Гидролиз амидных связей в различных веществах, главным образом белках, катализируется многочисленными ферментами, амидгидролазами. Амидгидролазы встречаются в растениях и во всех без исключения животных организмах. В частности, к группе сериновых амидгидролаз относятся протеазы системы свертывания крови, протеазы системы первичпого отклика иммунного ответа у позвоночных, важные ферменты пищеварительного трактаа-химотрипсин, и др. Реакции ферментативного гидролиза являются чрезвычайно эффективными и не могут быть воспроизведены неферментативным путем [Волькенштейн, Соболев, Голованов, 1982]. Для сравнения: период полупревращения амидной связи в воде составляет 3 года, время неферментативной, но катализируемой реакции составляет около 3 часов, скорость ферментативной реакции 10~8−4-1с. Поэтому очень много внимания уделяется изучению функционирования ферментов, влиянию внешних факторов, предпринимаются попытки их использования для манипуляций с отдельными молекулами в нанобиотехнологиях [Yakushevich, 1998]. Избирательность и высокая скорость биологического ферментативного катализа определяется строением макромолекулы фермента [Антонов, 1983], [Попов, 2000]. Структура (первичная и пространственная) фермента обеспечивает эффективность каждого этапа реакции фермент-субстратного взаимодействия [Ebeling, Romanovsky, Schimansky-Geier, 2003], [Попов, 2000]: скорость диффузионного проникновения (выхода) субстрата в (из) активный (ого) центр (а) фермента на первом (последнем) этапе увеличивается за счет неоднородного электростатического поля, создаваемого активным центром и поверхностью фермента, связывание субстрата сорбциоиными участками обеспечивает взаимную ориентацию расщепляемых групп и каталитически активных групп фермента, необходимую для эффективного химического превращения субстрата в каталитическом центре фермента. Времена диффузионных процессов проникновения и выхода субстрата составляют 10~8с, диффузионные процессы можно с хорошей точностью описать диффузионными методами и методами молекулярной динамики [Ebeling, Romanovsky, Schimansky-Geier, 2003]. Связывание субстрата в активном центре фермента предполагает ряд конформационных перестроек фермента, время каждой перестройки составляет 10″ 2-г104с. По-видимому, конформационные изменения являются лимитирующей стадией и дают преимущественный вклад в экспериментально наблюдаемые константы скорости. Конформационные перестройки, связанные с сорбцией субстрата хорошо описываются полуэмпирическими методами конформациоиного анализа [Попов, 2000]. Времена химических превращений ферментативных реакций достигают диффузионно-контролируемых 10″ 8с. Стадию цепочки химических превращений субстрата запускает самосогласованные процессы миграции протона угидроксилыюй группы Serl95 из водородной связи каталитического центра (Ser95)OrН.Ns2(His57) к атому азота расщепляемой связи субстрата и образования связи между атомом кислорода серина и атомом углерода субстрата (Ser9S)Or — С'(PI). Описание химического взаимодействия между субстратом и ферментом возможно только на основе квантовых методов. Заметим, что переходы протонов играют важную роль и в функционировании ионных каналов биологических мембран [Баумуратова, 2005], [Сапронова, 2004]. В таких задачах используются дискретный подход квантовой химии и континуальный подход физики сплошных сред. Во многих случаях переходы протонов являются спусковым механизмом фазовых и конформациопных переходов в различных биологических, физических и композитных системах. Несмотря на то, что между разными подгруппами сериновых амидгидролаз (протеазы поджелудочной железы, ферменты крови, ферменты беспозвоночных, бактериальные амидгидролазы) практически отсутствует гомология первичных структур, наблюдается сходство последовательностей в области каталитического центра, состоящего из аминокислотных остатков Serl95, His57, Aspl02 (в нумерации ахимотрипсина), N-концевого участка. Замены последовательностей (например, Asp на Gly в ацетилхолинэстеразе) при переходе из одной подгруппы в другую носят эквивалентный характер [Антонов, 1991, 1983]. Важно, что ферменты группы сериновых амидгидролаз сходны также в отношении пространственной структуры каталитически важных участков. Сериновые протеазы (а-химотрипсин, эластаза, трипсин, микробные протеазы) имеют двухдоменную структуру. Атомы кислорода (Serl95)0 и азота N (His57) находятся па разных доменах, находящихся в постоянном движении друг относительно друга вследствие столкновений с различного рода молекулами. В случае субтилизинов (к которым принадлежит ацетилхолинэстераза) азот N (His) находится на конце длинной колеблющейся пружинки — а-спирали, другим концом прикрепленной к ферменту. Таким образом, водородная связь (Ser)OH.N (His)no всех сериновых амидгидролазах естественным образом оказывается подверженной влиянию окружения, а ее длина является динамической переменной величиной. В этом состоит причина противоречивости экспериментальных данных о длине водородной связи серии — гистидин. Результат зависит от условий эксперимента. Например, методами рентгеноструктурного анализа [Fersht, Blow, Fastrez, 1973],[Wright, Hess, Blow 1972] в кристаллизованном a — химотрипсине и фермент-ингибиторном комплексе длина водородной связи (Ser)OН.N (His) составляет 3,2А°, полуэмпирическми методами [Попов, 2000] получено значение 1,6Л°, для фермент-субстратного комплекса в полиакриламидном геле методами ЯМР-спектроскопии длина связи составляла 2,5A0 [Cassidy, Lin, Frey, 1997,2000], [Lin, Cassidy, Frey, 1998], [Голубев и др., 1994]. Относительно других связей противоречий не существует. В этих условиях сравнение сериновых амидгидролаз с «молекулярными ножницами» [Blumenfeld, Tikhonov 1994] имеет прямой смысл. Молекулярные ножницы ахимотрипсин «разрезают» связи субстрата совершая режущие движения (движения доменов скрепленных «шарниром»). Модификация фермента и среды, в которой фермент функционирует, может влиять как на частоту колебаний кластеров (режущих движений ножниц), так и на среднюю величину раствора ножниц. Модель «молекулярные ножницы» отвечает концепции «белок-машина» [Чернавский, Чернавская 1999], [Blumenfeld, Tikhonov 1994], [Романовский, Эбелинг (ред.), 2000], которая в настоящий момент получила всеобщее признание. Два относительно жестких домена, соединенные шарниром, исполняют роль рычагов. В макромолекуле фермента, в отличие от машин, энергия запасается и передается не с помощью напряжений и деформаций, а скорее с помощью предопределенного ряда конформациопных переходов. Количественное описание химического взаимодействия между субстратом и ферментом не возможно в рамках концепции «белок-машина». Такое описание возможно только на основе квантовых методов.
Таким образом, пространственная структура ферментов группы сериновых амидгидролаз предопределяет специфическое взаимодействие водородной связи каталитического центра (Ser)OH.N{His) с окружением, которое способствует повышению реакционной способности системы. В данной работе представлен один из возможных теоретических подходов к исследованию механизма миграции протона у-гидроксилыюй группы Serl95 а — химотрипсина в ходе катализа: представление водородной связи (Ser)OH.N (His) каталитического центра в виде квантовой открытой для специфического воздействия окружения системы.
Цели и задачи диссертационной работы.
• Исследовать влияние пространственной структуры фермента а-химотрипсина и тепловых флуктуаций микроокружения на эффективность работы каталитического центра.
• Построить и проанализировать модель каталитического центра ахимотрипсина в виде квантовой системы, открытой для влияния окружения.
• Разработать и реализовать универсальный численный метод, позволяющий рассчитывать эволюцию открытой системы во внешнем поле любого типа.
• Применить разработанную программу для расчета динамики протона в водородной связи каталитического центра в шумовом поле окружения.
• Провести параллель с классическими и квазиклассическими методами расчета скорости перехода протона через потенциальный барьер.
• С помощью численных расчетов и анализа выявить набор динамических режимов, которым подчиняется эволюция квантовой открытой системы.
— водородная связь каталитического центра — в шумовом поле с параметрами, определяемыми условиями функционирования фермента.
• Установить степень соответствия с результатами экспериментов по исследованию положения мостиковых протонов каталитической триады методами .ЯМР-спектроскопии.
Научная новизна работы.
• Разработан метод на основе классической формулы Крамерса с квантовыми поправками и учетом цветного шума для оценки эффективного барьера, скоростей перехода через барьер, критической температуры, разделяющей квантовый и классический режимы, в стохастическом потенциале.
• Каталитический центр рассмотрен как квантовая открытая для шумового окружения система. Для численного расчета эволюции квантовой открытой системы — водородной связи каталитического центрапредложен модифицированный спектральный метод расщепления оператора эволюции. Для анализа результатов численного эксперимента предложена схема, аналогичная квазиэнергетическому подходу Флоке.
• Показано, что внешнее поле водородной связи каталитического центра играет решающую роль в ускорении стадии переноса протона в процессе гидролиза.
• Показано, что влияние стохастической кластерной динамики приводит к образованию квазисимметричной пизкобарьерной водородной связи (Serl95)O.H.N (His57), обнаруженной в эксперименте в растворе методами ЯМР-спектроскопии.
Научная и практическая ценность работы.
Работа представляет научную ценность, т.к. в пей:
• прослежена стохастическая динамика протона в шумовом поле окружения,.
• установлена связь между пространственной структурой ферментов группы сериновых амидгидролаз и скоростью переноса протона,.
• определена степень влияния внешних факторов, приводящих к изменению подвижности фермента и температуры среды,.
Методы, предложенные в работе, могут помочь в выборе стратегии и определении параметров соответствующих биофизических экспериментов. Защищаемые положения:
1 Одно из важных динамических свойств пространственной структуры «молекулярных ножниц» сериновых амидгидролаз состоит в том, что она служит для передачи в асимметричную водородную связь каталитического центра (Ser95)0-H.N (His 57) тепловых и столкновительных процессов взаимодействия с окружением, которое способствует значительному увеличению скорости перехода протона в водородной связи.
2 Расчет и анализ временной эволюции квантовой открытой системы каталитического центра, а — химотрипсина в шумовом поле окружения показал, что в системе реализуются те динамические режимы, в которых происходит равнораспределение протона в водородной связи (LHB-режимы).
3 Метод симметризации оператора эволюции совместно с Флоке-анализом и квазиклассическими оценками, является эффективным методом исследования эволюции квантовой открытой системы в условиях нестационарного внешнего поля.
Апробация работы и публикации.
Основные результаты диссертационной работы опубликованы в шести статьях в отечественных и зарубежных изданиях [Grishanin, Chikishev, Romanovsky, Shuvalova, 2000], [Шувалова, Кубасов, Романовский, Чикишев, 2000], [Гришапин, Чикишев, Шувалова, 2000], [Романовский, Шувалова, 2002], [Chikishev, Grishanin, Shuvalova, 2003], [Shuvalova, 2003]. Докладывались на пяти международных конференциях с опубликованием тезисов: Международная конференция аспирантов и студентов по фундаментальным наукам «Ломоносов-99» (апрель1999) — 2-ой Всероссийский биофизический съезд (август 1999) — 9-я Международная конференция «Математика. Компьютер. Образование» (Пущино, 20−25 января 2002 г.) — The 7th World Multi.
Conference on Systemics, Cybernetics and Informatics Orlando, Florida, USA (27−30 july 2003) — III СЪЕЗД БИОФИЗИКОВ РОССИИ (Воронеж, 24−29 июня 2004 г.). Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы и четырех приложений. Первая глава посвящена биологическим проблемам и биологическому описанию фермента, а — химотрипсина. Во второй главе производится биофизическая постановка задачи. В третьей главе изложены физические методы решения поставленной задачи. В четвертой главе изложены результаты численного расчета и анализ результатов. Общий объем работы составляет W страниц текста, с включенными рисунками. Число таблиц Приложение 2 содержит рисунков, приложение содержит J рисунков и приложение 4 содержит J рисунков. В Приложении 1 находятся общие сведения, такие как масса протона и т. п. Библиография состоит из наименований. Содержание работы:
4.11 Выводы.
4.11.1 По аналогии с подходом Флоке для системы в периодическом внешнем поле, для анализа спектров вероятности переходов протона в системе с периодическим управляющим воздействием предложена схема, основанная на знании зависимости частот Q" 0 в V+(r,^ = +s) потенциале и Q" 0 в V (r, 4 = -s) потенциале от амплитуды S (АЧХ) и общего вида квазиэнергетического спектра в периодическом поле с параметрами су" (S).
Qlm (S, nj = Q’l0(S) + mme, m = 0X.-^J. с.
4.11.2 На АЧХ отклика открытой системы на стохастическое внешнее поле с параметрами можно выделить 5 областей, характеризующих различное поведение зависимости вероятности туннелирования от времени (или зависимости корреляционной функции протона от времени).
А) Адиабатическая. В зависимости корреляционной функции от времени хорошо различимы области, когда туннелирование происходит в (V+) области (частота туннелирования увеличена 0)) и.
V-) области (частота туннелирования уменьшена Для адиабатической области характерно, что область изменения к.ф. ДР±- = 1.
D) Харамсри^сгсл чередованием быстрого изменения к. ф «(V+) области (АР+ =1) и медленным изменением к.ф. в (V-) области (АР «1). Происходит локализация протона на определенное время Дт. Частица может локализоваться как в одной и той же яме, так и попеременно то в одной яме. то в другой в зависимости от параметров ^оТ,^.
B) В (V+) области все туннельные уровни лежат выше барьера (ДРт < 1), в (V-) области, набор частот соответствует высшим состояниям Ol (S)J>lA? =1.
C) Аналогично В), но область изменения к.ф. ДР±- < 1.
E, F) Высокочастотная область. Частота туннелирования увеличена, по сравнению со стационарным туннелированием. В области Е (ДР±- < 1) существуют узкие полоски резонапсов F с межуровневыми переходами. G) Появляется эффект вибрационной релаксации к уровню '/г (междублетные переходы) в дополнение к туннелированию с частотами (внутридублетные переходы). Релаксация сопровождается ростом полной энергии протона E (t). Время релаксации т (^о7,со0) совпадает со временем достижения энергии протона значения, превышающего барьер. Скорость релаксации т" 1 определяет классическую скорость перехода гс1(^ст7,со0). Аналогично G. Но в этой области происходит повышение энергии до неестественно высокого значения. Это связано с тем, что в стационарном, а потенциале длина водородной связи Serl95-OH.N-His57: L = 2,71A. о.
Если амплитуда внешнего сигнала Jcr, >1,355/1, то в области (V+) потенциала атомы (Serl95)0 и N (His57) должны бы сблизиться на бесконечно малое расстояние, при этом согласно принципу неопределенности энергия протона должна бы стать бесконечно большой. В реальности энергия протона не становится бесконечной, а происходит необратимый уход протона из водородной связи. 4.11.3 В стаииоанярнпм асимметричном потенциале (Глава 2) классическое время перехода частицы из более глубокой ямы в более мелкую тс1 =108с «9лет, а туннелирование возможно только с третьего уровня. В асимметричном потенциале с параметрическим периодическим внешним о воздействием при амплитуде воздействия S>0.04A локализация протона в глубокой яме нарушается, т.к. протон в (У+)потеициале оказывается в низкобарьерном потенциале, а (У-)потенциале переходит на высшие состояния: rqv = Qe. В стохастическом потенциале в цветном шумовом барьер и переход протона определяется классической скоростью. 4.11.4 В асимметричном потенциале, находящемся во внешнем нестационарном периодическом или шумовом поле, влияние асимметрии на динамику протона в нестационарном потенциале уменьшается или сводится к нулю.
4.11.5 Изменяя форму и параметры (длительность, период) импульсов можно:
• Создавать локализацию протона в любой из ям и на необходимое время (уменьшать квантовую частоту туннелирования);
• Создавать условия низко-барьерного потенциала (увеличивать квантовую частоту туннелирования);
4.11.6 Поскольку именно связь (Serl95)O.H.N (His57) является звеном чувствительным к внешним воздействиям, при соответствующих предположениях, связанных со спецификой исследуемой системы, рассмотрение одномерной водородной связи (Serl95)O.H.N (His57) оказалось достаточным, чтобы объяснить образование квазисимметричной низко — барьерной водородной связи, обнаруженной в ходе эксперимента ЯМР — спектроскопии, и предположить возможность контролировать скорость гидролиза искусственным образом, с помощью лазерного импульсного поля.
4.12Задачи будущего моделирования.
В образовавшейся в результате посадки субстрата устойчивой конформации белка, как следует из результатов, полученных методами конформационного анализа, и кристаллографии, потенциал связи (Serl95)0-H.N (His57) остается асимметричным. Если бы атомы кислорода (Ser95)0 и азота. уУ (Я"-57) каталитического центра а-химотрипсина были бы неподвижны друг относительно друга (т.е. отсутствовала кластерная динамика) переход протона не осуществлялся или происходил бы очень медленно (Классическая скорость Крамерса xd = 10sс"9лет). К счастью, во всех поле исчезает эффективный при ^/о^" (или S) > (или Sc)). сериновых протеазах пространственная структура такова, что водородная связь (Ser)OH.N (His) подвержена в большой степени влиянию окружения и длина связи является переменной величиной. Как было показано в данной работе, именно шумовое окружение «управляет» открытой системой (Serl95)0 -H.N (His57). Область параметров шумового поля позволяет говорить, что диссипативная система (Serl95)0 — H. N (His57) в основном существует в квантовом некогерентном режиме. Эффективный барьер низок или отсутствует (и в симметричном и в асимметричном потенциале).
Динамика протона на низшей границе амплитуд внешнего полястТ < 0, Ыи.
D) в симметричном потенциале характеризуется чередованием быстрого изменения к.ф. в (V+) области и медленным изменением к.ф. в (V-) области. Картина изменения вероятности со временем напоминает картину локализации частицы в работе [Grifoni, Hanggi, 1998]. В отличие от полной локализации частицы в яме, в которой она находилась в начальный MOMeHT[Grifoni, Hanggi, 1998], наша модель управляющего воздействия обеспечивает локализацию протона на определенное время Дт и возможен вариант, когда частица локализуется попеременно то в одной яме, то в другой в зависимости от параметров воздействия. В асимметричном потенциале с первого уровня в глубокой яме туннелирования нет. Классическая скорость в эффективном симметричном потенциале rd < Е1с'], в асимметричном потенциале еще меньше.
При амплитудах 0,1 в (V+) области все туннельные уровни лежат выше барьера (ДР+<1), в (V-) области набор частот соответствует высшим состояниям Q^m (S), j>l, область изменения к.ф. ДР<1. И в симметричном и асимметричном потенциале в области частот внешнего поля Qt. е (10: -П0|4)с~' классическая скорость отличается от квантовой не более, чем на порядок rt/"10~12c. «Контроль» туннелирования происходит с помощью накачки на верхние состояния — релаксации к уровню 1Л или установления равнораспределения протона между ямами. Такое же положение протона фиксировалось в эксперименте ЯМР — спектроскопии и соответствует установлению квазисимметричной низкобарьериой водородной связи.
Следуя выше сказанному, определим временной диапазон, в котором происходит в естественных условиях переход протона: г е (l0″ «12,10~7)r. Т. е. согласуется с временами, полученными в эксперименте сравнимыми с диффузионнными г «10» 9 с (Глава 1).
Поскольку водородная связь (Serl95)0-H.N (His57) является чувствительным к внешним воздействиям звеном, осуществлять управление можно и искусственным образом с помощью импульсов: создавать локализацию протона в любой из ям и на необходимое времясоздавать условия низкобарьерного потенциалаконтролировать скорость накачки на верхние состояния.
Поэтому приоритетной задачей в будущем является развить теорию импульсного управления динамикой протона в водородной связи (Serl95)0 -H.N (His57) в контакте с экспериментом. Второй задачей является переход к трехмерной задаче. И. наконец, необходимо рассчитать нестационарную задачу о поведении водородной связи (Serl95)0-H.N (His57) в сопряжении со связью (Aspl ()2)COO.H.N (His57) (Глава 2).
