К этой группе относятся методы, использующие для расчета фаз лишь общие сведения об исследуемых объектах и ограничивающиеся экспериментальными данными, полученными в эксперименте с нативным объектом.

Имеются две стратегии решения фазовой проблемы. Первая из них восходит к области низкомолекулярных соединений. При таком подходе сразу пытаются использовать данные как можно более высокого разрешения. К белкам такой подход начал применяться не так давно. Этот подход содержит ряд ограничений, которые существенно затрудняют его применение для очень крупных структур. Например, сразу требуются данные очень высокого разрешения, что далеко не всегда можно получить в эксперименте. Кроме того, такие методы оказались чувствительны к наличию в белке атомов металлов, и результаты не всегда стабильны.

В излагаемом подходе используется другая стратегия, традиционная именно для белковой кристаллографии — сначала решить фазовую проблему для низкого разрешения, а потом постепенно расширять набор фаз. Под термином «низкое разрешение» здесь понимается такое разрешение, когда в рассмотрение включены 50−100 малоугловых рефлексов. При таком подходе сама величина разрешения зависит от размеров элементарной ячейки. Для белка обычных размеров (с длиной ребер ячейки порядка 70А) это разрешение порядка 10А. Для использованного при тестировании методики комплекса т-РНК-синтетазы с тРНК (параметры ячейки порядка 350А) — это разрешение 40А. Для кристаллов рибосомной частицы Т50Б (длины ребер ячейки порядка 500А) — это разрешение порядка 60А. Карты электронной плотности такого разрешения позволяют определить внешние очертания молекулы и ее местоположение в элементарной ячейке (в частности, это может оказаться полезным и при использовании метода молекулярного замещения при решении проблемы трансляции), а соответствующие фазы структурных факторов являются стартовой точкой для дальнейшей процедуры расширения набора фаз.

Работа по развитию изложенных в диссертации методов выполнялась в сотрудничестве с Лабораторией биологических структур Института генетики и молекулярной и клеточной биологии (Страсбург, Франция) и Лабораторией кристаллографии и моделирования минералов и биологических структур Университета Нанси (Франция). Работы по применению разработанной методики к определению структуры рибосомной частицы Т50Б велись с использованием экспериментальных данных, полученных в группе А. УопаШ (Институт им. Макса Планка, Гамбург, Германия) и в тесном сотрудничестве с А. УопаШ и ГА^ап.

Работа была поддержана грантами РФФИ 94−04−12 844 и 97−04−48 319.

I. ФАЗОВАЯ ПРОБЛЕМА ПРИ НИЗКОМ РАЗРЕШЕНИИ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

1. Продемонстрировано, что применяемые в кристаллографии методы контроля точности определения фаз при низком разрешении имеют статистический характер: наилучшие значения контрольных критериев не соответствуют в точности наилучшим наборам фаз, однако имеется корреляция между значениями рассмотренных критериев качества и действительной точностью значений фаз.

2. Разработана и реализована компьютерная процедура Монте-Карловского типа для просмотра всех потенциально возможных решений фазовой проблемы при низком разрешении и их фильтрации в соответствии с выбранными критериями отбора.

3. Предложена базирующаяся на методах кластерного анализа процедура выделения из отфильтрованных на предыдущем этапе работы вариантов небольшого числа кластеров близких решений, дающих альтернативные решения фазовой проблемы.

4. Предложены и реализованы методы сравнительного тестирования различных вариантов решения фазовой проблемы, основанные на максимизации обобщенного правдоподобия и использовании топологических характеристик изучаемого объекта.

5. Проведено тестирование разработанной методики на данных нейтронного рассеяния для комплекса тРНК синтетазы с тРНК.

6. Разработанная методика применена к определению структуры рибосомной частицы Т508 из Ткегтия IИегторкИш при разрешении 40А.