Картирование регуляторных последовательностей в составе ретротранспозонов HERV-K (HML-2) и L1

Мобильные генетические элементы (МГЭ), богатые регуляторными последовательностями, представляют собой чрезвычайно интересные и важные объекты в исследованиях регуляции транскрипции. Они были обнаружены во всех изученных к настоящему времени геномах эукариот, к которым относится и геном человека, примерно половина которого состоит из последовательностей, произошедших в результате активности т.н. «прыгающих» генов. МГЭ являются мощным источником генетической нестабильности за счет своей способности к инсерционному мутагенезу, эктопической рекомбинации, трансдукции 5' и 3'-фланкирующих последовательностей, образованию псевдогенов или даже новых функциональных копий генов, разрушению ранее существовавших экзон-интронных структур и изменению эпигенетической регуляции генов. Интеграция МГЭ в последовательности важных генов, таких как, например, кодирующие онкосупрессоры гены, может привести к нарушению механизмов контроля деления, роста и дифференцировки клеток, что в свою очередь способно привести к возникновению некоторых форм рака. Надо отметить, что наибольшую опасность для целостности генома представляет собой повышение активности МГЭ в клетках терминальной линии, поскольку в данном случае нарушения генома могут быть переданы потомкам. Однако не всегда активность МГЭ приводит лишь к негативным результатам. К настоящему времени известны примеры позитивного влияния активности МГЭ на функционирование организма в целом. Так, например, ДНК человека содержит одомашненные элементы, имеющие наиважнейшие функции, такие как активирующие рекомбинацию гены RAG, лежащие в основе V (D)J рекомбинации нашей иммунной системы, а также ген ERVWE1, играющий важную роль в развитии плаценты.

Данная работа посвящена изучению структур смысловых промоторов ретротранспозонов человека, активность которых способна оказывать значительное влияние на функционирование генома клетки-хозяина.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава I. Характеристика мобильных элементов.

МГЭ присутствуют в геномах широкого спектра живых организмов, что было показано в результате полногеномного секвенирования и сравнительного анализа геномов человека [1], шимпанзе [2], мыши [3], дрозофилы [4] и других геномов. Как оказалось, образованные в результате активности МГЭ последовательности могут составлять значительную часть ДНК. Так, например, -45% генома человека [1] и -80% генома кукурузы [5] состоят из таких последовательностей (включая фрагменты транспозонов или «мертвые» элементы, инактивированные мутациями). Такое обилие МГЭ резко контрастирует с небольшим процентным содержанием последовательностей, кодирующих клеточные белки (<2% в геноме человека [1]). Интересно, что доля занимаемой повторяющимися элементами ДНК, значительно варьирует в геномах различных организмов. Например, по сравнению с геномами человека и кукурузы, геномы дрозофилы и дрожжей имеют невысокое содержание МГЭ и большее в процентном соотношении количество генов [4, 6].

Существует много различных типов мобильных элементов. В зависимости от природы молекулы-посредника, используемого для мобилизации, их делят на два класса: МЭ класса I, или ретроэлементы (РЭ) и МГЭ класса II, или ДНК-транспозоны. РЭ перемещаются в геномах с помощью РНК-посредника по механизму, который часто называют «копирование-вставка» («сору&ра$ 1е»). Согласно нему, с материнского РЭ происходит синтез мРНК, на матрице которой при помощи фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы (альтернативные названия этого фермента — обратная транскриптаза или ревертаза) затем происходит синтез кДНК-копии материнского элемента. ДНК-транспозоны перемещаются в геномах по механизму, называемому «вырезание-вставка» («с1Н&ра$ 1е») и заключающемуся в вырезании мобильного элемента и его реинтеграции в новое место генома.

РЭ являются единственным классом МЭ, не утратившим способность к транспозиции в геномах млекопитающих [4]. На основании присутствия или отсутствия в последовательностях ретроэлементов длинных концевых повторов, фланкирующих основную часть элемента, их принято делить на две группы: 1) ЬТЯ-содержащие («ЬТЫ-ретротранспозоны», также их называют ретровирус-подобными мобильными элементами) и 2) ЬТЯ-не-содержащие (или «поп-ЬТЯ-ретротранспозоны»). Помимо различий в присутствии или отсутствии длинных концевых повторов, ЬТЯ-содержащие и ЬТК-не-содержащие ретроэлементы имеют совершенно разные механизмы пролиферации. LTR-содержащие ретроэлементы представлены в геномах эндогенными ретровирусами (ЭРВ), LTR ретротранспозонами и тирозин-рекомбиназными ретротранспозонами. К LTR-не содержащим ретроэлементам относят следующие типы ретроэлементов: длинные диспергированные повторы или LINE, короткие диспергированные повторы или SINE (SINE — Short Interspersed Nuclear Elements), процессированные псевдогены и ретротранспозоны SVA (Рис.1). Поскольку эндогенные ретровирусы и LINE-элементы кодируют белки, необходимые для обратной транскрипции мРНК ретроэлемента и интеграции новосинтезированной кДНК в новое место генома, их называют автономными ретроэлементами или ретротранспозонами. SINEи SVA-элементы, а также процессированные псевдогены являются неавтономными элементами или ретропозонами, поскольку они не содержат генов, кодирующих необходимые для ретротранспозиции белки [7]. Считается, что перемещение ретропозонов в геноме происходит за счет ретротранспозиционной машины LINE [8, 9].

выводы.

1. Для двух типов тканей — паренхимы яичка и ееминомы был определен профиль экспрессии человек-специфичных ЦШ семейства НБИУ-К (НМЬ-2), в результате чего было показано, что более половины ЬТЯЬз обладают промоторной активностью в тканях зародышевого пути человека.

2. Среди промоторно-активных ЦП^Ьв были идентифицированы 14 одиночных и 3'-провирусных СШ, дифференциально экспрессирующихся в опухолевой ткани по сравнению с нормальной.

3. В результате анализа промоторной активности ЦИМ^ в зависимости от геномного окружения, было показано, что наиболее богатыми промоторно-активными ЬТЯ областями генома являются экзоны известных генов.

4. В результате сравнительного анализа промоторной активности 16ти ЬТЬМгэ и уровней экспрессии соседних с ними генов, было показано, что корреляция между этими значениями отсутствует.

5. Было проведено картирование точки начала транскрипции для одиночных ЬТЯЬ5 и продемонстрировано, что инициация транскрипции генов провируса также преимущественно происходит с области ЬТЫ, расположенной вблизи от этой ТНТ.

6. С применением метода делеционного картирования было показано, что наиболее важной областью, ответственной за промоторную силу 5'НТО Ь1, является внутренний участок +390.+526, а не «минимальный промотор» Ь1, как считалось ранее.

7. Было продемонстрировано, что инициация транскрипции с 5' НТО Ы как экзогенного, так и эндогенного происхождения, помимо самого начала Ы происходит также и с внутренней области ретротранспозона, расположенной между 525 и 621 нт.

II.5 Заключение.

Промотор L1 человека расположен в 5' НТО этого ретротранспозона, богатой сайтами связывания различных факторов транскрипции (Рис. 21 А). Молекулярный механизм действия этого промотора к настоящему времени остается достаточно плохо охарактеризованным. Считается, что участок первых -100 п. о, также названный «минимальным промотором», является наиболее важной областью, без которой невозможна эффективная инициация транскрипции L1 человека (см., например [14]. Согласно проведенным нами экспериментам, делеция этой области приводит лишь к 1.3-и 2.4-кратному снижению промоторной активности 5' НТО в клетках НЕК293 и NTera2/Dl соответственно в случае измерений уровня экспрессии репортерного белка, и к 2.2- и 3.8-кратному снижению активности по результатам измерений концентрации мРНК в тех же клетках соответственно. Транскрипционная активность отдельно взятого «минимального промотора» была сравнительно низкой (-30% от уровня активности полноразмерного 5' НТО), что хорошо согласуется с результатами, опубликованными Атаникаром и др [195], а также Янгом и Казазяном [100].

УУ1 RUNXЗ ї і р53 вРУ/БОХ вВУ/БОХ її ї.

Сайты связывания факторов транскрипции.

Минимальный промотер 1 шхз точки начала транскрипции.

Внутренняя область.

Внутренняя область.

Рис. 21. Предполагаемый механизм действия промотора Ь1. (А) Картирование предсказанных сайтов связывания факторов транскрипции в 5' НТО Ы. Черные линии выше и ниже центральной прямой обозначают сайты связывания факторов транскрипции в прямой и обратной ориентации соответственно. Надписями" У У1″, «Я1ЖХЗ», и т. д., обозначены последовательности, для которых было показано, что они являются функционально важными для связывания соответствующих факторов транскрипции, согласно [193, 195, 199] {[194, 198, 200]. (Б) Иллюстрация гипотезы, объясняющей механизм действия промотора Ь1.

Эти результаты практически полностью противоречат результатам Сверголда, на основании которых был сделан вывод о необходимости присутствия области минимального промотора в 5' НТО Ы для транскрипционной активности ретротранспозона [13]. Такие значительные нестыковки результатов, со всей вероятностью, связаны с постановкой эксперимента. В 1990 году, Сверголд для измерения промоторной активности различных вариантов 5' НТО в клетках 1ЧТега2ЛЭ1 и НеЬа использовал бета-галактозидазную репортерную систему. Кроме того, те же конструкции были использованы для оценки уровней экспрессии РНК репортерного гена при помощи Нозерн блота. Основным недостатком этих экспериментов, по всей вероятности, является отсутствие каких-либо контролей, позволяющих учитывать различия в эффективности трансфекции между образцами, что может значительно повлиять на конечный результат.

В наших экспериментах, была использована люциферазная репортерная система, поскольку она является намного более чувствительной к минимальным изменениям уровня экспрессии репортерного белка. Кроме того, нами была проведена нормализация полученных результатов на уровень экспрессии гена бета-галактозидазы, находящегося под контролем промотора CMV. Согласно полученным результатам, наиболее важной областью 5' НТО L1 человека для обеспечения эффективной промоторной активности 5' НТО L1, является область (390−526), делеция которой приводит к ~3.6 и ~5.5-кратному снижению промоторной активности, как по результатам измерений уровня экспрессии белка, так и мРНК в клетках линий НЕК293 и NTera2/Dl соответственно. Эти результаты согласуются с опубликованными ранее результатами Янга и Казазяна [100], которые свидетельствуют о том, что промоторная активность 5'-концевого участка 5' НТО L1 длиной 412 п.о. значительно ниже промоторной активности 5'-концевого участка длиной 506 п.о. как в ретротранспозиционном, так и в люциферазном репортерных тестах. Помимо этого, внутренняя область (390−526) содержит функциональный сайт связывания фактора транскрипции SOX11 в положении (452−466), мутация которого приводит к более чем 2.5-кратному снижению промоторной активности 5' НТО [198].

Влияние внутренней области 5' НТО на эффективность транскрипции может быть обусловлено присутствием в ней транскрипционного энхансера. Благодаря своей сложной структуре и присутствию большого числа сайтов связывания факторов транскрипции (Рис. 4А), эта область может служить местом формирования энхансосомы. Интересно, что для нескольких элементов LINE, присутствующих в геномах других организмов, было показано, что за эффективную регуляцию транскрипции ответственны, по крайней мере, две области 5' НТО: 5' - концевая область, содержащая точку начала транскрипции, а также расположенная ниже внутренняя область. Так, например, F-элемент генома дрозофилы, являющийся ретротранспозоном группы LENE, имеет базальный промотор, расположенный в первых 40 п.о. его 5' НТО, тогда как внутренний энхансер, присутствие которого значительно повышает транскрипционную активность F-элемента, расположен ниже, в положении (165−269) [208]. Внутренняя область 5' НТО еще одного LENE дрозофилы, I-элемента, также содержит внутренний участок, выступающий в роли энхансера [210]. Кроме того, внутренний участок теломерного LINE-ретротранспозона TRAS1 шелкопряда Bombyx mori чрезвычайно важен для его промоторной активности, а также он служит альтернативным промотором в случае делеции первых 40 п.о. с 5'-конца его 5' НТО [211]. Интересно, что согласно результатам двух исследований [200, 212], область (386−659) одной из геномных копий ретротранспозона L1 человека служит энхансером для промотора, расположенного вблизи кодирующего аполипротеин, А гена.

Однако, пока остается невыясненным, каково влияние энхансера на экспрессию самого ретроэлемента [202].

С другой стороны, внутренняя область 5' НТО L1 может содержать альтернативные ТНТ. Как известно, эта область содержит антисмысловой промотор [16, 72, 100]. Кроме того, недавно было показано, что транскрипция многих промоторов генома человека происходит как в прямом, так и в обратном направлениях [213]. Аналогичный пример присутствия альтернативных ТНТ был описан для элемента LINE в геноме Л. thaliana [214]: внутренний участок 5' НТО ретротранспозона ATLN39 содержит дополнительный промотор, транскрибирующийся в прямой ориентации и обуславливающий синтез укороченных мРНК. Хотя 5' концы транскриптов L1 человека и были ранее картированы с помощью метода удлинения затравки в нескольких исследованиях (например, [192, 204, 207]), в большинстве случаев были использованы праймеры, расположенные вблизи от 5'-конца НТО. Кроме того, были проведены исследования мРНК L1 с помощью Нозерн гибридизации и метода RNAse protection assay (метод защиты РНК от действия РНКаз) [13, 119, 195], но разрешение этих методов могло быть недостаточным для обнаружения слегка укороченных транскриптов, синтез которых инициируется во внутренней области 5' НТО.

Для того чтобы прояснить этот вопрос и понять, какова роль «минимального промотора» в инициации транскрипции L1, нами были картированы точки начала транскрипции мРНК, инициированных как с содержащей полноразмерную 5' НТО L1 конструкции, так и с вектора, содержащего 5' НТО с делецией первых 5'-концевых 98 п.о. (Рис. 20 А, Б). Во втором случае, ТНТ были обнаружены либо в положении 786 (единственная ТНТ, расположенная в 3'-конце 5' НТО), или же ниже 5' НТО, в начале ОРС1 L1 (положения 932 и 936) — для клеток линий NTera2/Dl и НЕК293 соответственно. Удивительно, что в случае полноразмерной 5' НТО, помимо транскриптов, инициированных с 5' конца нетранслируемой области (т.е. с канонический ТНТ), были обнаружены мРНК, инициация транскрипции которых происходила во внутренней области 5' НТО, причем эффективность транскрипции этих укороченных мРНК была выше, эффективности транскрипции канонических. ТНТ этих неканонических транскриптов были картированы в положениях +525 и +570 для двух клеточных линий, использованных в работе. К настоящему времени не было показано присутствия мРНК, имеющих ТНТ внутри 5' НТО L1, поэтому, принимая во внимание тот факт, что эти транскрипты могут быть артефактами, появившимися вследствие использования векторной системы, у которой отсутствует характерный для эндогенных 5' НТО L1 нативный геномный контекст, нами были проведены дополнительные эксперименты для подтверждения аутентичности этих ТНТ. Для этого было осуществлено картирование 5' концов эндогенных транскриптов L1, имеющих геномное (хромосомное) происхождение. Так, для нескольких кДНК, нами было показано, что они имеют ТНТ, расположенные во внутренней области 500−700 п.о. 5' НТО, что позволяет сделать заключение о том, что 5' НТО L1 способен направлять транскрипцию не только с самого 5'-конца элемента, но также и с альтернативных позиций, расположенных на некотором удалении от 5'-конца. Эта гипотеза частично подтверждается недавно проведенным широкомасштабным исследованием транскриптома [215], в котором для мобильных элементов млекопитающих был применен метод анализа экспрессии генов, основанный на детекции кэпированных сайтов инициации транскрипции и названный CAGE (англ. Cap Analysis of Gene Expression — метод анализа экспрессии кэпированных генных транскриптов). Согласно результатам CAGE, значительная доля смысловых транскриптов, инициированных с полноразмерных L1 человека, имеет ТНТ во внутренней области 5' НТО, которые расположены либо в её первой трети, либо на участке между +600 и +800 нуклеотидами, что достаточно близко от ТНТ, найденных в данном исследовании.

Вообще говоря, обнаруженные выше возможные свойства внутренней области 5' НТО (выполнение роли энхансера и обеспечение альтернативных ТНТ для мРНК L1), не являются взаимно исключающими. Недавний прогресс в понимании механизма работы энхансеров предполагает, что многие из них на самом деле действуют при помощи механизма, опосредованного РНК-транскриптами, инициированными с энхансера [216].

Тот факт, что делеция 5'-концевой области длиной -100 п.о. и содержащей «каноническую» ТНТ L1 не приводит к полному отсутствию промоторной активности 5' НТО L1, а вместо этого лишь приводит к смещению положения ТНТ L1 в другие нижележащие области ретротранспозона, предполагает, что основная функция «минимального промотора» — в точном позиционировании инициирующего транскрипцию комплекса в самое начало 5'-конца элемента, а не в эффективном привлечении факторов транскрипции. Надо заметить, что делеция даже небольшого числа 5'-концевых нуклеотидов, включающих в себя сайт связывания фактора транскрипции YY1, также приводит к изменениям в положении точек начала транскрипции, хотя и не к таким кардинальным [195]. По нашему мнению, именно внутренняя область (390−526) 5' НТО L1, связанная с различными факторами транскрипции, служит основанием для сборки пре-инициационного комплекса, который затем может быть либо перенаправлен в содержащую «канонические» ТНТ 5'-концевую область, либо в быть использованным непосредственно вблизи для инициации синтеза укороченных с 5'-конца копий РНК (Рис. 21 Б). Этот механизм регуляции инициации транскрипции может быть аналогичным механизму инициации транскрипции гена СИ80 мыши. В случае этого гена, сборка пре-инициационного комплекса изначально происходит на периферическом вышележащем энхансере — участке ДНК, с которым связывается фактор транскрипции №-кВ. Этот комплекс затем взаимодействует с базальным промотором, зависящим от ФТ Бр1 и расположенным непосредственно выше точки начала транскрипции гена СИ80 [217]. Принимая во внимание описанный выше пример инициаци транскрипции, можно предположить, что роль первых 100 п.о. 5' НТО Ы человека аналогична роли инициаторного элемента (например, YY1 8р-1 [193, 195, 206]), который отмечает 5'-концевую ТНТ ([218−220]), взаимодействует с преинициационным комплексом и отвечает за инициацию транскрипции вблизи от положения +1 (Рис. 4Б, слева). В случае же 5' НТО, у которой отсутствует «минимальный промотор», ТНТ смещается в сторону ниже участка (390−526) (рис. 21Б, справа).

Однако, нужно подчеркнуть, что область «минимального промотора» жизненно необходима для нормальной пролиферации полноразмерных копий ретротранспозона Ы в геноме хозяина, в случае же её отсутствия, 5' НТО Ы способна инициировать транскрипцию лишь значительно усечённых транскриптов. С другой стороны, присутствие полноразмерной нетранслируемой области не является необходимым для ретротранспозиций [221], так что такие нестандартные, усеченные с 5'-конца транскрипты могут сохранять способность к ретротранспозиции. Мы не исключаем вероятности того, что некоторые из укороченных с 5'-конца копий Ы, присутствующих в геноме, могли произойти именно от таких дефектных транскриптов, а не являются результатом неполной обратной транскрипции полноразмерных мРНК Ы.