Клонирование гена бета-галактозидазы Thermoanaerobacter ethanolicus и характеристика продукта этого гена
Диссертация
Особый интерес представляют р-галактозидазы термофильных бактерий. Они способны продолжительно действовать при при высоких температурах (выше 60°С) и обладают рядом преимуществ по сравнению с р-галактозидазами грибов (температурный оптимум 50°С)' используемых в настоящее время в биотехнологическом производстве. В частности, для них характерны более высокие удельные активности. В связи с высокими… Читать ещё >
Содержание
- Список сокращений
- 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
- 1. 1. ß--Галактозидаза и ее природные источники
- 1. 2. Промышленное использование ß--галактозидазы
- 1. 3. Организация генов ß--галактозидаз
- 1. 4. Клонирование генов ß--галактозидаз бактерий и 12 структура соответствующих ферментов
- 1. 5. Структура ß--галактозидаз
- 1. 6. Регуляция ß--галактозидазного синтеза
- 1. 7. Физико-химические свойства ß--галактозидаз. v 1.8 Субстратная специфичность ß--галактозидазы
- 1. 9. Иммобилизация ß--галактозидаз
- ЭСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТ
- 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- 2. 1. Бактериальные штаммы и плазмиды
- 2. 2. Химические реагенты и ферменты нуклеотидного обмена
- 2. 3. Бактериальные среды и условия культивирования
- 2. 4. Выделение и анализ плазмидной ДНК
- 2. 5. Выделение хромосомной ДНК Т. ethanollcus
- 2. 6. Конструирование геномной библиотеки
- 2. 7. Отбор активных клонов на чашках
- 2. 8. Очистка ß--галактозидазы 42 2.8.1. Приготовление клеточных экстрактов
- 2. 8. 2. Фракционирование сульфатом аммония
- 2. 8. 3. Гель-фильтрация
- 2. 8. 4. Анион-обменная хроматография
- 2. 9. Электрофорез и изоэлектрофокусирование
- 2. 10. Методы определения активности ß--галактозидазы
- 2. 10. 1. Определение активности на хромогенных субстратах
- 2. 10. 2. Определение активности на лактозе
- 2. 11. Определение концентрации белка
- 2. 12. Определение термостабильности и pH-стабильности 46 белка
- 2. 13. Иммобилизация галактозидазы
- 2. 14. Определение активности иммобилизованной 47 ß--галактозидазы
- 2. 15. Определение термостабильности и pH-стабильности 48 иммобилизованного белка
- 2. 16. Определение нуклеотидной последовательности 48 гена ß--галактозидазы и компьютерный анализ полученных данных
- 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
- 3. 1. Создание банка генов и отбор активных клонов
- 3. 2. Определение нуклеотидной последовательности 51 гена ß--галактозидазы Т. ethanolicus
- 3. 3. Выделение и очистка рекомбинантной ß--галактозидазы
- 3. 4. Субстратная специфичность и физико-химические 66 характеристики ß--галактозидазы
- 3. 5. Иммобилизация ß--галактозидазы Т. ethanolicus
- ЗАКЛЮЧЕНИЕ
- ВЫВОДЫ
- СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Сокращения используемые в тексте диссертации
- Да — дальтон
- Ед. — единица активности фермента
- ПААГ — полиакриламидный гель
- ДТТ — дитиотрейтол т.п.н. — тысяч пар нуклеотидов
- БОБ — додецилсульфат натрия
- РС буфер — фосфат-цитратный буфер
- Среда ЬВ — среда «Ьиг^а-ВегЧгап!»
Субстраты р№ - п-нитрофенил р№Са1 — п-нитрофенил-бета-Д-галактопиранозид оЫРСа1 — о-нитрофенил-бета-Д-галактопиранозид р№Ху1 — п-нитрофенил-бета-Д-ксилозид рЫРС — п-нитрофенил-бета-Д-глюкозид рМр-аСа1 — п-нитрофенил-альфа-Д-галактопиранозид
МШа1 — 4-метил-умбеллиферрил-бета-Д-галактозид
Список литературы
- Захарова И. Я., БугловаТ.Т., Тихомирова А. С. (1988) Ферменты трансформирующие галактозу. Киев. 224с.
- Виха И. В., Воробьев A.A., Жолудева С. И., Касьянова Т. А., Кудрявцев С. И., (1987) Получение высокоактивного препарата ß--D-галактозидазы. Прикл. Биохим. и Микробиол., 236, 291−298.
- Кумарев В.П., Райт A.C., Салганик Р. И. (1976) Иммобилизация белков и ферментов на альдегидосилохромах. Биоорганическая химия, 2, 700−705.
- Куликова А. К., Гомартелли М. М., Церетелли А. К., Безбородов A.M., Квеситадзе Г. И., БилайТ.И., (1989), ß--Галактозидаза низших эукариот (грибов и дрожжей)., Прикл. Биохим. и Микробиол., 25, 734−746.
- Льюин Б., (1987) Гены., Москва., 176−188.
- Миллер Д., (1976) Эксперименты в молекулярной генетике. Москва., 324−327.
- Нахапетян Л. А., Мотина Л. И., (1988) Получение глюкозо-галактозных сиропов из молочной сыворотки. Биотехнология, т. 4, 4−21.
- Самошина Н. М., Лотменцева Е. Ю., Борисова В. Н., (1984) Гидрофобная иммобилизация грибных ß--галактозидаз на неорганическом носителе с карбоксильными группами. Прикладная биохимия и микробиология, 20, 817−821.
- Самошина Л.М., Лотменцева Е. Ю., Борисова В. Н. и др. (1987) Гидролиз лактозы с помощью грибных иммобилизированных ß--галактозидаз, Биотехнология, 1, 61−65.
- Самошина Л., Лотменцева Е. Ю., Борисова В. Н., Нахапетян Л.А., 1985) Сравнительное изучение некоторых кинетических параметров грибных (J-галактозидаз., Прикл. Биохимия и Микробиол., 21, 745−751.
- И. ЦаплинаИ.А., Богданова Т. И., Гвеннер X., Центграф Б., (1992) р-Галактозидаза Thermus ruber., Приклад, биохимия и микробиол., 28, 22−26.
- AmaritaF., Alcorta F., Duplessix M.L., Cantanbrana Т., Rodriguezfernandez C., (1995) Izolation and properties of free and immobilized fi-galactosidase from the psychrotrophic enterobacterium Buttiauxella agrestis., J. Appl. Bacteriol., 78, 630−635.
- Akasaki M., Suzuki M., Funakashi J., Yamashina J., (1976) Characterisation of p-galactosidase from a special strain of Aspergillus oryzal. J.Biochem., 80, 1195−1200.
- Beckwith J.R., Zipser D., (1970) The lactose operon. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.
- Bodalo A., Gomer E., Gomer J., Bastida J., Maximo M., (1991) A comparison of different metods of (5-galactosidaseimmobilization., Process Biochem., 26, 349−353.
- BrenaB.M., RydenL.G., Porath J., (1994) Immobilization of ?-galactosidase on metal-chelate-substituted gels., Biotechnol. and Appl. Biochem., 19, 217−231.
- Bronnenmeier K., Staudenbauer W. L., (1990). The molecular biology and genetics of substrate utilization in Clostridia.
- Browmik T., Marth E.H., (19S0) ?-Galactosidase of Pedicoccus species: induction, purification and parccial characterisation, Appl. Microb. Biotechnol., 33, 317−323.
- Browmik T., Tarun, Marth E.H., (1989) Simp1 method to detect ?-galactosidase., 1989, Appl. Envirom. Microbiol., 55, 3240−3242.
- Burchhardt G., Bahl H., (1991) Cloning and analisis of the ?-galactosidase-encoding gene from Clostridium thermosulfurogenes EMI. Gene, 106, 13−19.
- Buvinger W. E., Riley M., (1985) Nucleotide sequence of Klebsiella pneumoniae lac genes., J. of Bacteriol., 89, 850−857.
- Choi Y.J., Kim I.H., Lee B.H., Lee J.S., (1995) Purification and characterization of beta-galactosidase from alkalophilic and thermophilis Bacillus sp TA-11., Biothechnol. Appl. Biochem., 22, Part 2, 191−201.
- Craven G., Steers E., Anfinsen C., (1965) Purification, composition, and molecular weith of the ?-galactosidase of Escherichia coli K-12., J. Biol. Chem., 240, 2468−2477.
- Crow V., DaveyG., Pearce L., Thomas T., (1983) Plasmid linkage of the D-tagatose-6-phosphate pathway in Streptococcus Lactis: effect on lactose and galactose metabolism., J. of Bacterid., 153, 76−83.
- Davis S., Stevens H., Riel M., Simons G., Vos W., (1992) Leuconostoc lactis 0-galactosidase is encoded by two overlapping genes., J. of Bacteriol., 174, 4475−4481.
- De Vos W.M., Gasson M.J., (1989) Structure and expression of the Lactococcus lactis gene for phospho-beta-galactosidase (lacG) in Escherichia coli and L. lactis., J. Gen. Microbiol., 135, (Pt 7), 1833−1846.
- Dickson R.C., Dickson L.R., MorkinJ.S., (1979) Purification and properties of inducible B-galactosidase isolated from yeastm
- Kluyveromyces lactis, J.Bacteriol., 137, 51- 61.
- Edwards R., Cupples C., Huber R., (1990) Site specific mutants of p-galactosidase show that Tyr-503 is unimportanst in Mg2 + binding but that Glu-461 is very impotant and may be a ligand to Mg2+ ., Biochem. and Biophys. Res. Commun., 171, 33−37.
- Edwards L. A., TianM.R., Huber R.E., FolwerA.V., (1988) The use of limited proteolysis to probe interdomain and active site regions of (5-galactosidase (E. coli)., J. of Biol. Chem., 263, 1848−1854.
- Fanning S., Leahy M., Sheehan D., (1994) Nucleotide and deduced amino acid sequences of Rhizobium meliloti 102F34 lacZ gene: comparisonwith prokariotic beta-galactosidases and human beta-glucuronidase., Gene., 141, 91−94.
- Gebler J.C., Aebersold R., Withers S.G., (1992)
- J.biol.Chem., 267, 11 126−11 130.
- Fowler A., Zabln I., (1978) Amino acid sequence of ?-galactosidase., J. of Biol. Chemistry., 253, 5521−5525.
- Gekas V., Lopez-Leiva M., (1985) Hydrolysis of lactose: a literature review., Process Biochemistry, 20, 2−11.
- Goodman R., Pederson D., (1975) ?-Galactosidase from Bacillus stearothermophilus., Can. J. of Microbiol., 22, 817−825.
- Gilbert H.J., Hall J., (1987) Molecular cloning of Streptococcus bovis lactos catabolic genes., J. of General Microbiology, 133, 2285−2293.
- Gutshall K.R., TrimburD.E., KasmirJ.J., Brenchley J. E., (1995) Analisis of a novel gene and ?-galactosidase isozyme from a psychrotrophic Arthrobacter isolate., J.Bacteriol., 177,1981−1988.
- Hamilton I., Lo G., (1978) Co-induction of ?-galactosidase and the lactose-P-enolpyruvate phosphotransferase system in Streptococcus salivarius and Streptococcus mutans., J. of Bacteriol., 136, 900−908.
- Hancock K.R., Rockman E., Young C., Pearce L., Maddox I., Scott D.B., (1991) Expression and Nucleotid Sequence of the Clostridium acetobutilicum ?-galactosidase gene cloned in Escherichia coli. J. of Bacteriology, 173, 3084−3095.
- Heller K., Roschenthaler R., (1978) ?-galactosidase galactohydrolase of Streptococcus faecalis and the inhibition of its syntesis by glucose., Canadian J. of Microbiol., 24, 512−519.
- Henrissat B., Bairoch A., (1993) New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem.J. 293, 781−788.
- Henrissat B., (1991) A classification of glycosyl hydrolasesft based on amino acid sequence similarities., Biochem. J., 280, 309−316.
- Henrissat B., (1991) Sequence homology between (5-galactosidase and some (5-glucosidase., Protein sequences Data anal., 4, 61−62.
- Hengstenberg W., Penberthy W., Hill K., Morse M., (1969) Phosphotransferase system of Staphylococcus aureus: its requirment for the accumulation and metabolism of galactosides., J. of Bacterid., 99, 383−388.
- Herrchen M., Legler G., (1984) Identification of an essential carboxylate group at the active site of lacZ beta-galactosidase from Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 138, 527−531.ft
- Herman R.E., McKay L.L., (1986) Cloning and expression of the J3-galactosidase gene from Streptococcus thermophilus in Escherichia coli., Appl. Environ. Microbiol., 52, 45−50.
- Hirata H., Negoro S., Okada H., (1984) Molecular basis of isozyme formation of p-galactosidases in Bacillus stearothermophilus: isolation of two p-galactosidase genes, bgaA and bgaB., J. of Bacterid., 160, 9−14.
- Hirata H., Fukazawa T., Negoro S., Okada H., (1986) Structure of a p-galactosidase gene of Bacillus stearothermophilus., J. of Bacterid., 166, 722−727.
- Hyun H.H., Zeikus J.G., (1985) Regulation and genetic enchancement of glucoamylase and pullulanase production in Clostridium thermohydrosulfuricum., J. of Bacteriogy, 164, N3,1146−1152.
- Huber R., Gaunt M., Hurlburt K., (1984) Binding and
- Reactivity at the «Glucose» site of galactosyl-fJ-galactosidase (E.coli), Archives of Biochem. and Biophys., 234, 151−160.
- Jacobson R.H., Zhang X-J., DuBose R.F., Matthews B.W., (1994) Three-dimentsional structure of 0-galactosidase from E.coli., Nature, 369,761−766.
- Kobayashi T., Hirose Y., Ohmiga K., Shimizy S., (1978) Thermostable p-galactosidase from Bacillus acidocaldarius and its immobilization., J. Ferment. Thecnol., 56, 309−314.
- Kobayashi T., Shiizu T., Hayashi H., (1995) Transcriptional analysis of beta-galactosidase gene (pbg) in Clostridium perfringens., FEMS Microbiol. Lett., 133, 65−69.
- Kalnins A., Otto K., Ruther U., Muller-Hill B., (1983) Sequence of the lacZ gene of Escherichia coli., EMBO J., 2, 593−597.
- Laemmli U.K., (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriphage T4., Nature, 227, 680−685.
- Lee L., Hansen J.B., Yagustyn-Krynicka K., Chassy B.M. (1982) Cloning and expression of the 0-D-Phosphogalactoside Galactogydrolase gene of Lactobacillus casei in Esherichia coli
- K-12, J. of Bacteriol., 152, N3, 1138−1146.
- Leon-Morgentaler P., Zwahlen M., Hottinger H., (1991)1.ctose metaoolism in Lactobacillus bulgaricus: analysis of the primary structure and expression of the genes involved., J. of Bacteriology, 173, 1951−1957.
- LindD.L., Daniel R.M., Cowan D. A., Morgan H.W., (1989) ?-galactosidase from a strain of anaerobic thermophile, Thermoanaerobacter. Enzym.Microb.Technol., 11, 180−186.
- Little S., Caartwright P., Campblele C., ZPrenneta A., Mc Chesney Y., Mountain A., Robinson M., (1989) Nucleotid sequence of a thermostable beta-galactosidase from Sulfolobus solfataricus., Nucleic Acids Res., 17, 7980.
- Love D.R., Fisher N. Bergquist., (1988) Sequence of the ?-galactosidase gene from Sulfolobus solfataricus., Mol. Gen. Genet., 213, 84−92.
- Maeda S., Gasson M.J., (1986) Cloning, expression and location of the Streptococcus lactis gene for ?-D-galactosidase. J. of General. Microbiol., 132, 331−340.
- Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J., (1982) Molecular cloning: a laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
- Melasniemi H., (1987) Characterization of a-amylase and pullulanase activities of Clostridium thermohydrosulfuricum., Biochem. J., 246, 193−197.
- Mohamed A., Diwany A., Slem M., Shaker H., (1986) Stadies on ?-galactosidase from Bacillus stearothermophilus NRC 16., Deutche Lebensmittel-Rundschau, 82, 53−56.
- Ohtsuka K., Tanoh A., Ozawa 0., Kanematsu T., Uchida T., Shinke R., (1990) Purification and Properties of a p-galactosidase with high galactosyl transfer activity from Cryptococcus laurentii Okn-4., J. Ferment, and Bioeng., 70, 301−307.
- Ovsejevi K., Brena B., Batistaviera F., Carisson J., (1995) Immobilization of p-galactosidase on thiosulfonate-agarose., Enzyme Microb. Technol., 17, 151−156.
- Pisani F.M., Rella R., Raia C.A., Rosso C., Nucci R., Gambacorta A., De Rosa M., Rossi M., (1990) Thermostable p-galactosidase from the archaebacterium Sulfolobus solfataricus. Purification and properties., J. Biochem., 187, 321−328.
- Pitcer W.H., Fiord J. R., WeetallH.H., (1976) Metods in Enzymology: Immobilized enzymes., Ed. K. Mosbach N. Y.- Acad. Press, 44, 782−798.
- Poch 0., Hote H., Dallery V., Debeaux F., Fleer R., Sodoyer R., (1992) Seqence of the Kluyveromyces lactis p-galactosidase: comparison with procariotic enzymes and secondary structure analysis., Gene, 118, 55−63.
- Polard H., Steers E., (1973) Bacillus megaterium KM pgalactosidase: purification by affinity chromatography and characterisation of the active species.,, Arch. Biochem. Biophys., 158, 650−661.
- Rainey F., Ward N., Morgan H., Toalster R., Stackebrandt E., (1993) Phylogenettic Analisis of Anaerobic Thermophilic Bacteria: Aid for THeir Reclassificatien., J. of Bacteriol., 175, 4772−4779.
- Ramona R.M.V., Dutta S.M., (1981) Purification and properties of p-galactosidase from Streptococcus thermophilus., J. Food Sci., 46, 1419−1421.
- Ring M., Huber R.E., (1990) Multiple replacements astablish the importance of Tyr-503 in p-galactosidase (Escherichia coli), Arch. Biochem. Biophys., 283, 342−350.
- Rogalski J., Lobarzewski J., (1995) The purification andftimmobilization of Penicillum Notatum (S-galactosidase., Acta bionechnol., 15, 211−222.
- Saito T., Honda H., Iijima S., Kobayashi T., (1989) Isoltion of thermostable p-galactosidase gene from a thermophilic anaerobe and its expression in Escherichia coli. Enzyme Microb. Technol., 11, 302−305.
- Saito T., Suzuki T., LKijima S., Kobayashi T., (1992) J. Ferment. Bioeng., 73, 51−53.
- Sanger F., Nicken S. and Coulson A. R., (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. (Wash), 74, 5463−5467.
- Sammer, Zdeno, Nurna J., Grones J., (1991) Cloning and expression of the p-D-galactosidase gene from Lactobacilluslactis in Escherichia coli., Biologia, 46, 299−304.
- Schmidt B.F., Adams R.M., Requadt C., Power S., Mainzer
- S.,(1989) Expression and nucleotide sequence of the Lactobacillus bulgaricus ?-galactosidase gene cloned in Escherichia coli., J. of Bacteriology, 171, 625−635.
- Selim M., Badr El-Din S., Elshafei A., Badr El-Din S., (1986) ?-Galactosidase from Bacillus Stearothermophilus NRC-16., Deutche Lebensmittel- Rundschau, 82, 259−261.
- Smart J., (1991) Transferase reactions of the ?-galactosidase from Streptoioccus thermophilus., Appl. Microbiol. Biotechnol., 34, 495−501.
- Stokes H., Betts P., Hall, (1985) Sequence of the ebgA gene of Escherichia coli: comparison with the lac Z gene., Molecular biol. and evol., 2, 469−477.
- Sutcliffe J., (1979) Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symp. Quqnt. Biol. 43, 77.
- Torres M.J., Lee B.H., (1995) Cloning and expresiion of beta-galactosidase from psychotrophic Bacillus subtilis KL88 into Escherichia coli., Biotechnol Lett, 17, 123−128.
- Torres M.J., Lee B.H., (1995) Expression of0 beta-galactosidase gehe from Lactobacillus sake in Escherichia coli., Biothechnol. Lett., 17, 693−698.
- Ulrich J.T., Mc Feters G. A., Temple K.L., (1972) Induction and characterisation of ?-galactosidase in an extremal thermophile., J. Bacteriol., 110, 691−698.
- Uwajima T., Tekeda 0., Yagi H., (1972) Purification, cristalisation and some properties of ?-galactoidas from Saccharomyces fragil is., Arg. Biol. Chem., 36, 570−577.
- Wan L.G., Vanhuystee R.B., (1994) Novel method to detect beta-galactosidase by a dot-blotting assay on nitrocellulose membrane using 6-bromo-2-naphthyl beta-D-galactopyranoside as substrate., J. Arg. Food Chem., 42, 2499−2501.
- Widmer F., Leuba J., (1979) ?-Galactosidase from Aspergillus niger. Separation and characterisation of three multipe forms., Eur. J. Biochem., 100, 559−567.
- Wondolowski M., Woyehic Y., (1974) Characterisation and immobilization of E.coli (ATCC-26) ?-galactosidase., Biothechnol. and Bioeng., 12, 1633−1646.
- Wongmadden S.T., Landry D., (1995) Purification and characterization of novel glycosidases from the bacterial genus Xanthomonas., Glycobiology, 5, 19−28.
- Yanisch-Perron C., Viera J., Messing J., (1985) Improved M13 phage closing vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors, Gene, 33, 103−119.
- Yana ira S., Kobayachi T., Suguri T., Nakakoshi M., Miura S., Ishikawa H., Nakajima I., (1995) Formation ofoligosaccharides from lactose by Bacillus circulans beta-galactosudase., Biosci. Biothecnol. Biochem., 59, 1021−1026.
- You P.L., Smart J.B., Ennls B.M., (1987) Differential induction of ?-galactosidase and phospho-?-galactosidase activities in the fermantation of whey permeate by Clostridium acetobutilicum., Appl. Microbiol. Biotechnol., 26, 254−257.
- Jefferson R.A., Burgess S.M., Hirsh D., (1986) ?-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion market. Proc. Natl Acad. Sei. USA, 81, 414−418.
- Gallager P.M., D’Amor, Lund S.D., Ganschow R.E., (1988), The complete sequence of murine ?-glucuronidase mRNA and its deduced polipeptide. Genomics 2, 215−219.