Совершенствование тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦР

Актуальность проблемы.

Бруцеллез продолжает оставаться серьезной экономической и социальной проблемой как в здравоохранении, так и в сельском хозяйстве [Таран И.Ф. с соавт., 1996; Григорьева Г. И. с соавт., 1998; Калиновский А. И. с соавт., 1998; Шахани-на И.Л. с соавт., 1999; Онищенко Г. Г. с соавт., 1999]. Несмотря на сокращение количества неблагополучных пунктов по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота, уровень заболеваемости, связанный с профессиональным фактором в общественном секторе, остается высоким (до 90%). Только в 2000 г. в Российской Федерации зарегистрировано 423 впервые выявленных случая заболевания людей бруцеллезом, что на 20,8% выше аналогичного показателя 1999 г. Этому способствует несвоевременное оздоровление бруцеллезных хозяйств, позднее выявление и изоляция больных животных, неудовлетворительные условия труда в хозяйствах и на перерабатывающих предприятиях. Кроме того, отсутствие надлежащего сани-тарно-ветёрйнарного контроля за реализацией среди населения продукции животноводства и животноводческого сырья может привести к попаданию в торговую сеть зараженных возбудителем бруцеллеза продуктов, среди которых молоко и молочные продукты как факторы передачи инфекции имеют большое значение.

Важное место в системе эпидемиологического надзора за бруцеллезом отводится качественной и своевременной диагностике этого заболевания. Для лабораторной диагностики бруцеллеза у людей и животных используют бактериологический анализ, достаточно трудоемкий и длительный метод. Применяемые иммунологические реакции также имеют ряд существенных недостатков: невысокую чувствительность (1×105−106 м.к./мл), возможность перекрестных реакций с Yersinia 6 enterocolitica, Francisella tularensis, Vibrio choleras, кроме того, эффективность методов во многом зависит от качества иммуноглобулинов и диагностикумов [Соколова Е.Е., 1986; Загоскина Т. Ю. с соавт., 1998; Кулаков Ю. К. с соавт., 1997].

В последнее десятилетие для диагностики бруцеллеза активно разрабатывается полимеразная цепная реакция (ПЦР) [Fekete A. et al, 1990; Baily G.G. et al, 1992; Bricker B.J. et al, 1994; LealKlevezas D.S. et al, 1995; Romero C. et al, 1995; Куличенко A.H., 1995; Rijpens N.P. et al, 1996; Гаранина С. Б., 1996; Шумилов K.B. с соавт., 1996, 1998]. К достоинствам этой реакции относится ее высокая чувствительность и специфичность, быстрота получения результата, возможность выявления низких концентраций возбудителя инфекции в различном материале. ПЦР незаменима в изучении хронических инфекций, обусловленных персистирующими или труднокультивируемыми формами микроорганизмов, в том числе и бруцелла-ми. ПЦР соответствует всем основным требованиям, предъявляемым к современным методам лабораторной диагностики, и перспективна для широкого практического использования.

Однако до настоящего времени место ПЦР-анализа в общей схеме исследований при диагностике бруцеллеза до конца не определено. Это, прежде всего, связано с отсутствием стандартных препаратов, разрешенных к применению Минздравом России. Как показали наши исследования, используемые рядом отечественных авторов тест-системы, с разработанными ранее праймерами Brul-Bru2 при работе с биологическим материалом не обеспечивают 100% специфичность и воспроизводимость результатов, что является обязательным для широкого практического внедрения препарата. Несмотря на отдельные публикации по применению ПЦР-анализа для диагностики бруцеллеза у людей [Шестопалов М.Ю. с соавт.,.

1997; Шестопалов М. Ю., 1999; Дентовская С. В., 2000], окончательно не определена диагностическая значимость этого метода при обследовании контингентов риска по бруцеллезу. До сих пор не решен вопрос об эффективности использования ПЦР-анализа при исследовании на бруцеллез продуктов питания. С учетом изложенного очевидна актуальность создания и внедрения в практику ПЦР-тест-систем для детекции ДНК бруцелл, разработка оптимальных схем ПЦР-анализа.

Цель работы — разработка специфичных праймеров и совершенствование ПЦР-тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза, оценка ее диагностической эффективности при генной диагностике бруцеллеза у людей и детекции бруцелл в молоке и молочных продуктах.

Основные задачи исследования.

1. Подобрать праймеры на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего синтез белка молекулярной массой 31 кДа внешней мембраны бруцелл, и определить основные параметры ПЦР, обеспечивающие высокую чувствительность и специфичность реакции.

2. Разработать на основе оптимальных праймеров диагностическую тест-систему, позволяющую выявлять все виды бруцелл в биологическом материале, объектах внешней среды и молочных продуктах.

3. Изучить диагностическую информативность разработанной тест-системы при работе с материалом, полученным от зараженных животных/Сравнить эффективность бактериологического метода и ПЦР при исследовании материала, искусственно инфицированного возбудителем бруцеллеза, а также органов, тканей и биологических жидкостей морских свинок, зараженных различными видами бруцелл. 8.

4. Определить возможность использования ГЩР-анализа в комплексе с традиционными методами лабораторной диагностики для обследования контингентов риска по бруцеллезу.

5. Сравнить эффективность различных способов выделения и очистки ДНК, основанных на применении лизирующих агентов, фенольной экстракции, нуклео-сорбции для подготовки проб при ПЦР-анализе молока и молочных продуктов. Оценить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы при исследовании молочных продуктов, искусственно инфицированных возбудителем бруцеллеза.

Научная новизна работы.

Разработана тест-система с праймерами ВгиЗ 1-Вги32 и Bru3-Bru4 на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего синтез белка молекулярной массой 31 кДа внешней мембраны бруцелл, для исследования биологического материала и объектов внешней среды на наличие возбудителя бруцеллеза методом двухстадийной («гнездовой») ЯЦР. Доказана ее высокая спецшриность и чувствительность при работе с чистыми культурами возбудителя бруцеллеза (1×102 — 1×103 м.к./мл) и объектами, искусственно инфицированными бруцеллами (1×103 м.к./мл).

Показано преимущество ПЦР-анализа с использованием разработанной тест-системы при исследовании органов, тканей и биологических жидкостей морских свинок, экспериментально зараженных бруцеллезом, и материала, искусственно контаминированного бруцеллами, по сравнению с бактериологическим методом.

Продемонстрирована эффективность использования ПЦР-анализа в комплексе с серологическими тестами для обследования контингентов риска по бруцеллезу (животноводов неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота 9 хозяйств и работников мясоперерабатывающего комбината).

Определены наиболее эффективные способы подготовки проб, обеспечивающие высокую степень экстракции и очистки ДНК при исследовании молочных продуктов методом ПНР.

Впервые показана возможность выявления ДНК возбудителя бруцеллеза методом ПЦР с предложенной тест-системой в молочных продуктах (сливках, сыре, масле) с чувствительностью lxlO3 — lxlO4 м.к./мл (г).

Практическая значимость работы.

На диагностический набор «Тест-система для выявления Brucella spp. методом полимеразной цепной реакции» разработана нормативно-техническая документация (экспериментально производственный регламент, фармакопейная статья, фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению).

По программе, утвержденной комитетом МИБП, проведены Государственные приемочные испытания (протокол № 2 от 30.05.96 г.). Результаты Государственных испытаний одобрены ученым советом ГИСК им. JI.A. Тарасевича (протокол № 7 от 16.05.00 г.).

Получено разрешение комитета МИБП на внедрение препарата в практику здравоохранения (протокол №.7 от 05.07.00 г.).

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах повышения квалификации специалистов по ПЦР-диагностике при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» .

Основные положения, выносимые на защиту.

1. ПЦР-тест-система на основе праймеров Bru31-Bru32 и Bru3-Bru4 обеспечивает специфичную детекцию всех видов бруцелл с чувствительностью lxlO2.

10 lxlO3 m.k./mji при анализе чистых культур и 1×103 м.к./мл при исследовании биологического материала, объектов внешней среды и молочных продуктов, искусственно контаминированных Brucella spp.

2. По эффективности, чувствительности и быстроте выполнения ПЦР-анализ с использованием разработанной тест-системы превосходит бактериологический метод как при исследовании объектов, искусственно контаминированных возбудителем бруцеллеза, так и биологического материала от экспериментально зараженных животных.

3. При обследовании контингентов риска по бруцеллезу (животноводов хозяйств неблагополучных по бруцеллезу КРС и работников мясокомбината) ПЦР-анализ обладает большей диагностической точностью по сравнению с традиционными серологическими методами лабораторной диагностики.

4. Использование разработанной схемы ПНР-анализа позволяет выявлять возбудитель бруцеллеза в молоке и молочных продуктах с чувствительностью lxlO3 — lxlO4 м.к./мл (г).

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997) — П Всероссийской конференции «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» (Москва, 1998) — II Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998) — Международной научно-практической конференции «Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территорий стран СНГ» (Саратов, 1998) — VI Республиканской научно-практической конференции «Зоонозы: актуальные вопросы в.

11 клинике и эксперименте" (Махачкала, 2000) — I Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000). Публикации.

Основное содержание работы отражено в 12 научных публикациях.

Структура и объем диссертации

.

Работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 181 цитируемую работу. Общий объем диссертации 128 страниц. Текст иллюстрирован 12 таблицами и 10 рисунками.

ВЫВОДЫ.

1. Подобраны праймеры ВгиЗ 1-ВгиЗ 2 на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего синтез бежа внешней мембраны бруцелл молекулярной массой 31 кДа. Для данных праймеров оптимизированы параметры ПЦР, обеспечивающие высокую специфичность и чувствительность реакции при детекции ДНК возбудителя бруцеллёза.

2. Разработана тест-система для выявления возбудителя бруцеллёза методом двустадийной ПЦР с праймерами ВгиЗ 1-ВгиЗ 2 и Bru3-Bru4, позволяющая детектировать все виды рода Brucella с чувствительностью 1×10 -1×10 м.к./мл при анализе чистых культур и 1×103 — 1×104м.к./мл при исследовании биологического материала, молочных продуктов и объектов внешней среды, инфицированных возбудителем бруцеллёза. Предложенная ПЦР-тест-система сохраняет высокую специфичность и чувствительность в течение 6 месяцев хранения при минус 20 °C и обеспечивает 100% воспроизводимость результатов.

3. В сравнительных экспериментах на модели бруцеллёзной инфекции у морских свинок доказано преимущество ПЦР-анализа по сравнению с бактериологическим методом. При этом диагностическая чувствительность ПЦР-анализа составила 100%, время выполнения исследования — 6 часов, соответствующие показатели бактериологического метода — 53% и 3−7 суток.

4. Показано, что наибольшая диагностическая чувствительность ПЦР-анализа при определении инфицирования организма лабораторных животных возбудителем бруцеллёза достигается при исследовании экстрактов селезёнки (66,6%), и паховых лимфатических узлов (60%).

5. Продемонстрирована высокая эффективность ПЦР-анализа при обследовании контингентов риска по бруцеллёзу. Установлено, что при исследовании крови генодиагностический метод превосходит по чувствительности РНГА в 2,2 и РА в 2,5 раза. Достоверность результатов, полученных с помощью ПЦР, подтверждена данными эпидемиологического анамнеза.

6. Предложена модификация метода подготовки проб, основанного на лизисе гуанидинтиоцианатом с нуклеосорбцией на силикагеле, обеспечивающая высокую чувствительность ПЦР-анализа при исследовании жиросодержащих молочных продуктов. Применение ацетона на заключительной стадии обработки образца, позволяет выявлять ДНК бруцелл в молоке, сыре, сливках с чувствительностью lxlO3 м.к./мл (г), в масле — lxlO4 м.к./г. Для выделения и очистки ДНК при ПЦР-анализе молочных продуктов установлена также эффективность метода нуклеосорбции в присутствии Nal после обработки образца ионным детергентом (SDS).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Бруцеллез до настоящего времени остается распространенной инфекцией с высокими показателями заболеваемости людей в контингентах риска и наносящий серьезный экономический ущерб животноводству страны. Для обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия, своевременного проведения противо-бруцеллезных мероприятий, выявления и эффективного лечения больных необходима эффективная диагностика этого заболевания. Одним из наиболее перспективных направлений в решении данной проблемы является разработка и внедрение принципиально новых молекулярно-генетических методов, к которым относится полимеразная цепная реакция. Для диагностики бруцеллеза ПЦР разрабатывалась многими отечественными и зарубежными исследователями [Fekete A. et al., 1990; Baily G.G. et al., 1992; Bricker B.J. et al., 1994; LealKlevezas D.S. et al., 1995; Romero C. et al., 1995; Куличенко A.H., 1995; Rijpens N.P. et al, 1996; Гаранина С. Б., 1996; Шумилов K.B. с соавт., 1996, 1998]. Однако до наших исследований в Российской Федерации отсутствовали зарегистрированные и разрешенные к применению Минздравом России ПЦР-тест-системы, не было определено место ПЦР-анализа в схеме лабораторной диагностики бруцеллеза при обследовании контин-гентов риска и, особенно, для установления зараженности возбудителем бруцеллеза продуктов питания.

Ряд отечественных авторов для детекции бруцелл методом ПЦР используют праймеры Brul-Bru2 на основе нуклеотидной последовательности гена, кодирующего синтез белка молекулярной массой 31 кДа внешней мембраны бруцелл [Балахонов С.В. с соавт., 1996, 1999; Шестопалов М. Ю., 1997, 1999]. Но как показали последующие эксперименты при исследовании образцов биологического материа.

91 ла методом ПЦР, с использованием данных амплимеров, незначительные изменения параметров реакции, ведут к снижению специфичности метода с получением ложноположительных ответов.

С целью подбора оптимальных праймеров, пригодных для создания диагностической тест-системы, нами с использованием компьютерной программы «Gene Runner» были проанализированы три пары олигонуклеотидов на основе ДНК гена, кодирующего синтез белка молекулярной массой 31 кДа внешней мембраны В. abortus BCSP 31 [Mayfield J.E. et al., 1988; Hailing S.M., Zehr E.S., 1990]. Размер фланкируемого фрагмента ДНК для праймеров, обозначенных Brull-Brul2, составил 571 п.н., для Bru21-Bru22 — 462 п.н. и для ВгиЗ 1-Вги32 — 299 п.н. Данные компьютерного анализа и результаты ПЦР с препаратами ДНК, приготовленными из штамма В. abortus 19ВА, свидетельствовали о возможности использования указанных праймеров для постановки реакции.

В серии экспериментов с лизатами бруцелл и гетерогенных микроорганизмов, а также эукариотической ДНК, подобраны оптимальные параметры реакции (температура отжига, количество циклов амплификации и время каждого шага, концентрации MgCl2 и фермента в реакционной смеси), при которых образование неспецифичных продуктов амплификации отсутствовало. При сравнении чувствительности и специфичности ПЦР с тестируемыми праймерами показано, что только две пары Brul 1-Brul2 и ВгиЗ 1-ВгиЗ2 при оптимальных условиях реакции обеспечивали чувствительность метода lxlO4м.к./мл и 100% специфичность. Однако образование специфичных ампликонов при использовании праймеров Brul 1-Brul2 было заметно снижено (окрашенные фрагменты ДНК слабо визуализировались в агарозном геле). Поэтому для дальнейшего исследования и создания ПЦР-тест.

92 системы нами были выбраны праймеры ВгиЗ 1 и Вги32, как наиболее эффективные. ПЦР выполнялась при следующих условиях: реакционная смесь содержала — 10х буфер, рН 8,5, 2 мМ MgCl2, 0,2 мМ дНТФ, 12 пмоль каждого праймера, 1 ед. фермента Год-полимер азы (конечный объем реакционной смеси составил 25 мкл) — 35 циклов амплификации проводили по программе: денатурация — (94±-0,1)°С -1 мин, отжиг праймеров — (60± 0,1) °С — 1 мин, синтез комплементарной цепи -(72± 0,1) °С — 1 мин. После последнего цикла пробирки прогревали в течение 3 мин при температуре (72 ± 0,1) °С. Для снижения вероятности образования вторичных структур и неспецифичного связывания праймеров пробирки помещали в гнездо термоциклера только после достижения температуры денатурации. Изменение температуры отжига праймеров на ± 1 °C не влияло на специфичность и чувствительность реакции.

Достичь предельно высокой чувствительности ПЦР-анализа позволяет двух-стадийная («гнездовая») ПЦР, при которой образование продуктов реакции осуществляется в два этапа с помощью двух пар праймеров: внешних и внутренних. Для проведения второго этапа ПЦР мы использовали внутренние праймеры ВгиЗ и Bru4, обеспечивающих амплификацию фрагментов первичных ампликонов с образованием вторичных фрагментов ДНК размером 175 п.н. [Гаранина С.Б., 1996].

В контрольных экспериментах чувствительность метода с праймерами л л.

ВгиЗ 1-ВгиЗ2 и Bru3-Bru4 составила 1×10 -1×10 м.к./мл. С целью сокращения времени проведения анализа мы уменьшили количество циклов на первом этапе с 35 до 25 и продолжительность каждого шага реакции с 1 мин до 40 сек на первом и до 30 сек — на втором этапах. Это позволило без снижения чувствительности и специфичности метода сократить время проведения ПЦР более чем в два раза.

В результате проведенной работы на основе двухстадийной ПЦР была сконструирована тест-система для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦР, которая состоит из 11 компонентов:

— водных растворов двух пар олигонуклеотидных праймеров Bru31 и Bru32. ВгиЗ и Вги4.

— ТЦг-полимеразы — термостабильной ДНК-полимеразы в буферном растворе, выделенной из штамма Thermus aquaticus YT-1 («Promega», США).

— дНТФ — водного раствора дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (НПО «Вектор»).

— К+ (полоясительного контроля) — водного раствора ДНК В. abortus 19 В А.

— ЮхБ — 10-кратного буферного раствора рН 8,5.

— MgCl2 — 1% раствора магния хлорида (ГОСТ 4209−67).

— Н20 — воды деионизованной стерильной (ГОСТ 6709−72).

— Масла — масла вазелинового стерильного (ГОСТ 3164−78).

Диагностическую эффективность разработанной ПЦР-тест-системы оценивали в ходе комиссионных испытаний в соответствии с основными требованиями, предъявляемыми к диагностическим препаратам: специфичность, высокая чувствительность, стабильность, воспроизводимость получаемых результатов, быстрота выполнения исследования. В качестве метода сравнения использовали бактериологический анализ.

Эксперименты проводили с 37 штаммами шести видов бруцелл, 17 штаммами гетерогенных микроорганизмов, имеющих антигенное сходство с бруцеллами. Исследовали также образцы крови, молока, почвы, смывов с поверхностей, искусственно инфицированных различными видами бруцелл, и пробы биологического.

94 материала и объектов внешней среды, искусственно контаминированные V. cholerae, Y. enterocolitica, F. tularensis.

В результате проведенной работы была показана высокая чувствительность ПЦР-тест-системы, которая при анализе чистых культур бруцелл составила 1×10^ -1×103м.к./мл, а при исследовании биологического материала и объектов внешней среды, искусственно контаминированных Brucella spp. — lxlO3 м.к./мл. Положительные результаты ПЦР зарегистрированы со всеми 37 штаммами различных видов и биотипов бруцелл. Образование специфичного фрагмента ДНК было отмечено в 100% случаев при исследовании проб, содержащих возбудитель бруцеллеза в л О концентрации 1×10 м.к./мл, в 80,1% - в концентрации 1×10 м.к./мл и в 19,4% - в концентрации 10 м.к./мл. Частота выявления бруцелл в искусственно инфицированных пробах объектов внешней среды (смывы, почва), молока, крови в концен.

— 5 трации 1×10 м.к./мл составила 100% (диагностическая чувствительность метода). При тестировании различных штаммов гетерогенных микроорганизмов в 100% случаев в ПЦР был получен отрицательный ответ. Представленные данные свидетельствуют о высокой специфичности тест-системы и родоспецифичности выбранных нами праймеров.

Сравнительный анализ бактериологического метода и ПЦР с использованием разработанной нами тест-системы показал значительное преимущество ПЦР как по скорости получения результатов, 6−8 ч при ПЦР-анализе и 72−96 ч при культивировании возбудителя in vitro, так и по способности выявлять возбудитель в материале, контаминированном посторонней микрофлорой (объекты внешней среды, молоко). При изучении стабильности препарата было установлено, что в условиях низкотемпературного холодильника (минус 20±-2°С) ПЦР-тест-система не снижала.

95 свою эффективность в течение 6 мес. и обеспечивала 100% воспроизводимость результатов. Полученные результаты вошли в отчет государственных приемочных испытаний тест-системы для выявления Brucella spp. методом полимеразной цепной реакции и одобрены ученым советом ГИСК им. Л. А. Тарасевича (протокол № 7 от 16.05.00 г.). Комитетом МИБП разработанный нами препарат рекомендован для внедрения в практику здравоохранения (протокол №.7 от 05.07.00 г).

Материалы исследований свидетельствуют, о том, что разработанная ПЦР-тест-система при исследовании чистых культур различных видов бруцелл и материала, искусственно инфицированного возбудителем бруцеллеза, обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Однако они не позволяют дать объективную оценку диагностической точности изучаемого препарата при истинном инфекционном процессе, поскольку бруцеллы являются внутриклеточными паразитами и искусственное заражение материала не отражает подлинной картины инфицирования тканей организма возбудителем бруцеллеза. Поэтому целью следующего этапа нашей работы была оценка эффективности ПЦР по сравнению с бактериологическим методом при исследовании материала от животных, экспериментально зараженных возбудителем бруцеллеза.

При исследовании методом ПЦР суспензий органов морских свинок, зараженных подкожно культурами вирулентных штаммов В. abortus, В. melitensis и В. suis в дозе 1000 м.к., ДНК бруцелл выявлена в 66 из 135 проб (48,8%). Причем, положительные результаты ПЦР отмечены при исследовании всех зараженных животных (100%). Более высокая диагностическая эффективность ПЦР-анализа достигалась при исследовании селезенки и паховых лимфатических узлов, где ДНК бруцелл была выявлена в 66,6% и 60% случаев соответственно. В печени, легких,.

96 почках, парааорталышх лимфатических узлах, крови, мышечной ткани и моче амплификация фрагмента ДНК бруцелл наблюдалась в меньшем проценте случаев (30 — 53%). С материалом от контрольных (интактных) морских свинок в ПЦР получен отрицательный ответ.

При бактериологическом исследовании культуры возбудителя бруцеллеза выделены только из лимфатических узлов и селезенки, лишь от восьми из 15 животных (53%) и только в 12 случаях (8,9%). Преимущественная локализация бруцелл в селезенке и лимфатических узлах при бруцеллезной инфекции установлена В. А. Штритером. [1937], П. А. Вершиловой с соавт. [1954], И. Ф. Тараном с соавт. [1966]. Однако с помощью ПЦР в нашем эксперименте возбудитель бруцеллеза удавалось выявлять в этих органах соответственно в 2,5 и 2 раза чаще, чем при бактериологическом исследовании, что свидетельствует о преимуществе ПЦР-анализа по сравнению с культуральным методом. Еще одним преимуществом ПЦР-анализа является быстрота получения результата. Уже через 6 ч методом ПЦР было подтверждено наличие возбудителя в исследуемом материале от зараженных бруцеллезом морских свинок, в то время как при бактериологическом исследовании выделить культуру бруцелл удалось лишь на 3-й — 7-е сутки.

Сравнительное изучение данных по выявлению бруцелл при заражении морских свинок различными видами возбудителя показало, что больше всего положительных ответов получено при исследовании в ПЦР суспензий органов животных, зараженных вирулентными штаммами В. melitensis и В. suis. Культуры бруцелл в большем проценте случаев также были выделены от животных, зараженными этими видами. Это соответствует данным И. Ф. Тарана [1967] который показал, что морские свинки проявляют большую устойчивость к заражению вирулентным.

97 штаммом В. abortus, чем к В. melitensis и В. suis. Однако в наших исследованиях достоверных различий индекса выявляемости бруцелл (аналогичного индексу вы-севаемости при бактериологических исследованиях) в органах и тканях морских свинок, зараженных вирулентными культурами бруцелл не установлено (Р > 0,05). Возможно, это связано с ограниченным количеством животных, взятых в эксперимент, либо с относительно высокой дозой заражения.

Таким образом, нами установлено, что при исследовании зараженных животных методом ПЦР, также как и при бактериологическом анализе, более информативным материалом являются лимфатические узлы и селезенка, т.к. в этих органах возбудитель обнаруживается в большем проценте случаев. Показано преимущество использования ПЦР при исследовании органов и тканей зараженных бруцеллезом морских свинок по сравнению с бактериологическим методом и доказана диагностическая эффективность разработанной тест-системы.

Следующим этапом наших исследований была оценка эффективности ПЦР-анализа при обследовании контингентов риска по бруцеллезу. Сложная социально-экономическая ситуация, сложившаяся в настоящее время, существенно ограничивает возможность проведения полного комплекса противобруцеллезных мероприятий. Это приводит к тому, что «свежие» случаи заболевания бруцеллезом регистрируются на территории Российской Федерации практически повсеместно. С появлением новых форм и методов ведения животноводства (аренда, семейный подряд, фермерство и др.) изменились условия распространения бруцеллезной инфекции среди лиц занятых животноводством [Баташев В.В., 1996; Баташев В. В. с соавт., 1998]. Отмечается рост заболеваемости людей бруцеллезом в хозяйствах, которые официально считаются благополучными по данной инфекции [Лямкин Г. И. с со.

98 авт., 1995; Калиновский А. И., 1997; Панченко В. П. с соавт., 1998 а, б]. Все это обусловливает необходимость изучения заболеваемости и инфицированности населения с учетом эпидемиологических особенностей бруцеллеза в современных условиях и внедрения наиболее чувствительных и специфичных методов лабораторной диагностики в первую очередь, для обследования лиц, относящихся к континген-там риска.

Для сравнения эффективности ПЦР и ряда традиционных методов диагностики бруцеллеза у людей, таких как РА, РИГА, была определена их диагностическая чувствительность. Совместно с сотрудниками ЦГСЭН по Саратовской области проведено исследование образцов крови и сыворотки крови от 160 чел., относящихся к контингентам риска по бруцеллезу (работники мясокомбината и животноводы хозяйств, неблагополучных по бруцеллезу КРС) и 50 доноров, проживающих в г. Саратове.

С помощью, разработанной нами ПЦР-тест-системы и общепринятых серологических тестов РА и РИГА среди декретированного контингента выявлено 15% лиц с положительными реакциями на бруцеллез. ПЦР была положительна у 12,5% обследованных. Положительные серологические реакции РПГА и РА в диагностических титрах отмечены в 5,8 и 5% случаев соответственно. Образцы крови и сывороток крови контрольной группы во всех случаях были серои ПЦР-негативными.

Нами установлено достоверное различие в диагностической эффективности серологических реакций и ПЦР. Так, диагностическая чувствительность (процент положительных результатов в группе людей с данным заболеванием) РНГА уступала аналогичному показателю для ПЦР в 2,2 раза, РА — в 2,5 раза (Р от 0,05 до.

0,02). Статистически достоверной разницы между количеством положительных ответов в РА и РНГА не установлено (Р > 0,1).

При обследовании 95 работников животноводческих хозяйств с помощью серологических тестов и ПЦР выявлено 14,7% лиц с положительными реакциями на бруцеллез. Следует отметить, что в половине случаев факт инфицирования подтвержден установлением клинического диагноза. Причем у всех этих лиц в ПЦР был зарегистрирован положительный результат. Всего при ПЦР-анализе ДНК бруцелл выявлена у 11,5% работников. Большинство среди инфицированных (64%) составляют лица, непосредственно занятые обслуживанием животных и переработкой продукции животноводства (скотники, телятница, повар, сепараторщица, боец, ветврач). Высокий процент инфицированных выявлен нами среди работников, временно привлекаемых для работы на ферму (35,7%). Это подтверждает вывод В. В. Баташева [1996] о том, что в очаге бруцеллеза вероятность заражения этой инфекцией высока для всех работающих.

Среди 65 работников Энгельсского мясоперерабатывающего комбината положительные реакции на бруцеллез, всеми используемыми методами, обнаружены у 10 чел. (15,3%) из которых у пяти — положительные серологические реакции отмечены ранее при профилактических осмотрах. ПЦР была отрицательна только у одного человека, в то же время титр серологической реакции в этом случае был не диагностическим. Как и в проведенных исследованиях П. А. Вершиловой с соавт. [1972], В. Н. Корзенко [1970], Е. С. Белозерова [1985], наибольшее число инфицированных выявлено нами среди работников бойни, шкуропосолочного и кишечного цехов, т. е. у персонала, имеющего высокую степень контакта с объектами зараженными возбудителем бруцеллеза. Полученные результаты показывают более высо.

100 кую диагностическую эффективность ПЦР по сравнению с серологическими реакциями при тестировании крови животноводов из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств и работников мясокомбината и свидетельствуют о возможности использования ПЦР-анализа при обследовании контингентов риска по бруцеллезу. Подтвержден профессиональный характер заболеваемости. Установлена наибольшая заболеваемость лиц трудоспособного возраста, независимо от принадлежности к полу, а также высокая заболеваемость бруцеллезом лиц, временно привлеченных к работе в очаге.

Молоко и молочные продукты, зараженные бруцеллами, неоднократно являлись причиной заболевания людей бруцеллезной инфекцией. В нашу задачу входило установить возможность использования ПЦР-анализа и разработанной нами тест-ситемы для детекции возбудителя бруцеллеза в таких продуктах, как молоко, сыр, масло, сливки.

В проведенных ранее экспериментах при определении специфичности тест-системы мы использовали микроорганизмы, которые имеют антигенное сходство с бруцеллами. Однако существует большое количество возбудителей других инфекций, способных длительно сохранятся в молочных продуктах и при употреблении таких продуктов в пищу вызывать различные инфекционные заболевания (туберкулез, салмонеллез, туляремию, листериоз, лептоспироз, дизентерию, эшерихиозы, кишечный иерсиниоз, кампилобактериоз, гепатит, А и др.). Поэтому первым этапом данного раздела нашей работы была проверка специфичности ПЦР-тест-системы при исследовании различных видов бактерий — возбудителей зоонозных, антропо-зоонозных и антропонозных инфекций, передающихся алиментарным путем, прежде всего через молоко. При тестировании в ПЦР 41 штамма таких микроорганиз.

101 мов ни в одном случае не отмечен положительный результат, что подтверждает специфичность ПЦР-тест-системы.

При исследовании молочных продуктов, содержащих большое количество различных соединений, способных ингибировать реакцию, успешное проведение ПЦР зависит от качества выделения ДНК-мишени и степени ее очистки. Следующим этапом был выбор оптимального метода выделения ДНК. Сравнивали четыре различных способа:

— метод нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоцианата;

— обработку лизирующим буфером, содержащим иодид натрия, с переосаждением ДНК изопропанолом;

— сорбцию ДНК на нуклеосорбенте в присутствии Nal после обработки образца ионным детергентом (SDS);

— метод фенол-хлороформовой экстракции с последующим переосаждением ДНК этанолом.

Качество очистки ДНК оценивали по эффективности ПЦР-анализа при работе с образцами молока, сливок, масла и рассольного сыра, искусственно инфицированными В. abortus 19ВА.

Полученные результаты показали, что все четыре способа выделения ДНК обеспечивают достаточную очистку проб от компонентов, способных ингибировать реакцию. При исследовании молока, сливок и сыра, независимо от способа выделения нуклеиновых кислот, чувствительность ПЦР-анализа составила lxlO3 м.к./мл (г) продукта, при работе с образцами масла — 1×104м.к./г. Однако степень очистки ДНК была выше при использовании фенол-хлороформовой экстракции и метода нуклеосорбции в присутствии Nal после обработки образца SDS.

102 способы 3 и 4), о чем свидетельствовал больший выход ПЦР-продукта. Но оба способа имеют один недостаток — необходимость переноса материала из пробирки в пробирку, что нежелательно из-за риска контаминации. Более низкая степень очистки ДНК другими методами (способы 1 и 2) по-видимому, обусловлена тем, что лизирующие буферы, используемые в этих методах, не содержат органических растворителей, а дополнительная очистка образца ацетоном на заключительном этапе не обеспечивает полное удаление жиров, что снижает эффективность амплификации.

По длительности, процедура выделения ДНК с помощью способа, основанного на фенол-хлороформовой экстракции, занимает почти вдвое больше времени, чем остальные методы. Это ограничивает его использование при исследовании большого количества образцов. Методы, с использованием гуанидинтиоцианата и иодида натрия (1-й и 2-й методы) по быстроте выделения ДНК не отличаются друг от друга, но превосходят способ на основе SDS (3-й метод). Таким образом, применение ПЦР для детекции бруцелл в молоке, сливках, сыре и масле возможно после соответствующей подготовки проб с чувствительностью lxlO3 -lxlO4 м.к./мл (г) продукта.

В результате проведенной работы разработана тест-система для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦР, которая обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Показана ее эффективность при исследовании различного биологического материала, объектов внешней среды и продуктов питания, а также более высокая диагностическая чувствительность по сравнению с традиционными серологическими методами при выявлении людей, инфицированных возбудителем бруцеллеза. Тест-система прошла комиссионные испытания и рекомендована для.

103 практического внедрения комитетом МИБП Минздрава России. Разработанная тест-система была апробирована в практике Саратовского областного центра Госсанэпиднадзора для диагностики бруцеллеза у людей и может быть использована при обследовании декретированных контингентов, а также при проведении лабораторного контроля молока и молочных продуктов на зараженность возбудителем бруцеллеза.