Актуальность работы.
В последние годы для лечения злокачественных новообразований (как солидных, так и гематологических) и ряда неопухолевых заболеваний (наследственные болезни, болезни обмена, системные заболевания соединительной ткани) стали достаточно широко использоваться сверхинтенсивные курсы химиотерапии (высокодозная химиотерапия) с последующим восстановлением кроветворения трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток.
Гемопоэтические клетки для трансплантации могут быть получены у однояйцового HLA-идентичного близнеца (сингенная трансплантация), родственного или неродственного донора, совместимого по основным антигенам HLA (аллогенная трансплантация) или у самого больного (аутологичная трансплантация). До недавнего времени во всех вышеперечисленных случаях гемопоэтические клетки получали из костного мозга и/или периферической крови [14], однако данные методики не лишены существенных недостатков. В связи с риском развития смертельно опасной реакции «трансплантат против хозяина при проведении аллогенной трансплантации необходимо наличие HLA-совместимого донора. В этом отношении идеальными донорами гемопоэтических стволовых клеток являются HLA-идентичные доноры-близнецы. Однако такая возможность имеется лишь у единичных больных и в данном случае отсутствует реакция «трансплантат против опухоли». Совместимого по основным локусам HLA-системы родственного донора имеют лишь 30−40% больных, а шанс на подбор неродственного донора еще более ограничен. Использование аутологичных стволовых клеток, полученных в период уже существующей болезни, несет в себе потенциальную опасность — возможную контаминацию опухолевыми клетками при ретрансфузии. Кроме того, получение гемопоэтических клеток из костного мозга и из периферической крови требует проведения инвазивных манипуляции и введение лекарственных веществ, представляющих потенциальную опасность для жизни и здоровья донора.
Альтернативным источником репопулирующих гемопоэтических клеток пригодным для трансплантации является пуповинная кровь. Использование пуповинной крови имеет целый ряд преимуществ перед другими источниками кроветворных клеток:
1 .Отсутствует риск для здоровья матери и ребенка (донора).
2. Увеличивается возможность использования не полностью совместимых по HLА-системе (от 1 до 3 антигенов) трансплантатов[40,47].
3.Увеличивается вероятность нахождения редких HLA-типов трансплантатов.
4. Значительно снижается риск передачи некоторых латентных инфекций, передаваемых трансмиссивным путем [71].
5. Появляется относительно недорогая форма биологического страхования жизни в связи с возможностью использования клеток пуповинной крови в качестве аутологичного трансплантата.
В тоже время по принятым стандартам для адекватного восстановления гемопоэза требуется определенное количество гемопоэтических клеток на килограмм веса реципиента. В связи с этим принципиальным недостатком пуповинной крови можно считать малое абсолютное количество гемопоэтических клеток и невозможность повторного получения их от того же донора. По данным литературы из 2100 заготовленных образцов пуповинной крови для реципиентов с массой тела 50−70 кг. потенциальными трансплантатами могли считаться лишь 25%, для реципиентов с массой тела до 35 кг. — 67% и лишь для больных с массой тела ниже 10 кг. —100% [49].
В связи с выше сказанным основной задачей при заготовке пуповинной крови является обеспечение наименьшей потери стволовых клеток. В настоящее время в мире существует несколько методик получения, фракционирования и криоконсервирования пуповинной крови. Актуальностью данного исследования является поиск методов фракционирования, концентрации и состава криопротектора, а так же режима замораживания, способных обеспечить наименьшие потери клеточной массы и её- функциональной активности.
Цель исследования.
Разработать единый технологический процесс, включающий в себя сбор, фракционирование, тестированиекриоконсервирование и архивирование пуповинной крови, подлежащей длительному хранению при ультранизких температурах, способный обеспечить минимальные потери клеточной массы, используя опыт криоконсервации костного мозга и периферических стволовых клеток в банке криоконсервированных биоматериалов ГУ РОНЦ им. Н.Н. БлохинаРАМН.
Задачи исследования.
1. Изучить закрытый способ сбора пуповинной крови.
2. Модифицировать методику закрытого способа сбора пуповинной крови в соответствии с условиями и средствами отечественного здравоохранения:
3. Разработать оптимальную методику фракционирования пуповинной крови:
4. Определить сроки и условия хранения ПК до момента ее обработки.
5. Подобрать оптимальный состав и концентрацию криопротектора.
6. Провести оценку потерь стволовых клеток на этапах фракционирования и криоконсервирования ПК.
7. Разработать оптимальную методику замораживания.
8. Создать компьютерную базу данных для исключения ошибок при архивировании хранящегося биоматериала.
Научная новизна.
Модифицирован закрытый способ сбора пуповинной крови в соответствии с условиями и средствами отечественного здравоохранения. Впервые применены: метод фракционирования ПК в полиглюкине, использование низких концентраций диметилсульфоксида в качестве криопротектора в сочетании с полиглюкином, оригинальная методика замораживания, а также произведена тщательная оценка количественного и качественного состава пуповинной крови на всех этапах обработки биоматериала: Впервые создана компьютерная база данных для архивирования пуповинной крови.
Практическая значимость работы.
Разработан легко осуществимый и эффективный единый технологический процесс заготовки пуповинной крови, подлежащей длительному хранению при ультранизких температурах, не требующий дорогостоящего оборудования и особой1 подготовки медицинского персонала. Модифицирована методика закрытого способа забора пуповинной крови. Разработаны методы сепарации и криоконсервирования пуповинной крови с использованием общедоступных реактивов и оборудования, обладающих высокой эффективностью и небольшой себестоимостью.
Проведенные исследования позволили оценить необходимость использования различных лабораторных исследований на всех этапах криоконсервания пуповинной крови. Все это в комплексе с компьютерной базой данных позволило создать банк пуповинной крови (300 образцов). Получено решение о выдаче патента на изобретение «Способ криоконсервирования пуповинной крови» (заявка № 2 004 116 209).
Выводы.
V Показано, что разработанный нами единый технологический процесс сборам тестирования, фракционирования и замораживания пуповинной крови в совокупности с разработанным алгоритмом действий медицинского персонала на всех этапах эффективен, надежен, прост в исполнении' и может широко использоваться? в клинической практике отечественного здравоохранения (на основе данных методик создан действующий банк пуповинной крови).
S Показано^ что для сбора ПК можно использовать стандартные строенные контейнеры для забора донорской крови (500/300/300) с антикоагулянтом^ фирмы «Baxter», из которых антикоагулянт не удаляется, а используется полностью. Контейнеры фирмы «Baxter» более надежны в применении.
S Выявлена и доказана прямая зависимость между числом ЯСК и объемом собранной ПК. Тем не менее при ' решении вопроса о возможности дальнейшего хранения малых объемов ПК следует ориентироваться не на объему, а на абсолютное количество ядросодержащих клеток в эксфузате:
S Впервые установлена обратная корреляция эффективности фракционирования от времени хранения пуповинной крови с момента забора до момента начала ее обработкиДля более успешного выделения ядросодержащих клеток из ПК время хранения биоматериала должно быть минимально и не превышать 24 часов.
S Впервые был применен полиглюкин для фракционирования пуповинной крови. Доказана его высокая эффективность, как седиментирующего вещества (процент выделенных — ЯСК 86,2±7,34%, процент удаленных эритроцитов — 95,95±3,68%). Установлено, что для выделения ядросодержащих клеток с минимальными потерями и более полного осаждения эритроцитов, целесообразно использовать полиглюкин при добавлении к ПК в соотношении 1:1.
S Показано, что использование осадкаполученного после фракционирования пуповинной крови и обедненного лейкоцитарной^ фракцией, в качестве образцов для различных анализов значительно уменьшает потери ядросодержащих клеток.
S Доказано, что применение 5% концентрации ДМСО в сочетании с полиглюкином обеспечивает полноценность криопротекции без потерь функциональной активности гемопоэтических клеток. s Доказано, что замораживание ПК в криобоксе в парах жидкого азота эффективно (потерь ЯСК не было, % жизнеспособных лейкоцитов после размораживания 92,81±3,20%), надежно (исключает человеческий фактор, отказ электроники, перебои в электроснабжении) и: не требует дорогостоящей аппаратуры.
S Показано, что впервые созданная и протестированная нами компьютерная база данных для хранения информации о большом количестве образцов пуповинной крови (20 000), позволяет исключить ошибки, ускорить поиск нужной информации и облегчить труд персонала.
