Идентификация клинически значимых грибов и диагностика инвазивной грибковой инфекции методом газовой хроматографии

Актуальность темы

исследования.

Как показывают отечественные и зарубежные исследования, в последние годы резко возросло количество микозов, вызванных условно-патогенными грибами у больных с ослабленным иммунитетом, в связи с применением широкого спектра антибиотиков, цитостатиков и глюкокортикостероидов (Романюк Ф.П., 1996; Антонов В. Б., 1995/ Степанова Ж. В., 1990; Brown А.Е. 1990). Все они снижают иммунитет и этим способствуют активизации условно-патогенной флоры, к которой относятся микроскопические грибы.

Среди прочих возбудителей микозов ведущее место занимают грибы рода Candida, вызывающие различные формы кандидоза, в том числе висцеральные и системные (Самсыгина Г. А., 1996). Частота гнойно-воспалительных заболеваний, обусловленных грибами рода Candida, особенно Candida albicans достигает 15% в общей этиологической структере гнойно-воспалительных болезней (Пронина Е.В. 1996). При присоединении кандида-инфекции при любом соматическом заболевании наблюдается значительное ухудшение общего состояния больного, нередко развивается сепсис, протекающий с высокой степенью летальности (Tang С.М., 1992). Причем в 40−60% случаев кандидоз остается нераспознанным или поздно диагностированным, и это значительно усугубляет его прогноз (Самсыгина Г. А., 1996).

Своевременная идентификация и диагностика возбудителя, и как следстие — правильно начатое лечение, с одной стороны может существенно снизить указанную летальность, с другойпредотвратить часто неоправданное назначение высоко токсичных и дорогих препаратов, таких, как амфотерИцин В, при эмпирической терапии.

На современном этапе для идентификации и диагностики грибковой инфекции используются микробиологические, биохимические и серологические тесты. К сожалению, ни один из существующих методов не является универсальным, в высокой степени чувствительным и специфичным для диагностики инвазивных микозов (Matthews R.S., 1993).

Посев крови до сих пор остается основным методом лабораторной диагностики кандидоза, но во многих случах нерезультативен. В зависимости от очага поражения и стадии заболевания частота выделения грибов из гемокультуры больных с инвазивными кандидозами колеблется около 50% (Berenguer J.M., 1993; Telenti А. 1989). Кроме того, идентификация возбудителя в зависимости от вида занимает до 10 суток. Серологические методы имеют недостаточную чувствительность и специфичность, так как у больных с нейтропенией понижен уровень антител (Кубась В.Г., 1992).

Это определило необходимость разработки и развития дополнительного хроматографического метода для идентификации и диагностики грибковой инфекции. Метод газовой хроматографии (ГХ) был выбран из-за его высокой чувствительности, воспроизводимости, экспрессности и относительно невысокой стоимости анализа. Скорость, избирательность и чувствительность ГХ метода делают его очень полезным в клинической микологии. Возможности получения уникальных данных значительно расширяются при использовании газовой хроматографии в комбинации с такими методами, как масс спектрометрия.

Цель и задачи исследования

.

Целью настоящего исследования является:

1. Родовая идентификация основных клинически значимых грибов и видовая идентификация грибов рода Candida методом газовой хроматографии;

2. поиск специфических метаболитов этих микроорганизмов с целью экспресс-диагностики инвазивной грибковой инфекции.

Исходя из поставленной цели предстояло решить следующие задачи:

1) разработать (или адаптировать) методики пробоподготовки биоматериала и оптимизировать параметры ГХ анализа;

2) изучить жирнокислотный и углеводный состав биомассы клеток медицински значимых грибов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Fusarium, Geotrichum, Cryptoccocus, Penicillium, а также Micromonospora, Actinomyces, Nocardia;

3) оценить возможность использования различий в химическом составе вышеперечисленных грибов для их таксономии и идентификации и создать алгоритм идентификации;

4) изучить химический состав метаболитов грибов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Fusarium, Geotrichum, Cryptoccocus, Penicillium и Micromonospora, Actinomyces, Nocardia,;

5) изучить изменения химического состава биологических жидкостей при грибковых инфекциях и оценить диагностическое значение уровня метаболитов в крови и ликворе детей для экспресс-диагностики инвазивных грибковых инфекций;

6) разработать методические рекомендации по экспресс-диагностике инвазивных грибковых инфекций.

Научная новизна работы.

Определен количественный состав моносахаров и жирных кислот биомассы микроорганизмов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Fusarium, Geotrichum, Cryptoccocus, Penicillium, Micromonospora, Actinomyces, Nocardia и показана возможность родовой идентификации по составу жирных кислот клеточной биомассы грибов. Осуществлена видовая идентификация грибов рода Candida по совместному жирнокислотному и моносахаридному составу с применением компьютерной обработки данных.

Изучен качественный состав метаболитов грибов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Fusarium, Geotrichum, Cryptoccocus, Penicillium и Micromonospora, Actinomyces, Nocardia, выявлен спектр их диагностически значимых метаболитов. Показана возможность диагностики грибковой инфекции на ранних стадиях заболевания.

Практическая значимость.

Разработан и внедрен в практику адаптированный к условиям клинической лаборатории метод видовой идентификации чистых культур грибов рода Candida. Разработаны и внедрены в практическое здравоохранение методы экспресс-диагностики инвазивных грибковых инфекций на ранних этапах заболевания, а также газохроматографический мониторинг противогрибковой терапии, что позволило улучшить диагностику и лечение данной патологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Идентификация различных грибов на основании различия химического состава их биомассы в целях хемодифференциации с применением персонального компьютера.

2. Экспресс-диагностика инвазивной грибковой инфекции по специфическим метаболитам грибов с помощью газовой хроматографии и масс-спектрометрии.

Внедрение в практику полученных результатов было осуществлено в 1994 г. в отделениях хирургии, терапии, реанимации и интенсивной терапии Детской городской клинической больницы N13 им. Н. Ф. Филатова, на кафедре детской хирургии и ортопедии Российского государственного медицинского университета, а также в клиниках гематологии/онкологии и иммунологии НИИ Детской гематологии Минздравмедпрома РФ. Изданы методические рекомендации, утвержденные Минздравом РФ «Диагностика грибковой инфекции методом газо-жидкостной хроматографии» Ы96/131 (1997).

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 8 международных симпозиумах и конференциях, а именно: •б-й Международный конгресс по инфекционным болезням, Прага, 1994 .

•7-й Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным болезням, Вена, 1995.

•3-е Совещание европейского химиотерапевтического общества по инфекционным заболеваниям, Париж, 1995 г.

•Международный микологический симпозиум «Патогенез, диагностика и терапия микозов и микогенной аллергии», С. Петербург, 199 6 г.;

•Международная конференция «Человек и лекарство», Москва, 1996 г. ;

•4-е Совещание европейского химиотерапевтического общества по инфекционным заболеваниям, Афины, 1996 г.;

•Ъ-е Совещание европейского химиотерапевтического общества по инфекционным заболеваниям, С.-Петербург, 1997 г.: •2 0 Международный конгресс по химиотерапии и инфекционным болезням, Сидней, Австралия, 1997 г.- а также на научно-клинических конференциях академической группы акадкмика АМН РФ, профессора Ю. Ф. Исакова и Детской городской клинической больницы N13 им. H.Ф.Филатова.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 14 работ, в том числе 5 статей в центральных журналах:

1. Идентификация грибов по клеточным моносахарам методом газожидкостной хроматографии, Поздоровкина В. В., Демина A.M., Рогатина E.JI., Радюшина Т. В, Минаев В. А., Белобородова Н. В., Курчавов В. А., Антибиотики и химиотерапия, 1994, т.39, с.17−21.

2. Анализ высших жирных кислот грибов рода Candida методом газовой хроматографии, Поздоровкина В. В., Демина A.M., Белобородова Н. В., Курчавов В. А., Рогатина E.JI., Минаев В. А., Антибиотики и химиотерапия, 1994, т.39, с.13−17.

3. Determination of volatile fatty acids — metabolites anaerobes in the urine with the purpose of diagnostic of appendicitis in paediatrics, Pozdorovkina V.V., Beloborodova N.V., Kucherov U.I., In: 6-th International Congress for Infectious Diseases, Prague, 1994, p.117.

4. Госпитальная инфекция и стратегия антибиотикотерапии в детской хирургической клинике, Поздоровкина В. В., Белобородова Н. В., В сб. тез. 8-го Всероссийского Съезда хирургов, 1995, Краснодар, с.437−438.

5. Determination of anaerobic bacteria involved in perinatal pneumonia in neonates with prolonged artificial ventilation by GC-method, Pozdorovkina V.V., Beloborodova N.V., Koroleva O.V., In. 7 European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Abstracts, Vienna, 1995, p.238.

6. Возможность использования газовой хроматографии для экспресс-диагностики осложнений у детей с нейтропенией, Поздоровкина В. В., Белобородова Н. В., Курчавов В. А., Рогатина E.JI., В сб. тез. 3 Международного микологического симпозиума, 1996, С.-Петербург, с. 2.

7. Газо-хроматографическое определение этиологической роли анаэробов в развитии пневмонии у новорожденных высокого риска, находящихся на искуственной вентиляции легких, Поздоровкина В. В., Белобородова Н. В., Королева О. В., Российский вестник перинатологии и педиатрии, 1995, т.40, с.24−28 .

8. Possibility of using the GC-method in the study of invasive infection due to Candida species, Pozdorovkina V.V., Beloborodova N.V., Kurchavov V.A., Rogatina E.L., Djemina.

A.M., In: 3-nd Scientific Meeting of European society of Chemotherapy Inf. Dis., Paris, 1995, p.72.

9. Сравнительный анализ продуктов метаболизма Candida albicans и других клинически значимых грибов методом газовой хроматографии, Поздоровкина В. В., Демина A.M., Белобородова Н. В., Курчавов В. А., Рогатина Е. Л., Ходорковская В. А., Кульганек В. В., Титкова Н. Ф., Антибиотики и химиотерапия,.

1996, т.41, с.39−46.

10. New approaches in diagnosing of fungal meningitis in children, Pozdorovkina V.V., Beloborodova N.V., Kurchavov V.A., In:3-nd Scientific Meeting of European society of Chemotherapy Inf. Dis., Athenes, 1996, p.38.

11. Identification of Candida species according to their cellular carbohydrates and fatty acids composition by GC-method, Pozdorovkina V.V., Djemina A.M., In: 20-th International congress of chemotherapy, Sydney, Australia,.

1997,p.86.

12. Газохроматографическая экспресс-диагностика кандидоза и мониторинг эффективности противогрибковой терапии по уровню арабинитола и маннозы у детей, Поздоровкина В. В., Белобородова Н. В., Курчавов В. А., Бойко Н. Б., Рогатина Е. Л., Демина A.M., Антибиотики и химиотерапия (в печати).

13. Диагностика грибковой инфекции у детей методом газожидкостной хроматографии, Методические рекомендации.

N 96/131, Поздоровкина В. В., Белобородова Н. В., Курчавов.

B.А., Бойко Н. Б., Рогатина Е. Л., Демина A.M. и другие, 1997, 20с.

14. Диагностика анаэробной инфекции у детей методом хроматографии, Методические рекомендации N 96/130, Поздоровкина В. В., Белобородова Н. В., Курчавов В. А., Бойко Н. Б., Рогатина Е. Л., Демина A.M. и другие, 1997, 20с.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана на русском языке, на 159 страницах машинописи, состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, методических рекомендаций, приложений и указателя литературы. Библиография включает 185 источников, в том числе 23 работы отечественных авторов и 162 работы зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 2 8 таблицами и 9 рисунками.

Выводы.

1. Установлены различия в химическом составе биомассы клеток клинически значимыхгрибов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Micromonospora, Streptomyces, Nocardia, Fusarium, Geotrichum, Cryptoccocus, Penicillium, Torulopsis с использованием метода газовой хроматографии. Определены веществ — маркеры, специфичные для отдельных родов грибов: для грибов Candida — гептадеценовая кислота,.

— для грибов рода Mucor — эйкозеновая кислота,.

— для Nocardia asteroides — туберкулостеариновая кислота,.

— для Streptomyces albus — изогексадекановая и антоизогептадекановая кислоты.

2. Родовая идентификации грибов возможна по жирнокислотному составу биомассы. Видовая идентификация 12 5 штаммов грибов рода Candida: С. albicans, С. tropicalis, C. krusei, C. kefyr, С. parapsilosis, C. glabrata проведена на основании совместного анализа их жирнокислотных и углеводных составов с использованием кмпьютерной обработки данных.

3. Определены специфические продукты метаболизма микроорганизмов родов Candida, Aspergillus, Mucor, Fusarium, Geotrichum, Cryptoccocus, Penicillium, Micromonospora, Actinomyces, Nocardia и показана возможность использования этих метаболитов для идентификации :

— для Candida информативными компонентами являются глицерин, арабинитол и манноза, этиловый и изиамиловый спирты и изокапроновая кислота;

— для Aspergillus, Fusarium и Cryptococcus — маннитол.

4. Газохроматографическая экспресс-диагностика инвазивного кандидоза возможна по уровням арабинитола и маннозы специфическим метаболитам-маркерам грибов Candida в биологических жидкостях человека (крови и ликворе). Установлены фоновые концентрации (норма) вышеназванных маркеров в крови и ликворе детей без клинико-лабораторных признаков грибковой инфекции.

Норма в сыворотке крови:

— арабинитол — 0,51±0,28 мкг/мл,.

— манноза -17,7110,4 мкг/мл.

Норма в ликворе:

— арабинитол — 7,2±3,1 мкг/мл,.

— манноза -35,1±17,4 мкг/мл.

5. Показано, что уровни метаболитов в сыворотке крови и ликворе пациентов с инвазивным кандидозом достоверно превышают норму. Совокупность изменений в содержании этих метаболитов является достоверным объективным диагностическим критерием, и рекомендуется для контроля эффективности проводимой антифунгальной терапии.

6. Доказана 'возможность использования маннитола — метаболита грибов Aspergillus для диагностики инвазивного аспергиллеза. Определены фоновые концентрации маннитола в сыворотке крови и ликворе контрольной группы детей без признаков грибковой инфекции:

— Норма маннитола в сыворотке — от 10 до 15 мкг/мл;

— Норма маннитола в ликворе не превышает 30 мкг/мл.

7. Уровень маннитола в сыворотке крови пациентов с инвазивным аспергиллезом значительно превышает норму.

Заключение

.

Грибковая инфекция — проблема, с которой все чаще приходится сталкиваться врачам всех специальностей. Рост количества микозов связан с широким применением антибактериальных препаратов, цитостатиков, глюкокортикостероидов, снижающих иммунитет и, тем самым способствующих активизации условно-патогенных грибов. Особенно это касается недоношенных и новорожденных детей с незрелым иммунитетом, онкологических и гематологических больных после химиотерапии опухолей, больных СПИДом и других больных с ослабленным иммунитетом, у которых существует серьезная опасность быстрого развития системных и генерализованных форм инфекции.

Основное количество микозов вызывают грибы рода Candida и Aspergillus. Частота гнойно-воспалительных заболеваний, обусловленных грибами рода Candida, особенно Candida albicans, достигает 15% в общей этиологической структуре гнойно-воспалительных болезней (Пронина, 1996). В 40−60% случаев кандидоз остается нераспознанным или поздно диагностированным, и это значительно затрудняет лечение (Самсыгина, 1996). Постановка диагноза аспергиллеза является оцной из самых сложных проблем, особенно среди пациентов с иммунодефицитом. Поэтому очень важно как можно раньше поставить правильный диагноз и начать целенаправленную антифунгальную терапию.

Зависимость антибиотикочувствительности штаммов от вида гриба, отмеченная рядом авторов (Kerridge, 1987; Nerson, 1987) указывает на необходимость быстрой идентификации выделенных грибковых культур.. Это особенно актуально для вышеперечисленных групп больных с риском развития генерализованной грибковой инфекции.

Для идентификации возбудителя традиционно использовались методы, основанные на оценке их фенотипических особенностей: морфологических, культуральных, биохимических и иммунохимических. Вместе с тем, специфичность всех этих методов, согласно определению фенотипа, может• варьировать в зависимости от условий внешней среды. Использование гибридизационного анализа в целях идентификации и диагностики оказалось очень эффективным (Турова, 1992), однако, возможности широкого применения этого метода ограничены из-за сложности и трудоемкости экспериментальных процедур, отсутствия коммерческих наборов реагентов, автоматических систем проведения реакции и обнаружения ее результатов. Это определило необходимость поиска новых идентификационных тестов. Благодаря развитию хроматографических методов исследования возникло новое направление, основанное на использовании знаний о химическом составе клеточных компонентов для их идентификации.

Мы проанализировали жирнокислотный и углеводный состав медицински значимых штаммов грибов и выяснили значение полученных данных для их идентификации и классификации. В работе представлены результаты исследования клеточных высших жирных кислот восьми видов грибов рода Candida: С. albicans, С. tropicalis, C. krusei, C. kefyr, С. parapsilosis, C. glabrata, C. famata и С. guilliermondii, и жирнокислотного состава микроорганизмов родов Aspergilus, Mucor, Fusarium,.

Geotrichum, Cryptoccocus, Penicillium и Micromonospora, Streptomyces, Nocardia, а также проведен сравнительный анализ с грибами рода Candida.

В результате исследования профилей клеточных жирных кислот вышеперечисленных грибов обнаружены существенные различия в их качественном и количественном составе, показана их индивидуальность на уровне рода. Основным отличием липидного профиля грибов рода Candida является высокое содержание кислот с 17-ю углеродными атомами, особенно гептадеценовой кислоты, не встречающейся у других изученных нами грибов. Характерным для грибов рода Mucor является содержание длинноцепочечных жирных кислот, таких как С20:1, С22:0, С2 4:0. Эйкозенов’ая кислота (С20:1), найденная в штаммах грибов Mucor, характерна только для данного рода и является его отличительным признаком. Жирнокислотный > состав изученных актиномицетов харкктеризуется наличием кислот с разветвленной углеродной цепью, что резко ¿-отличает,, их от других, видов. Actinomyces, например Actinomyo^ israelii и Actinomyces viseosus, в спектре которых присутствуют кислоты только с прямой цепью. Ведущей кислотой у грибов Streptomyces albus, как и у Micromonospora monospora является изогексадекановая кислота ici6:0. Характерным компонентом обладают грибы Nocardia asteroides, в составе биомассы которых обнаружена туберкулостеариновая (10СНЗС18:0) и Í-1,12-гексадеценовая (С16:1А11) кислоты. Мы пришли к выводу, что анализ липидных компонентов грибной клетки позволяет сделать заключение о родовой принадлежности изучаемого штамма. Тем самым показана информативность и специфичность липидных профилей грибов на уровне рода. В результате нашей работы был обнаружен ряд специфических маркеров клеточной мембраны грибов, принадлежащих к разным родам, по которым они могут быть узнаны не только в чистой культуре, но и в ассоциациях, например в инфицированной биологической жидкости или ткани человека.

Нами был определен качественный состав и процентное соотношение моносахаров клеточной биомассы 55 штаммов б видов грибов рода Candida и 4 4 штаммов микроорганизмов родов Aspergillus, Mucor, Fusarium, Cryptoccocus, Penicillium, Sporotrichum, Alternarla и Micromonospora, Actinomyces, Nocardia. Показано, что только грибы рода Candida и Sporotrichum содержат в своем составе сахарный спирт арабинитол, который ранее по литературным данным (Bernard, 1981; Wong, 1982) был представлен только как продукт жизнедеятельности грибов Candida albicans. Для вышеперечисленных родов отличительным признаком является также более низкое содержание маннозы и фруктозы, в то время как у грибов С. albicans уровень маннозы и фруктозы достаточно высок. Маннитол в низких концентрациях может обнаруживаться у С. albicans, но всегда отсутствует у Nocardia. Высокое содержание маннитола характерно для представителей родов Aspergillus, Penicillum, Alternaria, Fusarium, Micromonospora.

Анализ клеточных моносахаров большого количества грибов, относящихся к-различным родам показал, что их состав является специфичным для многих из изученных микроорганизмов.

Было показано, что клетка грибов Candida содержит достаточное число липидных компонентов для видовой идентификации грибов. На основании полученных нами жирнокислотных спектров б видов грибов Candida был организован локальный банк данных, содержащий их жирнокислотные профили и проведена видовая идентификация грибов Candida (С.albicans — 40 штаммов, С. tropicalis — 23 штамма, C. kefyr — 14 штаммов, С. parapsilosis — 16 штаммов, C. glabrata — 12 штаммов, C. krusei — 20 штаммов) по составу жирных кислот с использованием персонального компьютера.

Для обработки данных использовали модифицированную в ВНИИБП программу для идентификации микроорганизмов по профилю жирных кислот. Специфичность идентификации была повышена путем введения в базу данных дополнительных компонентов клетки. Мы использовали для этого клеточные моносахара грибов Candida. На основании компьютерного сопоставления профилей жирных кислот и моносахаров грибных клеток мы пришли к заключению о существовании непрерывности в изменении их химического состава при переходе от одного вида к другому. Наши исследования подтверждают концепцию, выдвинутую ранее автором Осиповым (Осипов, 1996) о существовании континуума непрерывного количественного изменения химических параметров клетки, которые переходят в определенный момент в качественные — меняется вид.

Помимо клеточных компонентов для идентификации микроорганизмов широко применяются продукты их жизнедеятельности. Для этого мы изучили состав контрольной и культуральной сред после роста грибов родов Candida, Aspergillus, Fusarium, Geotrichum, Sporotrichum,.

Cryptoccocus, Penicillium, Oidiodendrum, Alternaria, Mucor, Micromonospora, Streptomyces, Nocardia. Исследован широкий спектр их метаболитов, таких как свободные сахара, спирты, летучие и нелетучие кислоты, амины и выявлены вещества, специфичные для этих родов или видов, а также выяснена значимость некоторых из них для идентификации.

В результате проведенного исследования спектра метаболитов некоторых грибов был определен целый ряд информативных компонентов для хемотаксономии этих грибов. Из состава свободных Сахаров культуральной среды после роста грибов Candida такими веществами являются глицерин, арабинитол и манноза. Для грибов родов Aspergillus, Fusarium и Cryptococcus информативным компонентом является маннитол.

Из летучих компонентов для идентификации грибов Candida информативными представляются этиловый и изиамиловый спирт и изокапроновая кислота. Из нелетучих компонентов, перспективных для использования в идентификации, интерес вызывают фумаровая, янтарная, щавелевоуксусная, пировиноградная кислоты. Продуцирование в среду роста этанола, изоамилового спирта, а также нелетучих кислот, схожих по спектру с Candida, характерно для грибов рода Sporotrichum.

В результате изучения состава полиаминов, выделяемых в культуральную среду грибами Candida albicans перспективных маркеров для целей таксономии не выявлено. Для других видов Candida среди полиаминов информативных компонентов также не обнаружено. Для грибов рода Aspergillus характерно повышенное содержание путресцина, а также специфического неидентифицированного вещества. Небольшое количество спермидина характерно для грибов Fusarium и Alternaria, a ß—фенилэтиламина — для Penicillum и Sporotrichum.

Определение специфических метаболитов медицински значимых грибов чрезвычайно важно для клинической экспресс-диагностики инвазивных микозов. Мы применили газохроматографический метод, основанный на принципе постоянства и специфичности спектра метаболитов грибов рода Candida для диагностики инвазивного кандидоза. Поскольку ни один из существующих методов лабораторной диагностики инвазивного кандидоза не является универсальным, включая микроскопические, культуральные, серологические и цитогистологические исследования, данный метод может быть использован как вспомогательный при решении вопроса о диагностике и назначении адекватной терапии. Метод хроматографической диагностики кандидоза отличается экспрессностью, высокой чувствительностью и специфичностью, относительно невысокой стоимостью. Так как метод основан на определении метаболитов грибов в биологической жидкости (ликвор, кровь), он не требует инвазивных процедур (биопсия и т. д.) и предварительного выделения чистой культуры.

Мы определили фоновые концентрации арабинитола и маннозы — метаболитов грибов рода Candida в сыворотке крови и ликворе (отобранных в ходе других диагностических и лечебных мероприятий) контрольной группы детей без каких-либо признаков грибковой инфекции.

Нормальный уровень: арабинитола в сыворотке составил 0,51±0,2 8 мкг/мл. Нормальная концентрация маннозы составила 17,7±10,4 мкг/мл.

Было обнаружено, что нормальная концентрация арабинитола и маннозы в ликворе намного выше, чем в крови. Уровень арабинитола в ликворе в контрольной группе был 7,2±3,1 мкг/мл. Уровень маннозы в контрольной группе был 35,1+17,4 мкг/мл.

У всех детей с различными формами инвазивного кандидоза на фоне онкогематологических заболеваний, обследованных методом ГХ, до начала противогрибковой терапии уровень арабинитола в крови был достоверно (рА<0,001) выше нормы и составлял 1,8710,24 мкг/мл, маннозы — до 106,4±21,8 мкг/мл (рм<0, 001) .

При ГХ-исследовании спиномозговой жидкости детей с диагнозом грибкового менингита установлено, что арабинитол в ликворе достоверно (р= 0,012) значительно превышал норму и составил 35,7112,5 мкг/мл. В среднем уровень маннозы составил 91,4±21,0 мкг/мл.

В результате адекватной терапии уровень метаболитов существенно снижался и практически достигал нормальных показателей, что совпадало с положительной клинической динамикой. -Таким образом, метод газовой хроматографии можно использовать для мониторинга эффективности противогрибковой терапии путем анализа изменений уровней метаболитов в сыворотке крови или ликворе.

Обследование группы детей с неинвазивным кандидозом, или без клинических признаков кандидоза (кандидоносительство), показало незначительное возрастание уровней метаболитов по сравнению с их уровнями при инвазивной инфекции. Таким образом, оценка уровней арабинитола и маннозы может служить дифференциально-диагностическим критерием в комплексе с другими клинико-диагностическими мероприятиями.

В опытах in vitro мы обнаружили, что некоторые грибы рода Aspergillus продуцируют значительное количество маннитола, шестиатомного сахарного спирта. В связи с этим выдвинуто предположение о возможности использования этого показателя с целью диагностики инвазивного аспергиллеза. При анализе уровней маннитола в крови больных детей из онкогематологического отделения с достоверно подтвержденным диагнозом инвазивного аспергиллеза, (поставленного по гистологическим данным и/или аутопсии), выявлено, что из 11 таких больных у 9 были обнаружены высокие концентрации маннитола. Уровень маннитола в сыворотке крови детей контрольной группы составил 10−15 мкг/мл. Нами было показано, что нормальные фоновые концентрации маннитола в ликворе выше, чем в крови, и составляет 20−30 мкг/мл. Сравнивая уровень содержания маннитола в сыворотке крови в норме с уровнем маннитола у пациентов с инвазивным аспергиллезом, мы пришли к выводу, что грибы Aspergillus продуцируют в ткани достаточное количество маннитола, чтобы поднять его уровень в крови больного до высоких значений (от 30 до 80 мкг/мл). Таким образом, полученные предварительные данные указывают на перспективность исследования содержания метаболита грибов рода Aspergillus — маннитола в биологических жидкостия человека с целью экспресс-диагностики инвазивного аспергиллеза.

На основании полученных данных изданы методические рекомендации «Диагностика грибковой инфекции у детей методом газожидкостной хроматографии», утвержденные Минздравом РФ и рекомендуемые к внедрению в крупных диагностических центрах по всей территории России для лабораторной диагностики кандидоза и мониторинга эффективности противогрибковой терапии.