Сравнительный анализ мРНК мозга человека и шимпанзе

Среди множества нерешенных проблем эволюции одной из важнейших является определение молекулярно-генетических причин видообразования. В частности, чрезвычайно большой интерес вызывает вопрос, какие молекулярные изменения в структуре генома привели к дивергенции линий, ведущих к современному человеку и шимпанзе. Известно значительное сходство в морфологии и анатомии различных систем и органов человека и шимпанзе, в том числе и мозга. Показано также, что геномы этих двух видов совпадают на 98%, а кодирующие области генома более чем на 99%. При этом общие морфологические и функциональные различия между этими двумя видами очень велики. Это приводит к гипотезе о том, что в основе фенотипических различий лежит сравнительно небольшое число изменений в регуляции экспрессии генов. Однако в настоящее время ни одно из этих различий не обнаружено.

На современном этапе развития молекулярной генетики, когда полные последовательности геномов различных организмов становятся доступными для анализа, наиболее актуальной становится проблема сравнения организмов на уровне транскриптома, т. е. анализ экспрессирующихся последовательностей. Данные, полученные в ходе определения структуры геномов человека и шимпанзе, позволяют делать выводы о структурных различиях в генетическом материале этих видов, однако до настоящего момента очень мало известно о различиях в экспрессии отдельных генов между этими двумя близкородственными видами.

До недавнего времени, из-за отсутствия адекватных методов, не проводилось систематического поиска генов, дифференциально экспрессирующихся у человека и шимпанзе. Появившиеся в последние годы методы крупномасштабного сравнительного анализа геномов и транскриптов позволяют подойти к решению этого вопроса. Целью данной работы является полногеномный поиск и идентификация генов, отличающихся по структуре и уровню экспрессии в мозге человека и шимпанзе. Настоящая работа состояла из двух частей: первая — поиск и идентификация транскриптов, экспрессия или структура которых различается в гомологичных отделах мозга человека и шимпанзе. Вторая часть работы была посвящена структурному анализу обнаруженных дифференциальных генов и функциональному анализу одного из них — гена транстиретина.

Объектом данного исследования является мозг, так как мозг — это та структура, где различия в спектрах и уровне транскрипции различных генов наиболее значимы.

Выводы.

1. Впервые при проведении анализа различий в экспрессии генов в мозге человека • и шимпанзе найдено два гена, дифференциально транскрибирующихся в мозжечках человека и шимпанзе: KIAA0537, кодирующий АМФ-активируемую протеинкиназу, и TTR, кодирующий переносчик тироидных гормонов транстиретин.

2. Показано, что первичная структура фрагмента кДНК KIAA0537 шимпанзе на 99,5% идентична последовательности гена человека. Уровень транскрипции гена KIAA0537 в мозжечке человека в 6−10 раз выше, чем у шимпанзе.

3. Показано, что уровень транскрипции гена транстиретина у шимпанзе в мозжечке в 8−10 раз выше, а в переднем мозге в 10 раз ниже, чем в тех же отделах мозга человека. Впервые показана тканеспецифичность транскрипции гена транстиретина в отделах взрослого и эмбрионального мозга человека.

4. Определена полная первичная структура кДНК гена транстиретина шимпанзе. Среди 12 идентифицированных различий между последовательностями кДНК у человека и шимпанзе обнаружено одно, приводящее к несинонимической Ф аминокислотнои замене, существование которой подтверждено для геномов еще трех шимпанзе, что свидетельствует о видоспецифичности этой замены.

5. Определена первичная структура фрагмента ДНК шимпанзе длиной 7 т.п.о., содержащая регуляторные элементы гена транстиретина. В последовательности фрагмента генома шимпанзе по сравнению с соответствующим фрагментом генома человека было выявлено более 120 замен. Локализовано три участка, имеющих высокую степень идентичности у человека, шимпанзе и мыши. Один из этих участков находится в области промотора гена, два других, предположительно, являются энхансерами, связанными со специфичностью экспрессии гена транстиретина в печени и мозге.

Я хочу выразить глубокую признательность своему научному руководителюзаведующему Лабораторией структуры и функций генов человека академику Е. Д. Свердлову за помощь и участие в данной работе. Также выражаю благодарность с.н.с. Т. В. Виноградовой за разнообразную помощь, плодотворные обсуждения и конструктивную критику данной работы. Отдельная благодарность Е. А. Стукачевой за ведение клеточных линий, проведение экспериментов по трансфекциям, а также за благожелательное отношение и конструктивные советы.

Хотелось бы поблагодарить весь большой коллектив сотрудников лаборатории за дружескую атмосферу, готовность всегда помочь словом и делом.

1.7.

Заключение

.

Генетические изменения, происходящие в процессе видообразования, до настоящего времени остаются наименее исследованной областью молекулярной генетики. По оценкам, проведенным при сравнении экспрессии генов различных видов и подвидов, при видообразовании происходят изменения в сотнях генов. Они могут касаться как структуры, так и функций генома.

Из представленного обзора видно, что в настоящее время накоплены данные о различиях между геномами человека и шимпанзе, затрагивающие все уровни организации генетического материала, а также описаны некоторые различия на уровне протеомов. Однако представленные данные не позволяют нарисовать целостную законченную картину функционирования генетических факторов, обусловивших дивергенцию предковых линий, ведущих к современным видам человека и шимпанзе, поскольку, несмотря на значительный прогресс в этой области, достигнутый в последнее время, из-за значительного недостатка данных не удается выявить ключевые различия на молекулярном уровне, лежащие в основе столь значительных фенотипических различий между человеком и высшими приматами.

Анализ различий структуры геномов человека и шимпанзе показывает, что большинство известных в настоящее время причин, вызвавших эти различия, можно отнести к двум основным группам: (1) последствия инсерций ретроэлементов (в подавляющем большинстве случаев инсерции Alu повторов), вызывающие рекомбинационные изменения структуры генов- (2) точечные мутации, приводящие к изменению силы промоторов и как следствие, различиям в уровне экспрессии отдельных генов, потере/появлению новых экзонов и интронов, появлению полиморфных по аминокислотной последовательности белков, в том числе более коротких/длинных изоформ существующих белков, а также, альтернативным вариантам посттрансляционной модификации белков.

Следует отметить, что эти наблюдения носят предварительный и незаконченный характер, но появляющиеся новые систематические методы анализа геномов, транскриптомов и протеомов большого количества более простых модельных организмов позволяют обнаружить новые закономерности и законы видообразования, которые возможно будет проверять и подтверждать на таких сложных в работе объектах как человек и шимпанзе, и к уже описанным генетическим факторам, обусловливающим фенотипические различия между человеком и высшими приматами, прибавятся новые, еще не известные.

Глава II. Сравнение мРНК мозга человека и шимпанзе.

В настоящее время для сравнения уровней экспрессии генов в двух или нескольких биологических образцах наиболее часто используются методы гибридизации микрочипов (microarray), дифференциального дисплея, SAGE (serial analysis of gene expression) и метод вычитающей гибридизации. Каждому из этих методов присущи свои достоинства и недостатки (для обзора см. [154]).

Метод дифференциального дисплея позволяет одновременно анализировать сразу несколько сравниваемых образцов, оценивая различия по размеру и интенсивности отдельных кДНК после разделения на электрофорезе. Однако при межвидовом сравнении велико количество мРНК, различающихся по структуре, в том числе и имеющих разную длину, поэтому их сравнение весьма затруднено.

Метод гибридизации с микрочипами позволяет проводить одновременное сравнение нескольких тысяч экспрессирующихся последовательностей в двух образцах [155]. Однако для использования этого метода при межвидовом сравнении существуют ограничения, связанные с неизвестными различиями в структуре генов сравниваемых организмов, поэтому использование микрочипов, сконструированных на основе последовательностей генов одного организма, для анализа уровня экспрессии другого организма может искажать получаемую картину различий (см. раздел 1.5. Обзора литературы).

Использование метода SAGE для межвидового сравнения также ограничено поскольку затруднена идентификация секвенированных тэгов в случае, если не известна геномная последовательность организма для которого проводится сравнение.

Метод вычитающей гибридизации позволяет обходить некоторые из проблем, возникающих при анализе микрочипов, однако сам имеет ряд недостатков, таких как достаточно высокий уровень фалыппозитивных фрагментов в вычтенных библиотеках, что требует проведения дополнительных этапов по идентификации истинно дифференциальных последовательностей, а также значительную трудоемкость. Тем не менее, вычитающая гибридизация является одним из наиболее эффективных методов для межвидового сравнения, позволяя в отличие, например, от метода с использованием микрочипов, проводить сравнения гомологичных последовательностей, не идентичных между собой на 100%, и получать информацию не только об уровнях экспрессии уже известных последовательностей, но также находить дифференциально экспрессирующиеся последовательности с неизвестной ранее структурой. Эти особенности метода делают его предпочтительным в настоящем исследовании, позволяя идентифицировать дифференциальные кДНК мозга человека и шимпанзе.

Для проведения сравнительно анализа уровней транскрипции генов в мозжечках человека и шимпанзе был выбран метод вычитающей гибридизации в модификации супрессивной вычитающей гибридизации, ранее разработанный в Лаборатории, и показавший высокую эффективность как при сравнении уровней экспрессии генов внутри одного организма, так и при сравнении геномных последовательностей разных видов бактерий [156].

2.1. Вычитающая гибридизация кДНК из мозжечков человека и шимпанзе.

2.1.1. Выделение и характеристика суммарной РНК из мозжечков человека и шимпанзе.

Для сравнения мРНК был использованы мозжечки человека и шимпанзе. Выбор мозжечков в качестве объекта исследования обоснован тем, что мозжечок является морфологически обособленным отделом головного мозга, и это позволяет целиком отделить его от остального мозга. При использовании в работе целого мозжечка достигается морфологическая и генетическая идентичность сравниваемых образцов. Кроме того, в литературе имеются данные о непропорциональном изменении размеров мозжечка среди других отделов мозга человека по сравнению с высшими приматами и особом характере экспрессии генов в мозжечке по сравнению с другими отделами головного мозга [133, 157, 158].

На первом этапе работы были выделены препараты суммарной РНК из мозжечков человека (Homo sapiens sapiens) и шимпанзе (Pan troglodytes) с использованием гуанидин изотиоцианата и дополнительного переосаждения с LiCb, что позволило избавиться от основной низкомолекулярной фракции в препаратах суммарной РНК. Качество полученных РНК оценивали по соотношению интенсивности полос 18S и 28S рРНК при разделении в неденатурирующем агарозном геле.

Препараты суммарной РНК использовали как матрицы для синтеза кДНК с использованием олиго (дТ) праймера и высокопроцессивной обратной транскриптазы SuperScript. Для построения второй цепи кДНК применяли эффект cap-switch [159]. Данный подход позволяет получать набор двуцепочечных кДНК, обогащенный полноразмерными копиями транскриптов. Для синтеза использовали одинаковые количества суммарной РНК человека и шимпанзе. Эффективность синтеза кДНК оценивали по количеству копий мРНК генов Р-актина, клатрина и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы ПЦР с праймерами b-actin For/Rev, Clathrin For/Rev и GAPDH For/Rev (табл. 7).

2.1.2. Вычитающая гибридизация. Отбор дифференциальных клонов.

Подготовительные этапы получения трейсера и драйвера для проведения вычитания кДНК, а также саму вычитающую гибридизацию проводили в соответствии с протоколом системы «PCR-Select cDNA Subtraction Kit». Было проведено две вычитающие гибридизации: (1) для получения библиотеки, обогащенной специфичными для человека транскриптами, при вычитании в качестве трейсера использовали кДНК из мозжечка человека, а драйвера — кДНК из мозжечка шимпанзе- (2) для получения библиотеки, обогащенной транскриптами, специфичными для шимпанзе, в качестве трейсера использовали кДНК из мозжечка шимпанзе, а драйвером служила кДНК мозжечка человека (рис. 1, п.1).

Эффективность вычитающей гибридизации оценивали по изменению количества кДНК гена, уровень транскрипции которого в гомологичных отделах мозга человека и шимпанзе одинаков. Поскольку транскрипция такого гена не дифференциальна, после проведения вычитающей гибридизации содержание его кДНК должно уменьшаться в пулах дифференциальных кДНК. Для такой оценки был выбран ген глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH). Из литературных данных известно, что нуклеотидная последовательность GAPDH консервативна [160], а в ходе данной работы методом RT-PCR было показано, что ген GAPDH экспрессируется в мозжечках человека и шимпанзе на приблизительно одинаковом уровне.

После проведения вычитающей гибридизации оценивали содержание кДНК гена GAPDH в вычтенных кДНК по сравнению с исходным ПЦР с праймерами G3PDH For/Rev. Продукт амплификации кДНК гена GAPDH в вычтенных пулах кДНК появлялся на 6 циклов ПЦР позже по сравнению с исходным, т.о. эффективность «обеднения» вычтенных кДНК оценивалась как ~26 раз, т. е. ~ 60 раз.

Вычтенные кДНК клонировали в плазмидный вектор pGEM-T и трансформировали клетки E.coli. Полученные клоны были ранжированы в 96-луночные планшеты. В результате были получены две ранжированные библиотеки содержащие ~ по 700 индивидуальных клонов (рис. 1 п.2).

Вычитающая гибридизации.

Ранжированные библиотеки.

Дифференциальная гибридизация о • • • • • • • * •.

• • о • •.

Зонд «Ч-Ш» «+» гибридизация о"оо"оо""оо е••о • о о о•оо.

•оо*о*"оо"".

• ООО"О"ИО0.

• ®в#оою"о".

ОО"О ««««ООО.

Зонд «Ш-Ч» гибридизация.

О•О ООО о о•о• О0О1ОО"ОО"О t О О О «I о о о о «в"оооо"о#"о •otofoioovo оов о (c)•оо•о».

Зонд «Ч-Ш» гибридизация.

••••••••о".

•Q*0**0*""" о*"о*оо**" • • •о • • • • • • • •••••••••о*.

Зонд «Ш-Ч» '+" гибридизация.

Отбор дифференциальных клопов, определение первичной структуры, идентификация дифференциальных кДН К.

Рисунок I. Схема эксперимента по дифференциальной гибридизации библиотек кДНК, полученных в результате вычитающих гибридизаций кДНК мозжечков человека и шимпанзе. 1. Проведение двух вы читающих гибридизаций: Ч-Ш — для получения библиотеки, обогащенной специфичными для человека транскриптами, при вычитании в качестве трейсера использовали кДНК из мозжечка человека, а драйвера — кДНК из мозжечка шимпанзеШ-Ч — для получения библиотеки, обогащенной транскриптами специфичными для шимпанзе, в качестве трейсера использовали кДНК из мозжечка шимпанзе, а драйвером служила кДНК мозжечка человека. 2. Ююнирование вычтенных кДНК в плазмидный вектор, трансформация клеток E. coli, получение двух ранжированных библиотек. 3. Получение двух копий реплик ДНК вставок каждого клона на фильтрах, дифференциальная гибридизация с зондами, являющимися радиоактивно меченными пулами кДНК (Ч-Ш и Ш~Ч), полученными после вычитающих гибридизаций.

2.1.3. Дифференциальная гибридизация. Отбор и идентификация дифференциальных транскриптов.

Поиск дифференциальных клонов проводили методом дифференциальной блот и дот-блот гибридизации (рис, I и 2). Амплификацию ДНК вставок плазмид для переноса на фильтры проводили ПЦР в плашках с универсальными праймерами М13. Более 90% плазмид из индивидуальных клонов библиотек содержали вставки длиной от 150 п.о. до 1 т.п.о. Продукты амплификации наносили на нейлоновую мембрану (для дот-блот гибридизации) или разделяли в агарозном геле и переносили на мембрану (для блот гибридизации). Продукты амплификации ДНК вставки каждого клона наносили на две мембраны, чтобы проводить гибридизацию параллельно с двумя зондами (рис. 1 п. З).

А В С I) Е F G II.

Рисунок 2. Радиоавтограф дифференциальной дот-блот гибридизации ДНК вставок клонов библиотеки, обогащенной шимпанзе-специфическими транскриптами. А — Гибридизация с радиоактивно меченными кДНК, обогащенными специфичными для шимпанзе кДНК, полученными после вычитающей гибридизации (Ш-Ч) («+» гибридизация).

Б — Гибридизация с обогащенными специфичными для человека кДНК, полученными после вычитающей гибридизации (Ч-Ш) («—» гибридизация).

Стрелками с подписями обозначены клоны, отобранные для определения первичной структуры ДНК их вставок.

В качестве зондов для сравнительной гибридизации использовали радиоактивно меченные кДНК, полученные после вычитающей гибридизации. Клонированные фрагменты кДНК, дававшие сильный сигнал при гибридизации со «своим» зондом («+» гибридизация) и слабый или отсутствующий сигнал при гибридизации с противоположным зондом («-» гибридизация), отбирали как дифференциальные. Не было обнаружено клонов, которые давали бы заметный сигнал при «+"-гибридизации и вообще не давали сигнала при «-"-гибридизации.

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12.

1 2 3 4 5 6 7 S 9 10 11 12.

А2 Ш тт•4 • • * * • • 9 • • •• «• «• • # • ~ • • а.

А • «I V «0 9 в•• с # «# # * (.

Е • Щ К+ФШФ «¦ ' тШФШ • т С.

G # • • • • • Ф в I.

Из двух библиотек было отобрано 19 клонов, вставки которых давали наиболее четко различающиеся сигналы при «+» и «—"-гибридизациях, после чего определяли первичную структуру ДНК их вставок. Номера отобранных клонов приведены в таблице 1.