Последнее десятилетие характеризуется бурным развитием тканевой инженерии, нового направления, возникшего на стыке физики, химии и биологии. В рамках данного направления ведутся работы по созданию на основе природных и синтетических полимеров и клеток разных типов тканевых аналогов, призванных скомпенсировать утраченные функции отдельных органов или даже восстановить орган искусственно. Настоящая работа посвящена разработке новых биоматериалов типа «искусственная кожа», предназначенных для закрытия ожогов, трофических и иссеченных поражений кожного покрова, а также обеспечения эффективного переноса клеточных пластов на раневую поверхность для стимулирования регенерации глубоких и труднозаживающих ран. Данные материалы представляют собой пленку, сформированную на основе синтетических и природных полимеров, защищающую раневую поверхность от проникновения бактерий, поддерживающую оптимальный парои газообмен и физиологическую влажность раны, а также создающую условия для обеспечения миграции клеток.
Несмотря на то, что в последние годы в мире появилось множество раневых покрытий, существенно ускоривших процесс заживления ожогов II — III, А степени, для успешного заживления более серьезных ран (глубоких и обширных ожогов, трофических и радиационных язв) требуется применение клеточных культур. Следовательно, необходима разработка подложек, обеспечивающих атравматичный перенос клеточных пластов на рану. Т.о., в настоящее время наиболее актуальным направлением в области создания эффективных аппликаций на раны и ожоги является разработка композитных полимерных покрытий, обеспечивающих атравматичный перенос клеток и создающих оптимальные условия для заживления глубоких и обширных поражений кожи.
Существующие на сегодняшний день покрытия не пригодны для решения данной задачи. Это связано с тем, что существующие в настоящее время раневые покрытия созданы на основе либо синтетических полимеров, либо полимеров, полученных из биологических источников. Однако, синтетические полимеры, являясь хорошим механическим каркасом, не обладают необходимой биологической активностью для обеспечения адгезии клеток. Природные полимеры, обладая хорошей биологической активностью, не имеют достаточной механической прочности и отличаются высокой скоростью биодеградации. Т.о., для обеспечения адгезии клеток и оптимальных условий для миграции клеток и регенерации кожи необходимым становится создание композитных материалов, объединяющих достоинства природных и синтетических полимеров. Примером таких материалов стали появившиеся в последнее время композиционные материалы типа «сэндвич», в которых на полимерную синтетическую матрицу методом пошаговой модификации нанесен природный полимер (Магу С et al., 1998, U. Klinge et al., 2003). Эти материалы дорогостоящи, сложны в производстве, и, кроме того, входящий в их состав природный полимер при химическом связывании частично утрачивает свои биологические свойства.
Практически полное отсутствие композитных материалов на основе смесей синтетических и природных полимеров вызвано, прежде всего, объективными трудностями, возникающими при формировании композитных материалов, вследствие того, что синтетические полимеры обычно формируются из растворов в органических растворителях или из высокотемпературных расплавов, что абсолютно исключает смешивание их с природными компонентами. Кроме того, следует отметить недостаток фундаментальных исследований механизмов взаимодействия между синтетическими и природными полимерами, а также отсутствие данных о факторах, определяющих свойства материалов на микро и макроуровне и их взаимодействии с клетками. Это вызвано тем, что исследования в области разработки биоматериалов носят в основном прикладной характер и, возможно, связано с тем, что при решении прикладных задач разработки новых биоматериалов, разработчики не интересуются фундаментальными исследованиями процессов взаимодействия компонентов на микро и макроуровне.
Мы применили новый подход к созданию биосинтетических композиционных материалов, заключающийся в использовании водных дисперсий синтетического фтор-каучука, позволяющих вводить в состав полимерных пленочных материалов водные растворы биологически активных полимеров без нарушения их структурной и функциональной целостности.
Основу разработанных нами субстратов составляет сополимер винилиденфторида с гексафторпропиленом, химически инертный, обладающий высокой химической стабильностью и хорошими механическими характеристиками. При работе с его латекса-ми нет необходимости пользоваться токсичными растворителями. Но при этом сформированные на основе фторлатекса субстраты практически не набухают, имеют малую паропроницаемость, гидрофобны, не поддерживают адгезию и пролиферацию клеток млекопитающих, что является важным требованием, предъявляемым к современным биоматериалам.
Для гидрофилизации субстрата, т.к. именно с этой характеристикой связаны малая паропроницаемость и неадгезивность фторлатекса, в него были введены полисахариды, т.к. именно эти молекулы являются компонентом, обеспечивающим взаимодействие с водой и гидратационное окружение клеток. Было решено изучить взаимодействие с латексом анионных и нейтральных полисахаридов. Исследование взаимодействия фторлатекса с положительно заряженными полисахаридами не проводилось, т.к. добавление к отрицательно заряженному латексу положительно заряженного полисахарида вызывало агрегацию латексно-полисахаридной дисперсии. Преимуществом полисаха-ридных материалов по сравнению с белковыми полимерами животного происхождения (коллагеном, желатином), является их доступность и неиммуногенность. Кроме того, известно что альгинаты оказывают заметное иммуномодулирующие действие, стимулируют фагоцитоз, восстанавливают активность клеточных рецепторов (В.В.М'ясоедов, 2001). Входящая в состав альгинатов гулуроновая кислота является составной частью гликанов, которые играют особую роль во многих процессах жизнедеятельности клеток (J.Scott, 1989). Метилцеллюлоза служит субстратом для переноса клеток при травмах головного мозга и для культивирования различных типов клеток (M.Tate et al., 2001; de Silva, 2005; R.C. Ganassin 2000) и является ускорителем мускульной регенерации в периферийных нервных каналах (Мясников А. Д и др, 2003).
Цель данной работы заключалась в изучении механизмов взаимодействия полисахаридов с фторполимерным латексом на молекулярном и надмолекулярном уровне и исследовании связи структуры с физико-химическими характеристиками и биосовместимостью материала для разработки биоматериалов типа «искусственная кожа», способных кроме защитных функций обеспечить адгезию клеток и атравматичный перенос клеточных пластов на рану.
В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:
1. Исследовать взаимодействие фторсодержащего латекса с альгинатом натрия и метил целлюлозой в растворах и в составе композитных пленочных материалов;
2. Изучить процесс структурообразования композитных материалов при разных концентрациях альгината натрия и метилцеллюлозы и различных условиях сушки;
3.Изучить влияние на эластические и прочностные свойства и характеристики поверхности композитных пленочных материалов процентного содержания альгината натрия и метилцеллюлозы;
4.0пределить зависимость сорбционной способности, паропроницаемости и устойчивости к растворению композитных пленочных материалов от процентного содержания альгината натрия и метилцеллюлозы;
5. Выявить влияние процентного содержания альгината натрия и метилцеллюлозы в составе композитных материалов на адгезию и рост субстратзависимых клеток млекопитающих.
6. Определить оптимальные концентрации полисахаридов и режимы формирования, при которых биоматериалы удовлетворяют основным физико-химическим требованиям, предъявляемым к раневым покрытиям, и позволяют проводить культивирование субстратзависимых клеток на их поверхности.
Основная трудность формирования пленок заключалась в чрезвычайной неустойчивости латексно-полисахаридной дисперсии. В процессе нашей работы было проведено исследование взаимодействия латекса с полисахаридами в растворах, в результате которых были построены фазовые диаграммы, на основании которых определены режимы агрегативной устойчивости системы. Найдены режимы сушки, при которых стало возможно формирование однородных цельных пленок с любым соотношением концентраций компонентов.
На основании проведенных исследований методами ИКи рентгеновской спектроскопии, измерений механических характеристик образцов и данных об агрегативной устойчивости системы сделаны выводы о механизмах взаимодействия латекса с полисахаридами, предложена схема процесса формирования структуры полимерных пленок и механизмы влияния полисахаридных добавок на физико-химические характеристики биоматериалов. Для выявления связи микроструктуры с биоактивностью материала были проведены исследования адгезионных свойств поверхности полимерных пленок с различным содержанием полисахаридов. На основании вычисленных значений свободной энергии поверхности и данных по исследованию взаимодействия субстратзависимых клеток человека с поверхностью материала определены оптимальные концентрации полисахаридов, обеспечивающие адгезию и распластывание клеток на поверхности композитных пленок.
Исследование взаимодействия разработанных материалов с водным окружением позволило определить диапазоны концентрации полисахаридов, при которых композиционные материалы по своей сорбционной способности и паропроницаемости не уступают современным раневым покрытиям, например Omiderm и Op-Site.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственного экспериментального материала, выводов и библиографического списка использованной литературы.
106 Выводы.
1. Определены диапазоны агрегативной устойчивости фторполимерной дисперсии в присутствии анионных и неионогенных полисахаридов. Разработана техника приготовления однородных латексно-полисахаридных пленок с различным соотношением компонентов.
2. Установлены механизмы взаимодействия фторполимерного латекса с альгинатом натрия и метилцеллюлозой в растворах и в составе композитных пленочных материалов.
3. Показано, что модификация латекса альгинатом натрия препятствует формированию кристаллической структуры композита, а введение метилцеллюлозы в концентрациях, превышающих адсорбционную насыщенность глобул латекса, способствует кристаллизации композита.
4. Найдена зависимость сорбционной способности и паропроницаемости композитных материалов от плотности упаковки и надмолекулярной структуры субстратов.
5. Установлено, что модификация фторлатекса альгинатом натрия и метилцеллюлозой повышает свободную энергию поверхности субстратов, что способствует адгезии и распластыванию субстратзависимых клеток.
6. Определены оптимальные концентрации полисахаридов и режимы формирования, при которых биоматериалы удовлетворяют основным физико-химическим требованиям, предъявляемым к раневым покрытиям, и позволяют проводить культивирование субстратзависимых клеток на их поверхности.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Г. А. Давыдова, И. И. Селезнева, Б. К. Гаврилюк Изучение влияния жесткости облучения на свойства фторполимерной матрицы, модифицированной полианионными биологически активными веществами. Биофизика т.49, № 5, сент.- окт. 2004, стр.809−814.
2. Г. А. Давыдова, И. И. Селезнева, Б. К. Гаврилюк. Изучение влияния полианионных биологически активных веществ на свойства фторполимерной биосинтетической матрицы. Вопросы биологической, медицинской и фармакологической химии. Москва, 2004, № 2, стр 11 -14.
3. Давыдова Г. А., Селезнева И. И., Рочев Ю. А., Гаврилюк Б. К. Разработка композитных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии. Сборник тезисов второго съезда биофизиков России, Москва, 1999, т.2, с. 666.
4. Давыдова Г. А., Рочев Ю. А., Гаврилюк Б. К., Разработка полимерных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии, тезисы IV Городской научной конференции молодых ученых, Пущино, 1999. с. 44.
5. Давыдова Г. А., Халкузиева Р. С., Гаврилюк Б. К. Полимерные пленочные биоматериалы для целей тканевой инженерии. Тезисы конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» Пущино 2001, с. 50.
6. Давыдова Г. А., Селезнева И. И., Гаврилюк Б. К. Разработка полимерных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии. Тезисы докладов IV Международной конференции «Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов» Москва 2001, с. 119.
7. Давыдова Г. А., Селезнева И. И., Гаврилюк Б. К. Модификация полимерных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии. Тезисы конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям» Пущино 2002, с. 65.
8. Г. А. Давыдова, Б. К. Гаврилюк, Разработка полимерных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии Тезисы конференции «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии. Теория и практика клеточных биотехнологий» Самара, 2004, с. 124.
9. Г. А. Давыдова, А. П. Жамбалова, Б. К. Гаврилюк, Создание матричных систем для решения задач тканевой инженерии. Устный доклад. Тезисы I украинской конференции «Проблеми бюлопчно1 i медично1 ф1зики», Харьков, 20−22 сентября 2004 г., с. 145.
10. А. П. Жамбалова, Г. А. Давыдова, Создание матричных систем для решения задач тканевой инженерии, тезисы XVII зимней молодежной научной школы, «Перспективные направления физико-химической биологии и микробиологии», Москва, 2005, с.
11. А. П. Жамбалова, Г. А. Давыдова, Разработка новых биоматериалов для решения задач тканевой инженерии, тезисы 9-ой Международной Путинской конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века», Пущино, 2005, с. 114.
12. А. П. Жамбалова, Г. А. Давыдова, Б. К. Гаврилюк, Изучение влияния добавок полисахаридов на физико-химические характеристики и биосовместимость полимерных пленок, тезисы второй международной конференции «Наука — бизнес — образование», Пущино, 2005, с. 175.
Заключение
.
Была разработана технология получения биоматериалов типа «искусственная кожа» на базе фторполимеров и природных полисахаридов, которая исключает использование органических растворителей и высоких температур и позволяет получать композитные материалы с различным соотношением компонентов.
На основании проведенного исследования агрегативной устойчивости в водных дисперсиях и данных ИК-спектроскопии была предложена схема взаимодействия ионных и неионогенных полисахаридов с латексом и формирования различных уровней устойчивости латексной дисперсии, модифицированной полисахаридами. Показано, что общая природа полисахаридов делает схожими взаимодействие в латексно-полисахаридной дисперсии, несмотря на различие механизмов взаимодействия полисахаридов различной электростатической природы с латексными глобулами.
На основании данных рентгеноструктурного анализа. и ИК-спектроскопии установлены механизмы взаимодействия латекса и полисахаридов и выявлено влияние полисахаридов на процессы структурообразования композитных материалов. Показано, что добавление неионогенной метилцеллюлозы приводит к организации полимеров в стабилизированные гидрофобными силами кристаллические структуры, а введение анионного альгината натрия приводит к организации полимеров в стабилизированные водородными связями аморфные структуры.
Выявлена связь между структурой композитных материалов и физико-химическими характеристиками, определяющими потенциальную возможность использования данных биоматериалов в качестве раневых покрытий. Показано, что увеличение эластичности композитов с ростом концентрации метилцеллюлозы и снижение ее при введении анионного альгината натрия в полимерную матрицу связаны с изменением кристаллической структуры латекса. Оба полисахарида оказывают одинаковое действие на прочность композитных пленок — ведут к повышению способности материала сопротивляться разрушению за счет усиления физических взаимодействий между макромолекулами. Установлено увеличение сорбционной способности, паропроницаемости и адгезивности композитов при повышении концентрации полисахаридов, причиной которых является разрыхление структуры, вызванное появлением в пространстве между глобулами свободных молекул полисахаридов. При концентрациях полисахарида в полимерной пленке 10−20%, физико-химические характеристики композитов соответствуют параметрам, оптимальным для раневых покрытий. При этом установлено, что стерилизация материала с использованием рентгеновского и ультрафиолетового облучения не изменяет внутреннюю структуру и свойства поверхности образцов. Т.о. впервые показана возможность управления такими свойствами биоматериала как паропронициемость, сорбционная способность, эластичность, адгезивность при изменении концентрации и природы полисахарида, что позволяет получать материалы с заданными характеристиками.
На основании измерения краевых углов смачивания и проведенных расчетов установлено увеличение свободной энергии поверхности при увеличении процентного содержания полисахаридов в субстратах. Рассчитанная свободная энергия поверхности фторлатекса с 20% содержанием полисахарида (57,9−59,7мДж/м2) соответствует энергии л поверхности специально обработанного для роста клеток полистирола (ysv =58,6 мДж/м). Установлено, что композитные материалы, содержащие более 5% полисахарида, в течение двух суток адгезивны для клеток. Найдено, что при 20% содержании альгината натрия и метилцеллюлозы в разработанных нами материалах их выход в среду составляет величину порядка 10*3 г/мл. Показано, что данные концентрации полисахаридов в среде могут только стимулировать адгезию, но не влияют на пролиферативную активность клеток. Гидрофобизация поверхности, происходящая в результате выхода несвязанных с латексом полисахаридов в среду, определяет изменение характеристик материала: обеспечив эффективный перенос клеток, материал, теряющий свои адгезионные свойства, атравматично отделяется от раневой поверхности.
Т.о. применение широкого спектра физико-химических методов исследования материалов на различных уровнях организации позволило установить механизмы взаимодействия полисахаридов разной электростатической природы с синтетическим латексом. Выявлена связь между структурой композитных материалов и физико-химическими характеристиками, определяющими потенциальную возможность использования данных биоматериалов в качестве раневых покрытий и субстратов, обеспечивающих перенос клеток на раневую поверхность. Впервые показана возможность управления такими свойствами биоматериала как паропронициемость, сорбционная способность, эластичность, смачиваемость, адгезивность для клеток при изменении концентрации и природы полисахарида, что позволяет получать материалы с заданными характеристиками.
Главным практическим результатом проведенных исследований явилась разработка на основе латекса СКФ-26 и альгината натрия /метилцеллюлозы новых биоматериалов типа «искусственная кожа». Данные материалы по своим физико-химическим характеристикам не уступают современным раневым покрытиям, а по способности поддерживать адгезию клеток существенно их превосходят.
