Анаэробные микробные сообщества, разрушающие азокрасители и их производные

Загрязнения, образующиеся в результате роста населения Земли и удовлетворения его потребностей, существенно влияют на окружающую среду и здоровье людей. Получение ряда веществ природного происхождения в сверхколичествах и перемещение их на значительные расстояния может оказывать избыточное давление на самоочищающую способность естественных местообитаний. Серьезной проблемой является и накопление полученных искусственным путем чуждых природе соединений (ксенобиотиков), попадание которых в окружающую среду изменяет протекание сложившегося круговорота биогенных элементов (Заварзин, 2003; Экология микроорганизмов, 2004). Природные и синтетические вещества, имеющие в молекулах ароматическое кольцо (лигнинсодержащие отходы, нефть, пестициды, красители и др.), обладают значительной стабильностью, поэтому реакции их разложения до простых соединений протекают с крайне низкими скоростями, что ведет к дисбалансу синтетических и деструктивных процессов в глобальных циклах элементов (Хоменков и др., 2008; МсЬеоё, ЕШз, 2008; Нетрусов, Котова, 2012; www.slovopedia.com).

В зависимости от химической структуры разрушаемых сложных органических веществ, условий окружающей среды и наличия конкретных биологических активностей их преобразование (биодеградация) может заключаться в незначительных изменениях молекулы (трансформации), распаде молекулы на крупные составные части (фрагментации) или в полной минерализации, т. е. в превращении в самые простые соединения (Н20, СОг, Н2, Н28, ИНз, СН4 и т. д.). Глобальная роль в осуществлении биоразрушения загрязнений (в том числе, ксенобиотиков) принадлежит представителям мира микробов, имеющим широчайшие возможности метаболизма и способным перестроиться на использование антропогенных соединений (Наумова, 1985; Остроумов, 1986; Diaz, 2004; Нетрусов, Котова, 2012; www.biotechnolog.ru). Вовлечению в микробный метаболизм веществ неприродного происхождения способствуют такие свойства представителей мира микробов, как высокая скорость размножения, метаболическая пластичность, быстрая адаптация к изменяющимся условиям окружающей среды, высокая устойчивость к экстремальным значениям физико-химических факторов, быстрый обмен генетической информацией в микробных сообществах путем горизонтального переноса (Хоменков и др., 2008). В последние десятилетия исследователи отмечают существенное значение анаэробных микроорганизмов как деструкторов ароматических и гетероциклических соединений.

В настоящее время результаты исследований по биодеградации загрязнений учитываются при разработке различных очистных сооружений. Однако пока в большинстве случаев применяют естественно сложившиеся микробные ассоциации без учёта их внутренней структуры.

2. Значение амнноароматических соединений для человеческой практики.

Азокрасители и аминоароматические соединения входят в состав многих товаров и применяются практически во всех областях человеческой деятельности. Они являются прямыми и побочными продуктами нефтехимической, лакокрасочной, фармацевтической и пищевой промышленности (Березин, Березин, 2001; Карпов, Белов, 2002; Solis et al., 2012). Азокрасители, устойчивые к изменению своих свойств под действием факторов окружающей среды, используются при изготовлении различных красок и лаков, тканей, кожаных и пластиковых изделий, в типографском деле. Они входят в состав многих продуктов питания (мармелада, конфет, газированной воды и др.), оболочек таблеток и парфюмерно-косметической продукции (например, красок для волос).

N-замещённые ароматические вещества, в частности аминоароматические, в значительных количествах содержатся в стоках и твердых отходах предприятий нефтехимической, фармацевтической и легкой промышленности, производящих пестициды, взрывчатые вещества, полимеры, красители, лекарственные препараты, пищевые добавки и товары хозяйственного назначения (Snyderwine et al., 2002). Ароматические амины попадают в окружающую среду также с выхлопными газами автомобилей и при горении растительной массы, богатой азотом (при лесных пожарах и табакокурении, Grimmer et al., 2000).

Поскольку человечество не может отказаться от использования таких веществ, важным является вопрос об их судьбе при попадании в окружающую среду и влиянии на здоровье человека. Особую актуальность приобретают исследования, направленные на изучение анаэробных микробных сообществ, использующих в своем метаболизме устойчивые и высокотоксичные аминоароматические вещества, повсеместно применяемые и значительно загрязняющие естественные местообитания.

3. Особенности азокрасителей и ароматических аминов как загрязнителей

Азокрасители являются наиболее важной и широко применяемой группой искусственных красителей из-за простоты синтеза, яркой окраски и устойчивости к внешним воздействиям (Гордон, Грегори, 1987). Разнообразные по структуре и сложности молекулы азокрасителей характеризуются наличием одной или более азогрупп (-N=N-), соединенных с бензольными или нафталиновыми кольцами (рис.1). Азогруппы относятся к важнейшим хромофорам, ответственным за окрашивание в видимой области спектра. Бензольные и нафталиновые кольца могут содержать различные заместители (-С1, -СН3, -N02, -NH2, -ОН, -СООН, -S03 и др.). Наличие карбоксильной, гидроксильной, сульфои аминогрупп, являющихся ауксохромами, приводит к усилению или изменению цвета красителя.

Азосвязь имеет ярко выраженный электронакцепторный характер, поэтому азокрасители устойчивы к реакциям окисления.

Ponceau S

Рис. 1. Химическая структура Ponceau S.

При производстве и использовании азокрасителей в биосферу со сточными водами сбрасывается от 10 до 50% этих веществ. Обладая большой стабильностью, азокрасители трудно поддаются разложению в присутствии кислорода и поэтому могут накапливаться в окружающей среде в значительном количестве. Среди органических загрязнителей азокрасители составляют 3−4%, однако по ряду причин они представляют собой серьезную угрозу (Slokar, Majcen Le Marechal, 1998; Gottlieb et al., 2003). Сточные воды текстильных предприятий обычно содержат 10−200 мг/л этих веществ (Pandey et al., 2007; Annuar et al., 2009). Азокрасители и продукты их неполной аэробной трансформации могут даже в виде микропримесей оказывать токсическое и/или канцерогенное влияние на живые клетки.

Окрашивание природных водных сред приводит к поглощению солнечного света и тем самым снижает эффективность фотосинтеза водных организмов.

Присутствие азокрасителей в воде в концентрации до 1 мг/л различается человеческим глазом как посторонний цвет и вызывает у потребителя негативный эстетический эффект (Slokar, Majcen Le Marechal, 1998). Ряд азокрасителей активно используется в пищевой промышленности для восстановления и повышения интенсивности природной окраски, утраченной в процессе обработки или хранения, окрашивания бесцветных продуктов например, безалкогольных напитков, мороженого, кондитерских изделий), а также для придания продуктам привлекательного вида и цветового разнообразия (Xu et al., 2007). Пищевые азокрасители используются по специальному разрешению в категории «добавки» (табл. 1). Некоторые ранее широко применявшиеся азокрасители (Суданы I-IV, Суданы Пара Ред и

Черный и др.) в настоящее время запрещены при изготовлении продуктов питания в странах Европейского Союза, поскольку в организме человека они расщепляются на канцерогенные амины. Однако на территории многих стран, в том числе и в России, эти азокрасители до сих пор обнаруживаются в некоторых продуктах и оболочках таблеток. Например, Sudan I-IV может содержаться в молотом перце чили, порошке красного (стручкового) перца, куркуме, некоторых сортах пальмового масла, порошкообразных пряностях карри), пастах, соусах, окрашенных хлебобулочных изделиях в количестве от 2,8 до 3500 мг/кг порошка (Xu et al., 2007). Эти азокрасители часто используются при фальсификации вышеперечисленных продуктов с целью придания им более интенсивной окраски (www.bestpravo.ru). Пищевые азокрасители требуют особо пристального внимания, так как они вступают в прямой контакт с человеческим организмом и оказывают непосредственное влияние на жизнедеятельность человека. Повсеместное использование в промышленности и в быту аминозамещенных ароматических веществ приводит к возрастанию их выброса в окружающую среду и принимает

15 угрожающий характер из-за их быстрого распространения по трофическим цепям и токсического, мутагенного или канцерогенного влияния на живые организмы даже в малых дозах.

Таблица 1.

Пищевые азокрасители.

Индекс Название Цвет

Е102 Тартразин Желтый

Е103 Алканет, алканин (СИгуБоте гезогсто1) Красный

Е105 Жёлтый прочный АВ (жёлтый кислотный О) Желтый

Е107 Жёлтый 2С Желтый

Е110 Жёлтый «солнечный закат», (апельсиновый жёлтый 8) Желто-оранжевый

Е121 Цитрусовый красный 2 Оранжевый

Е122 Кармазин (кармуазин, азорубин) Оранжевый

Е123 Амарант Оранжевый

Е124 Понсо 4Я Оранжевый

Е125 Понсо 8Х Красный

Е128 Красный Ю, азофлоксин Красный

Е129 Красный очаровательный АС Красный

Е151 Бриллиантовый чёрный ВЫ Черный

Е152 Черный 7984 Черный

Е155 Шоколадный коричневый НТ Коричневый

Е180 Рубиновый литол ВК Красный

Примечание: Вещества с индексом красного цвета не разрешены к применению в пищевой промышленности Российской Федерации. Зеленый цвет индекса означает, что эти вещества входили в список пищевых добавок, допущенных к применению в пищевой промышленности РФ в период с 2003 года по 1 августа 2008 года. Индекс веществ, запрещенных к применению в пищевой промышленности других стран, но разрешенных в России, отмечен синим цветом. Вещества, имеющие индекс черного цвета, допущены к применению в пищевой промышленности РФ в качестве вспомогательного средства для производства пищевой продукции (СанПиН 2.3.2.1293−03- www.codexalimentarius.net).

Высокую токсичность и мутагенность этих соединений по отношению к человеку связывают с преобразованием их в организме в реакционноспособные интермедиа&trade-, взаимодействующие с молекулами ДНК и гемоглобином крови (Weisburger, 1997; Pinheiro et al., 2004). В последнее время исследователи особо отмечают роль ароматических аминов из непромышленных источников в связи с развитием раковых заболеваний человека. Проведены эпидемиологические исследования, показывающие негативные последствия широкого использование азокрасителей в косметической и пищевой промышленности. Например, в красках для волос содержится высокая концентрация азокрасителей, которые, распадаясь, образуют ароматические амины, также вызывающие раковые заболевания. За последние 30 лет количество людей, использующих краски для волос, существенно возросло (так, в США 85% жителей окрашивают волосы), что повышает риск таких заболеваний как лимфома, лейкемия, миелома и др. (Cantor et al., 1988; Zahm et al., 1992; Morton et al., 2007).

Среди аминоароматических соединений встречаются и природные вещества, например, 2-аминобензойная кислота является интермедиатом синтеза алкалоидов у растений, а 4-аминобензойная кислота — фолиевой кислоты в организме животных и человека, однако в концентрациях, существенно превышающих природные, они также становятся токсичными для бактерий кишечной группы (Richards et al., 1995). Все азокрасители являются синтетическими.

Негативный эффект азокрасителей и ароматических аминов на клетки во многом зависит от их гидрофобности (Ren, Schultz, 2002) и действия на цитоплазматическую мембрану (Sikkema et al., 1994, 1995). Проникновение ароматических веществ в клеточную мембрану приводит к ее «разбуханию», увеличению проницаемости и нарушению транспорта протонов. При этом коэффициент распределения таких соединений между фосфолипидным

17 бислоем мембраны и водной фазой коррелирует с коэффициентом распределения в стандартной системе октанол/вода (Sikkema et al., 1994, 1995; Slokar, Majcen Le Marechal, 1998).

Сохранение азокрасителями и аминоароматическими веществами своих свойств под действием факторов окружающей среды обусловило их повсеместное применение, однако именно это качество стало серьезным препятствием для разрушения их в сточных водах и в естественных местообитаниях. В связи с этим большое значение имеют исследования, посвященные деградации таких органических соединений до неорганических и простых нетоксичных органических веществ, в том числе и с помощью микроорганизмов (Razo-Flores et al., 1997; Guang-fei et al., 2006; Xu et al., 2007; Hong et al., 2007; Buan et al., 2009).

4. Преимущества биологических методов очистки от ароматических азосоединений.

Для очистки сточных вод от азокрасителей и ароматических аминов имеется большой арсенал способов. К физико-механическим методам относятся адсорбция, ионный обмен, фильтрация на мембранах, коагуляция и осаждение (Baughman, 1995; Bes-Pia, Mendoza-Roca, 2002; Chakraborty,

Purkait, 2003). В качестве сорбентов в ряде случаев используют биомассу бактерий и грибов. Обычно физико-механические методы применяют для удаления устойчивых и плохо растворимых в воде ароматических азосоединений в сочетании с химическими и биологическими способами обработки. К химической группе методов освобождения сточных вод от азокрасителей и аминоароматических веществ относят окисление, восстановление, фотои электрохимическое разрушение (Bolduc, Anderson,

1997; Kanazawa, Onami, 2001; Ledakowicz et al., 2001; Bechtoldet al., 2002;

Chakraborty, Purkait, 2003). Такие методы требуют значительных затрат энергии, а образовавшиеся побочные продукты могут обладать нежелательными свойствами. Недостатки, малая эффективность и

18 экологическая опасность" перечисленных выше методов очистки заставляют исследователей искать новые, «дружественные» природе способы избавления от этих сложных ароматических ксенобиотиков с помощью биологических систем (биоремедиации, Head, 1998). Для полной минерализации слабо поддающихся биоразложению ксенобиотиков, в том числе азокрасителей и ароматических аминов, наиболее перспективно применение микроорганизмов разных групп и их ассоциаций, обладающих огромным разнообразием ферментных систем и способностью быстро «перенастраивать» их на использование новых субстратов. Многие исследователи отмечают эволюционный феномен быстрой адаптации микроорганизмов к веществам антропогенного происхождения, появление которых в окружающей среде произошло менее 50−100 лет назад. Поскольку присутствие устойчивых загрязнителей антропогенного происхождения в биосфере будет увеличиваться, то особую актуальность приобретает использование микробных сообществ для их полной и безопасной утилизации (Knackmuss, 1996).

5. Возможности применения анаэробной микробной технологии для биоразложения азокрасителей и ароматических аминов.

В настоящее время очистка сточных вод осуществляется в основном с помощью аэробных микроорганизмов. Аэробное окисление действительно термодинамически наиболее выгодно, так как при этом наблюдается наибольшее изменение свободной энергии. Однако аэробная технология имеет ряд недостатков, главные из которых — значительные энергозатраты на аэрацию и образование избыточного количества микробной биомассы (до

50% углерода загрязнителей переходит в органические вещества клеток микроорганизмов). В случае ароматических соединений окислительные условия их удаления накладывают еще ряд ограничений (Stolz, 2001). Эти вещества понижают поверхностное натяжение водных растворов и могут служить причиной неконтролируемого пенообразования при аэрации, а

19 некоторые из них являются летучими токсичными веществами, способными загрязнять атмосферу. При контакте с кислородом могут образовываться токсичные продукты неполного окисления или трудноразлагаемые продукты радикальной полимеризации (Braun, Gibson, 1984). Ряд азотсодержащих ароматических соединений быстрее и полнее разрушается в бескислородной среде. Так, азокрасители в силу электронакцепторных свойств азосвязей устойчивы к реакциям окисления и плохо поддаются разложению в аэробных условиях, в то время как реакции восстановления для них наиболее характерны и легко осуществимы в отсутствии кислорода (Bumpus, 1995). Поэтому неэффективность традиционных способов очистки по отношению к таким соединениям требует разработки процессов их анаэробной деструкции.

Отрицательные значения AG° для реакций разложения азокрасителей и ароматических аминов в анаэробных условиях при наличии разных акцепторов электронов показывают, что в стандартных условиях все они термодинамически не запрещены. При сравнении денитрифицирующей, сульфатредуцирующей и метаногенной реакций именно в результате последней происходит наименьшее изменение свободной энергии (Slokar, Majcen Le Marechal, 1998), однако технологически она более удобна, так как не требует внесения дополнительных акцекпторов электронов в среду. В то же время, устойчивость многих ароматических ксенобиотиков в реальных условиях очистки объясняется тем, что потенциально возможные с точки зрения термодинамики реакции не происходят или идут очень медленно из-за неоптимальности физико-химических факторов, отсутствия или ингибирования необходимых ферментов. Таким образом, реализация потенциальной возможности деструкции ксенобиотика зависит от конкретных условий прохождения процесса.

Преимуществами анаэробных способов очистки являются низкие энергозатраты и образование значительно меньшего количества биомассы (в анаболические реакции вовлекается не более 7% углерода загрязнителя).

Анаэробные микроорганизмы способны осуществлять полную минерализацию многих сложных и токсичных ксенобиотиков, в том числе ряда азокрасителей и ароматических аминов, причем в метаногенных условиях — с образованием полезного продукта, биогаза (Slokar, Majcen Le Marechal, 1998; Калюжный, 2004). Таким образом, на сегодняшний день анаэробная обработка сточных вод, содержащих азокрасители и ароматические амины, представляет собой выгодную альтернативу химическим и физическим, а также аэробным биологическим методам обработки. К недостаткам анаэробной технологии можно отнести большую длительность процессов, неэффективность при низких концентрациях загрязнителей и устойчивость аминоароматических веществ, содержащих сульфогруппы. Поэтому в некоторых случаях (например, для сульфоазокрасителей) предлагается сочетание аэробной и анаэробной обработки стоков, когда расщепление азосвязи происходит путем восстановления в бескислородных условиях, а образовавшиеся ароматические амины разлагаются с участием кислорода (Stolz, 2001; McMullan et al., 2001).

6. Уровни и способы изучения микробной биодеградации.

Изучение процессов деструкции сложных органических веществ, в том числе ксенобиотиков, включает в себя решение нескольких разноплановых задач. Биохимические исследования имеют целью выяснение последовательности реакций разрушения сложного соединения, определение активностей, очистку и снятие молекулярно-биологических характеристик участвующих в них ферментов, способов регуляции разных этапов и т. д.

Микробиологическая сторона вопроса предполагает выяснение микробного состава анаэробных сообществ, роли каждого компонента в нем и способов взаимодействия партнеров, изучение функционирования сообщества как единого целого и определение подходов к созданию искусственных ассоциаций с заданными свойствами. И наконец, технологический аспект

21 проблемы заключается в разработке на основе полученных данных сначала лабораторного, а затем и полномасштабного процесса по очистке модельных и производственно-бытовых сточных вод, его аппаратурного оформления, а также в создании моделей влияния ксенобиотиков на окружающую среду.

Выполнение этих задач требует применения целого комплекса методических приемов (Практикум по микробиологии, 2005). Так, для идентификации азотсодержащих ароматических субстратов и интермедиатов их деструкции используют спектрофотометрическое сканирование в диапазоне длин волн 200−600 нм, газовую хроматографию и ВЭЖХ, массспектрометрию, различные химические и биохимические методы определения основных элементов и веществ. Для выделения чистых культур микроорганизмов-членов сообщества применяют анаэробное и аэробное культивирование на минеральных и богатых, жидких и твердых средах, содержащих или не содержащих основной ксенобиотик. Поддержание выделенных чистых культур также имеет ряд особенностей, поскольку требует создания условий, моделирующих тесные трофические связи в сообществе и его физико-химическую среду (нахождение в матриксе). Затем необходимо определить систематическое положение и потенциальные метаболические возможности полученных чистых культур для составления полной трофической цепи использования ксенобиотика. Для этого применяют разные виды микроскопии, молекулярно-биологическую идентификацию и тесты определителя Берджи. Для выявления и идентификации некультивируемых микроорганизмов-членов сообщества применяют методы, основанные на экстрагировании и исследовании тотальной ДНК (Экология микроорганизмов, 2004; Практикум по микробиологии, 2005; Zengler, 2009). Микробную сукцессию в сообществе во времени вообще и по ходу разложения субстрата) контролируют микроскопически, высевами и молекулярно-биологическими методами генетического фингерпринтинга (денатурирующего и температурного

22 градиентного гель-электрофорезаанализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНКанализа полиморфизма длины фрагментов рестрикциигибридизации флуоресцирующих олигомерных нуклеотидных последовательностей с нуклеиновыми кислотами целых клеток и др.(Миугег, 1999). Подтверждением роли и места каждого микроорганизма в сообществе является создание искусственных микробных ассоциаций, способных разрушать данный ксенобиотик.

7. Пути конверсии азокрасителей у микроорганизмов.

Разложение азокрасителей можно условно разделить на две стадии: 1) разрыв азосвязи, сопровождающийся обесцвечиванием и 2) деградация образовавшихся аминов.

При расщеплении азосвязи нарушается структура хромофорной части красителя и вещество обесцвечивается. Из-за электронакцепторного характера азосвязей лишь некоторые аэробные микроорганизмы, синтезирующие фермент азоредуктазу, способны к внутриклеточному восстановлению азокрасителей с образованием ароматических аминов. Эта реакция является высокоспецифичной и происходит только в присутствии легкоусваиваемого ко-субстрата (пирувата, пептона, глюкозы). Например,

Citrobacter sp. обесцвечивает азокраситель Methyl Red (An et al., 2002), a

Bacillus subtilis — и-аминоазобензол (Zissi et al., 1997), Pseudomonas luteola осуществляет частичное и полное восстановление азосвязи у Reactive Red 22

Chang et al., 2001), a Rhodococcus erythropolis — у Orange II (Hu, 2003).

Sphingomonas sp. 1 CX в аэробных условиях восстанавливает азокрасители, имеющие в структуре изомеры аминонафтола (Coughlin et al., 1999).

Смешанная культура SB4, состоящая из 4 штаммов Bacillus sp. и клеток

Lysinibacillus sp. и Ochrobacterium sp., обесцвечивает краситель Reactive

Violet 5R с образованием 1-диазо-2-нафтола, 4гидроксибензолсульфаниловой кислоты, 2-нафтола и бензолсульфаниловой кислоты в качестве интермедиатов (Jain et al., 2012). Это же сообщество

23 активно и в отношении других азокрасителей. Показано, что культура Brevibacillus laterosporus МТСС 2298 в течение 24 ч обесцветила 87% смеси, содержащей 7 азокрасителей с различными структурами и свойствами при участии комплекса окислительно-восстановительных ферментов (алкогольоксидазы, тирозиназы, NADH-DCIP редуктазы и азоредуктазы, Kurade et al., 2011).

Дрожжи Issatchenkia occidentalis после обесцвечивания Methyl Orange и Orange II могут использовать образовавшиеся амины в качестве источников азота и углерода (Ramalho et al., 2004). Такая же возможность показана для некоторых цианобактерий (Parikh, Madamwar, 2005). Низшие грибы, в частности базидиомицет Phanerochaete chrysosporium (Bumpus, 1995; Stolz, 2001), способны быстро разлагать азокрасители в присутствии кислорода за счёт неспецифичных лигнинпероксидаз, марганцевых пероксидаз и лакказ. В работе Rajendran et al. (2011) 4 адаптированных штамма грибов Aspergillus sp., Penicillium sp., Fusarium sp. и Mucor sp. показали способность к обесцвечиванию азокрасителей Reactive black 5, Amido black-10 В, Red 5B, Reactive red 120 и Anthraquinone violet R. Сообщается, что водоросли из родов Chlorella и Spirogyra способны обесцвечивать азокрасители (Mohan et al., 2002; Acuner, Dilek, 2004).

Под действием анаэробных микроорганизмов азокрасители легко подвергаются фрагментации путем четырехэлектронного восстановления азосвязи с образованием бесцветных ароматических аминов: д, -N = N-R2^.RlNH-NH-R2^Rx-NH2 +H2N-R2.

2Н+ 2 H*

В анаэробных условиях восстановление азокрасителей, вероятно, является неспецифическим процессом (Bumpus, 1995; McMullan et al., 2001). Различными авторами на множестве объектов показано, что одна чистая культура или одно анаэробное микробное сообщество способно обесцвечивать целый спектр азокрасителей различной химической структуры. Среди бактерий упомянуты Proteus sp., Enterococcus sp.,

Streptococcus faecalis, Bacillus pyocyaneus, B. subtilis, B. cereus, Pseudomonas sp., Aeromonas hydrophilia, Caprococcus catus, Fusobacterium sp., Bacteroides thetaitaomicron, Bifidobacterium infantis, Eubacterium biforme,

Peptostreptococcus productus, Citrobacter sp., представители молочнокислой группы, в частности виды рода Lactobacillus (Perez-Diaz, McFeeters, 2009).

Есть данные по анаэробному обесцвечиванию некоторых технических и пищевых азокрасителей микробными сообществами из илов очистных сооружений различных предприятий, из донных осадков естественных водоемов, из микробиоты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) человека и животных (dos Santos et al., 2005; Dafale et al., 2008, Soils et al., 2012). В то же время исследователи пока не пришли к однозначному пониманию механизма анаэробной фрагментации азокрасителей (рис. 2). Обесцвечивание в анаэробных условиях структурно различных азокрасителей микробными сообществами с разными свойствами без лаг-периода свидетельствует о неспецифичности реакции анаэробного восстановления азосвязи. Процесс обесцвечивания азокрасителя анаэробным микробным сообществом может включать в себя в качестве первой стадии адсорбцию на поверхности биомассы и последующее восстановление азосвязи жизнеспособными клетками (Baughman, 1995). При этом молекулярная масса азокрасителя и проницаемость мембраны для данного соединения не имеют значения, так как восстановление красителя происходит внеклеточно и реакция носит скорее случайный характер (Pandey et al., 2007). Высказывается мнение, что анаэробное восстановление представляет собой неспецифичную реакцию детоксикации, поскольку в результате анаэробной конверсии азокрасителей происходило частичное уменьшение токсичности для анаэробного микробного сообщества (Donlon et al., 1995). Однако следует иметь в виду, что традиционный метод оценки токсичности по снижению ацетокластической активности свидетельствует об угнетении именно

25 метаногенов и не позволяет выявить ингибирующее влияние исследуемых соединений на другие группы микроорганизмов-членов анаэробного микробного сообщества.

Прямой ферментативный ДЭ [[^Г^^уйгг-^^^!!] азокраситель ДЭок ^^—/ ароматические амины

Непрямой биологический дэ СЗ^х^-^/^!!] Мок азокраситель ароматические ДЭок Мвос [У V амины

Прямой химический ДЭ ^^ ГХ /" «1 азокраситель ДЭок /\ ароматические амины

Рис. 2. Возможные механизмы анаэробного восстановления азокрасителей (Pandey et al., 2007): Б — бактерия (ферментная система), ДЭ — донор электронов, ДЭок — окисленная форма донора электронов, Мок — окисленная форма медиатора, Мвосвосстановленная форма медиатора.

Есть данные (Rafii, Cerniglia, 1993), что восстановление азокрасителей может быть побочной реакцией внутриклеточного фермента, обычно «работающего» с другими субстратами. В этом случае возникают проблемы проникновения через клеточную оболочку заряженных «тяжелых» молекул азокрасителя. Предположение, что у факультативных анаэробов за неспецифическое восстановление азосвязи отвечают цитоплазматические флавин-зависимые редуктазы, образующие восстановленные флавины, было подтверждено работами Russ et al. (2000) и Stolz (2001), показавшими, что они способны действовать in vitro как азоредуктазы. Скорость разрыва азосвязи возрастала при внесении предполагаемого редокс-медиатора (флавина) (Dafale et al., 2008).

У Sphingomonas xenophaga BN6 скорость неспецифического анаэробного обесцвечивания азокрасителей увеличивалась при добавлении хинонов (антрахинон-2-сульфоната или 2-гидрокси-1,4-нафтохинона), которые выполняют функцию редокс-медиаторов и энзиматически восстанавливаются клетками микроорганизма. Восстановленные формы редокс-медиаторов взаимодействуют с азосвязью в культуральной жидкости в чисто химической реакции. Поскольку хинон-редуктазная активность локализована на мембране, то транспорт сульфонированных азосоединений в клетку в этом случае необязателен (Kudlich et al., 1997). Вовлечение систем ферментов, связанных с мембраной (НАДФН-цитохром с-редуктазы или цитохрома Р45о) в анаэробное восстановление азосвязи было описано на клетках млекопитающих (Zbaida, 1995). Для анаэробных бактерий из кишечника человека (Eubacterium sp., Clostridium sp., Butyrivibrio sp., Bacteroides sp.) было показано, что обесцвечивание сульфонированных азосоединений происходит вне клетки (Rafii et al., 1990; Rafii, Cerniglia, 1995; Rafii et al., 1995; Nam, Renganathan, 2000). Однако остается неясным, как в этом случае внеклеточные азоредуктазы получают НАДН, необходимый для восстановления азосвязи.

С другой стороны, показано, что разрыв азосвязи в анаэробных условиях может происходить без участия микробных клеток под действием как природных (НАДН, НАДФН, ФАД, рибофлавин и др.), так и синтетических антрахинон-2,6-дисульфонат) восстановителей (Nam, Renganathan, 2000;

Stolz, 2001). Окислительно-восстановительный потенциал медиаторов должен лежать между -180 и -430 мВ (dos Santos et al., 2004). В аэробных условиях этот процесс ингибируется, поскольку молекулярный кислород является более выгодным акцептором электронов для восстановленной

27 формы медиатора, чем азосвязь. Такие медиаторы могут образовываться в процессе клеточного метаболизма или могут быть внесены извне.

Другая возможность разрушения азокрасителей в биологических системах

— это химическая реакция с восстановленными неорганическими и

2+ органическими соединениями (Fe, H2S, аскорбат, цистеин и т. д.), присутствующими в стоках или являющимися конечными метаболитами некоторых строгих анаэробов (Libra et al., 1997; Yoo et al., 2000; Stolz, 2001; Yoo, 2002). В этом случае роль микробных клеток в расщеплении азосвязи сводится к производству неорганических восстановителей (Schwarzenbach et al., 1990; Perlingeretal., 1996).

Анализ данных литературы позволяет сделать вывод, что анаэробное восстановление азокрасителей, вероятнее всего, является комплексным процессом, включающим в себя различные механизмы разрыва азосвязи (ферментативный и неферментативный, нуждающийся в окислительно-восстановительных медиаторах и чисто химический), и может локализоваться как внутри, так и преимущественно вне клеток. Это зависит от многих факторов, таких как размер азосоединения, его полярность, стандартный редокс-потенциал и другие физико-химические характеристики (Kudlich et al., 1997; Rau, Stolz, 2003; dos Santos et al., 2004).

В результате восстановительного расщепления азокрасителей в анаэробных условиях образуются различные ароматические амины, которые могут быть как менее, так и более токсичными, чем исходные соединения.

8. Биохимические пути конверсии аминоароматических соединений у микроорганизмов в отсутствие кислорода.

Основной проблемой разрушения аминоароматических ксенобиотиков является химическая стабильность бензольного кольца. В аэробных условиях высокоактивный молекулярный кислород включается в ароматическое кольцо путем введения в молекулу одной или двух гидроксильных групп.

Такие реакции катализируются моноили диоксигеназами, обладающими

28 низкой субстратной специфичностью (Dagley, 1971, 1986; Harayama et al., 1992; Harwood, Parales, 1996). При этом образуется один из центральных интермедиатов (пирокатехин, пирокатехат или гентизат, рис. 3), который далее окисляется с раскрытием кольца в результате ортоили мета-расщепления. Полученные линейные продукты претерпевают ß—окисление до простых кислот и альдегидов, которые в дальнейшем используются для конструктивного и энергетического обмена (Heider, Fuchs, 1997). он пирокатехин пирокатехат гентизат

Рис. 3. Основные ароматические интермедиаты аэробного пути разложения (Dagley, 1971).

В аэробных условиях успешно разлагаются такие соединения как 4-аминофенол и 5-АСК, а наиболее трудноразлагаемыми являются соединения, содержащие сульфогруппу, которые чаще всего образуются при обесцвечивании азокрасителей (Pandey et al., 2007). Только одна чистая культура, относящаяся к роду Alcaligenes (штамм O-l), способна разрушать 2-аминобензолсульфокислоту, сульфанированные бензол и толуол, используя их в качестве субстратов для роста (Thurnheer et al., 1990; Pandey et al., 2007). Аминонафталинсульфокислоту, также часто образующуюся при обесцвечивании азокрасителей, чистые культуры, отнесенные к родам Pseudomonas, Moraxella и Arthrobacter, разлагали или использовали только как источник серы (Nortemann et al., 1986; Pandey et al., 2007).

В анаэробных условиях расщепление ароматических аминов представляет собой сложный многостадийный процесс, в котором задействованы различные ферменты. Вещества, содержащие наряду с бензольным кольцом заместители разной степени сложности, сначала с помощью реакций периферического метаболизма превращаются в центральные интермедиатыбензоил-КоА, резорцин или флороглюцин (рис. 4, 5, 6, Heider, Fuchs, 1997; Carmona et al., 2009).

Рис 4. Периферические пути анаэробной деградации ароматических соединений, ведущие к образованию бензоил-КоА (Heider, Fuchs, 1997).

Трансформация субстрата может происходить путем окисления или восстановления, разрыва С-С-связей заместителей бензольного кольца, декарбоксилирования или отщепления от него О-метильных, серуи азотсодержащих заместителей (иногда для использования в качестве источников соответствующих элементов). Для аминоароматических веществ на первом этапе расщепления характерна реакция удаления аминогруппы с бензольного кольца (рис. 7). Если в молекуле имеется карбоксильная группа, то этой реакции предшествует активация бензольного кольца за счет присоединения к ней кофермента, А с участием растворимых, неспецифичных, индуцибельных КоА-лигаз или КоА-трансфераз и с затратой соон соон

АТФ. он

Рис. 5. Периферические пути конверсии ароматических веществ, ведущих к образованию резорцина и флороглюцина (Heider, Fuchs, 1997).

Рис. 6. Основные ароматические интермедиаты превращения моноароматических соединений в анаэробных условиях (Сагтопа е1 а1., 2009).

Далее отщепление аминогруппы происходит путем восстановительного дезаминирования, катализируемого низкоспецифичными КоА-редуктазами: NH2-C6H4-CO-SKoA+2e+2H^NH3+C6H5-CO-SKoA

Процесс восстановительного дезаминирования ряда субстратов показан в нитратредуцирующих условиях у Tauera aromatica и Azoarcus evansii, а в условиях сульфатредукции — у Desulfobacterium anilini и Desulfobacterium sp. mABl. Ароматические амины без карбоксильных групп (например, анилин) сначала активируются путем карбоксилирования и тиоэтерификации, а затем происходит их дезаминирование. Еще одним путем удаления аминогруппы может быть ее замещение на гидроксил с последующим восстановительным дегидроксилированием. Такую реакцию исследователи отмечали при разложении триптофана, 2- и 3-аминобензойных кислот метаногенными микробными сообществами, а также в денитрифицирующих условиях после карбоксилирования анилина. В литературе встречаются данные также об ацилировании и декарбоксилировании некоторых ароматических аминов (рис. 8) в условиях денитрификации и сульфатредукции, соответственно (Сиволодский и др., 1994; Gilcrease, Murphy, 1995; Noguera, Freedman, 1996). Следует отметить, что расщепление через резорцин и флороглюцин присуще небольшому количеству ароматических соединений, например, фенолам. Наиболее распространенным среди микроорганизмов считается бензоил-КоА-путь анаэробной деградации ароматических соединений. Периферические пути, приводящие к образованию этого центрального интермедиата, включают в себя различные реакции трансформации молекулы (дезаминирование, гидроксилирование, карбоксилирование, ацилирование, декарбоксилирование, восстановление карбоксильной группы и т. д., Bisaillon et al., 1993; Heider, Fuchs, 1997; Slokar, Majcen Le Marechal, 1998; Carmona et al., 2009). В то же время несмотря на значительное число исследований, многие вопросы биохимических превращений аминоароматических субстратов на первых этапах процесса биодеградации до сих пор не выяснены. соон соон nh2 соон соон nh2

Рис. 7. Основные реакции, приводящие к удалению аминогруппы в молекуле аминоароматического вещества: А — восстановительное дезаминирование, Б — карбоксилирование и последующее дезаминирование, В — замещение аминогруппы на гидроксильную группу (Balba, Evans, 1980; Balba et al., 1981; Altenschmidt et al., 1991; Schnell, Schink, 1991, 1992; Lochmeyer et al., 1992; Boopathy et al., 1993; de Alexandra et al., 1994).

CH

NH-> nh,

COOH

OH

OH

NH/ nh2- ^ б

Рис. 8. Реакции ацилирования (А) и декарбоксилирования (Б) ароматических аминов (Сиволодский и др., 1994; Gilcrease, Murphy, 1995; Noguera, Freedman, 1996).

Анаэробное разложение бензоил-КоА включает в себя стадии насыщения ароматического кольца и его деароматизацию с образованием линейных продуктов (рис. 9, Heider, Fuchs, 1997). Затрачивая две молекулы АТФ, бензоил-КоА-редуктаза восстанавливает бензоил-КоА до циклогексо-1,5-диен-1-карбоксил-КоА. Затем происходит гидратация с образованием 6-гидроксициклогексо-1-ен-1-карбокси-КоА и дальнейшее НАД±зависимое окисление и присоединение воды по двойной связи до 2-гидрокси-6-кето-1-циклогексанкарбокси-КоА.

Рис. 9. Схема бензоил-КоА-пути анаэробной деградации ароматических соединений (Heider, Fuchs, 1997).

Первый линейный продукт 3-гидроксипимелил-КоА образуется из него путем гидролиза и затем расщепляется на глутарил-КоА и ацетил-КоА. Далее при участии глутарил-КоА-дегидрогеназы происходит последовательное окисление и декарбоксилирование первого продукта с образованием кротонил-КоА и С02. Кротонил-КоА окисляется до двух молекул ацетил-КоА. Ацетил-КоА может использоваться клетками в метаболических реакциях, обеспечивающих микроорганизм энергией в виде восстановительных эквивалентов и АТФ, а также предшественниками для процессов биосинтеза (рис.10)

Ключевые ферменты, участвующие в анаэробной деградации ароматических соединений, легко инактивируются при контакте с кислородом. В клетках, растущих аэробно, подавляются ферменты

2АТР

Acetyl-CoA анаэробного пути, но небольшие количества неактивных форм ферментов все же имеются, как полагают, для поддержания вспомогательного пути в случае изменения условий окружающей среды. Ферменты анаэробного пути разложения ароматических соединений регулируются также степенью доступности ароматического субстрата. Если клетки растут анаэробно на неароматических субстратах, то ферменты деградации ароматики не обнаруживаются. Ферменты периферических путей деградации обычно индуцибельны и синтезируются в ответ на внесение конкретного субстрата. В некоторых случаях при анаэробном росте наблюдается субстратная диауксия (Dangel е1 а1., 1991; ЬМёег е1 а1., 1998). Есть данные, что гены, кодирующие ферменты анаэробной биодеградации, располагаются как на хромосоме, так и в плазмидах (Сагшопа ег а1., 2009).

А 2 АТР 2АОР рОБСоА 2Н20 2 Р, СОБСоА

NAD*

I < 2 Fdred 2Fdox

NADH V J

2-oxoglutarate CoA succinyl-CoA «» 0U2

Ring opening ?-Oxidation

C02

3 Acetyl-CoA citrate-cycle

Рис. 10. Расщепление бензоил-КоА у Thauera aromatica (Dorner, Boll, 2002).

Обычно гены ферментов периферических и центральных путей организованы в два отдельных кластера (Хоменков и др., 2008). Первые часто кодируются генами плазмид (Heider, Fuchs, 1997). На крупных бактериальных плазмидах могут находиться детерминанты ферментов центральных путей (например, на плазмидах pTOL или pWWO

35 располагаются гены мета-расщепления ароматического кольца, Khomenkov et al., 2005). В то же время, гены ферментов о/?то-расщепления чаще всего располагаются на бактериальной хромосоме (Zylstra et al., 1989; Neidle et al., 1992). Гены, ответственные за деградацию аминоароматических ксенобиотиков, могут распространяться среди микроорганизмов отдаленных таксономических групп с помощью механизмов горизонтального переноса, что способствует адаптации микроорганизмов к ксенобиотикам (Хоменков и др., 2008).

Некоторые факультативные анаэробы (в частности, денитрификаторы) могут совмещать реакции аэробного и анаэробного бензоил-КоА-путей деструкции ароматических соединений (Fuchs, 2008). В такой гибридной цепи реакций на первом этапе ароматическое кольцо бензоата сенсибилизируется путем образования КоА-эфиров (как в бензоил-КоАпути), а при участии молекулярного кислорода в кольцо вводятся гидроксильные группы (как в аэробном пути). Дальнейшие стадии восстановления и гидролиза кольца не требуют присутствия кислорода, т. е. собственно деароматизация осуществляется аналогично этапам бензоил

КоА-пути. Для денитрифицирующих микроорганизмов показано, что на подготовительных стадиях периферического метаболизма они сначала превращают фенилацетат (Luengo et al., 2001; Mohamed et al., 2002), бензоат

Zaar et al., 2001) и 2-аминобензоат (Langkau et al., 1990; Schuhle et al., 2001) в бензоил-КоА или фенилацетил-КоА, которые затем конвертируются при участии диоксигеназ в соответствующие неароматические цисдигидродиолы. Эти интермедиаты повторно восстанавливают свою ароматическую структуру, образуя дигидроксилированные ароматические продукты. Антраниловая кислота через 2-аминобензоил-КоА превращается в моногидроксилированный неароматический интермедиат (Fuchs, 2008).

Наличие такого гибридного альтернативного пути у микроорганизмовчленов сообщества не только дает дополнительную возможность конверсии

36 ароматических субстратов при попадании кислорода извне, но и способствует гибкой и быстрой адаптации микробного сообщества к изменяющимся концентрациям кислорода (Fuchs, 2008).

9. Микроорганизмы, участвующие в анаэробном разложении азокрасителей и аминоароматических соединений.

Анаэробные микроорганизмы, способные разлагать аминоароматику, должны обладать некоторыми общими свойствами, несмотря на то, что относятся они к разным филогенетическим группам. Ароматические вещества являются более восстановленными, чем получающиеся из них продукты, поэтому микроорганизмы, осуществляющие деструкцию таких веществ, должны быть способны утилизировать образующиеся электроны. Их можно обнаружить среди бактерий, осуществляющих брожения, среди аноксигенных фототрофов и среди анаэробно дышащих микроорганизмов. Биодеградация широкого спектра ароматических субстратов чистыми микробными культурами показана в нитрат-, железои сульфатвосстанавливающих условиях, однако в зависимости от окислительно-восстановительного потенциала используемого акцептора электронов, количество запасенной энергии будет разным. Из конечных акцепторов, отличных от кислорода, самым высоким ОВП обладает нитрат (+433 мВ), далее следуют ионы Fe3+ и Мп4+ (около +200 мВ) и сульфат (-200 мВ). Некоторые микроорганизмы с бродильным типом метаболизма способны в качестве акцептора электронов использовать Н^. Однако поскольку этот процесс термодинамически невыгоден, то для отведения молекулярного водорода он требует наличия синтрофного партнера (метаногенов, сульфидогенов или гомоацетогенов).

Для большого числа микроорганизмов показана способность к обесцвечиванию азокрасителей путем восстановительного разрыва азосвязи.

Это представители родов Proteus, Enterococcus, Aeromonas, Streptococcus,

Bacillus, Pseudomonas, Coprococcus, Fusobacterium, Bacteroides, Pediococcus,

Peptostreptococcus, Citrobacter, Eubacterium, Clostridium, Desulfovibrio,

Sphingomonas, Escherichia, а также бактерии молочнокислой группы из родов

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Bifidobacterium (Rafii, Cerniglia, 1993;

Yoo et al., 2000; Stolz, 2001; Perez-Diaz, McFeeters, 2009). Смешанные микробные сообщества из аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов обесцвечивают азокрасители только в бескислородных условиях, хотя могут расти и в аэробных условиях. Чистые культуры

Pseudomonas luteola, Aeromonas hydrophila, Bacillus subtilis, Pseudomonas sp. и Proteus mirabilis для фрагментации азокрасителей путем разрыва азосвязей в анаэробных условиях требуют дополнительного источника углерода и энергии (Pandey et al., 2007). При этом в зависимости от структуры начального субстрата авторы констатируют образование ароматических аминов различной сложности в качестве продуктов. Доказано, что некоторые анаэробные бактерии в кишечнике человека (Clostridium sp., С. leptum, С. clostridiiforme, С. paraputri? cum, С. perfringens, Eubacterium sp., Lactobacillus acidophilus и Lb. fermentum, Salmonella sp., Bacillus sp., Escherichia coli,

Enterococcus faecalis) могут расщеплять азокрасители, а также нитроароматические гидрокарбоны до соответствующих аминоароматических соединений с помощью конститутивных ферментов с азоредуктазной и нитроредуктазной активностью. При этом нитроароматические вещества ингибируют азоредуктазную активность.

Предполагают, что этот фермент — адениндинуклеотиддегидрогеназа может обладать двумя активностями и синтезироваться во всем пространстве клетки без привязки к каким-либо внутриклеточным структурам (Rafii, Cerniglia,

1995; Chen et al., 1999, 2009). Показана способность лактобацилл модифицировать азокраситель тартразин (Lb. casei, Lb. brevis, Lb. paracasei,

Lb. rhamnosus, Lb. plantarum, Lb. curvatus, Leuconostoc paramesenteroides, Leu. mesenteroides, Lactococcus lactis, Lc. cremoris) с образованием продукта с пиками поглощения 361 и 553 нм и массой 111 D (Perez-Diaz, McFeeters,

2009). В анаэробных условиях трансформация красителей лактобациллами происходила намного эффективнее, чем в аэробных. Те же лактобациллы обладали способностью в анаэробных условиях разрушать и другие азокрасители, близкие по структуре к тартразину (Methyl Orange, Acid Orange 8, Acid Orange 63). Авторы предполают, что азокрасители не могли использоваться чистыми культурами лактобацилл как источник энергии (Perez-Diaz, McFeeters, 2009). В ряде работ показана способность к разложению запрещенных к использованию, но встречающихся в некоторых фальсифицированных продуктах азокрасителей группы Sudan микробиотой ЖКТ крыс, кроликов (Chung et al., 1978; Cerniglia et al., 1982) и человека (Xu et al., 2007, рис. 11). Консорциумы из фекалий обесцвечивали азокрасители Sudan I-IV и Para Red в анаэробных условиях с образованием высокотоксичных веществ (анилина, 2,4-диметиланилина, о-толуидина и 4-нитроанилина). О полной минерализации этих соединений микробиотой ЖКТ человека не сообщается.

Появление токсичных соединений зарегистрировано при обесцвечивании азокрасителя Амарант (Е123) культурой Trametes versicolor (Shin et al., 2002). Вывод о токсичности сделан авторами на основании снижения скорости деколоризации через несколько циклов и восстановлении ее прежнего уровня только при замене питательной среды на свежую.

В настоящее время наиболее изученной представляется анаэробная деструкция ароматических аминов, содержащих карбоксильную или гидроксильную группы (аминофенолов, аминобензойных и аминосалициловых кислот). Аминоароматические соединения могут использоваться микроорганизмами в качестве источников углерода и/или энергии, при этом глубина преобразования молекулы субстрата может быть разной. Деструкторы ароматических аминов, выделенные в виде чистых культур и в разной степени охарактеризованные, относятся к разным таксономическим группам домена Bacteria (табл. 2). он нан0

ОН

Intcstind microflora

NH, оnh2

Sudani

Г1 -amino-2-naphthol] aniline

ОН

H=N—0113

ОН

Intestinal microflora

H3C Sudanll

HH3

IfcC 1 -amino-2-naphthol] 2,4;

Sudan 1П он

Intestinal microflora

NH2 H3H—Q-«* + 1 -amino-2 -naphthol] [ 1,4 -phenyien ediamine] aniline

ОН H3C H3C

Sudan IV

OH

Intestinal microflora

H3C H3C

HH2 H2H—^J)—HH2 + H2H—/^Л 1 -amino — 2 -naphlhol] [2,5-diaminotoluene] 0-to lui dine он он

H=H——HOi Intestinal microflora ^ —HH2 + HjH——HOj 1 -amino-2-naphlhol] 4-nitroaniline

Para Red

Рис. 11. Предполагаемый путь разложения азокрасителей Sudan I-IV и Para Red микробиотой ЖКТ человека (Xu et al., 2007).

Большинство видов бактерий-деструкторов для роста предпочитает средние температуры и околонейтральные значения рН и способны выдерживать повышенные концентрации аминоароматических веществ. При использовании трудноразлагаемых соединений усиливается роль кометаболизма, когда проявление способности к преобразованию сложной молекулы обуславливается наличием доступного источника углерода и энергии для поддержания жизнедеятельности, так как сам ксенобиотик не может использоваться микроорганизмом в этих целях.

Таблица 2.

Чистые культуры микроорганизмов, способных к деструкции ароматических аминов.

Микроорганизм, описание Используемые субстраты Условия Ссылка

Thauera aromatica К 172 подвижные грамотрицательные палочки, мезофилы, нейтрофилы, факультативные анаэробы, нитратредукторы с образованием N20 2-аминобензоат, толуол, фенол, бензальдегид, бензиловый спирт, п-крезол, фенилацетат, бензоат, 3,5-дигидроксибензоат, 3-и 4-гидроксибензоат и др. Нитратное дыхание Anders et al., 1995; Heider, Fuchs, 1997

Azoar cus evansii подвижные грамотрицательные палочки, мезофилы, нейтрофилы, факультативные анаэробы, нитратредукторы с образованием N20 2-аминобензоат, бензоат, «-крезол, толуол, 3-и 4-гидроксибензоат, 2-фторбензоат, о-фталат, бензальдегид, бензиловый спирт и др. Нитратное дыхание Anders et al., 1995; Heider, Fuchs, 1997

Thauera chlorobenzoica З-СВ-1, 3-ВВ1, 4-FB1, 4-FB2 подвижные грамотрицательные палочки, мезофилы с topt=30°C, нейтрофилы с pHopt=7,5−8,0, факультативные анаэробы, нитратредукторы 3-аминобензоат, 3- хлорбензоат, 3-бромбензоат, 2- и 4-фторбензоат, бензоат, бензиловый спирт, 3-и 4-гидроксибензоат, протокатехоат, ми п-крезол Нитратное дыхание Song et al., 2000, 2001

Magnetospirillum sp. CC-26 спиральные грамотрицательные клетки с биполярными жгутиками, факультативные анаэробы, нитратредукторы 2- и 3-аминобензоат, бензальдегид, бензоат, бензиловый спирт, п-крезол, 3- и 4-гидроксибензоат, фенол, фенилацетат Нитратное дыхание Shinoda et al, 2000

Delftia sp. HY99 (близок к виду Delftia acidovorans) подвижные грамотрицательные, палочковидные клетки, факультативные анаэробы, нитратредукторы анилин Нитратное дыхание Kahng et al., 2000

Desulfobacterium sp. mABl неподвижные грамотрицательные короткие палочки, мезофилы, нейтрофилы с pHopt=7,0−7,5,строгие анаэробы, сульфатредукторы 3-й 4-аминобензоат Сульфатное дыхание Schnell, Schink, 1991, 1992

Desulfobacterium anilini неподвижные короткие палочки, мезофилы с t0pt=35oC, нейтрофилы с pHopt=6,9−7,5,строгие анаэробы, сульфатредукторы анилин, 2- и 4-аминобензоат, фенол, бензоат, «-крезол, 2-, 3- и 4-гидроксибензоат, некоторые дигидроксибензоаты Сульфатное дыхание Schnei et al., 1989; Schnell, Schink, 1991

Desulfobacula toluolica «яря-мети ланилин Кометабо-лизм в Raber et al.,

То12 неподвижные короткие палочки, строгие анаэробы, сульфатредукторы присутствии толуола как донора электронов в сульфатном дыхании и как источника углерода 1998

Rhodopseudomonas palustris подвижные грамотрицательные прямые палочки, Rhodospirillum fulvum подвижные грамотрицательные спиральные палочки, Rhodocyclus purpureus неподвижные грамотрицательные сильно изогнутые клетки, иногда в виде кольца 4-аминобензоат, 4-аминофенол, бензоат, 4-гидроксибензоат, фенилсодержащие жирные кислоты, метоксизамещенные ароматические соединения Аноксигенный фотосинтез Khanna et al, 1992

Klebsiella pneumoniae subspp. pneumonia, ozaenae, К. mobilis, К. oxytoca подвижные грамотрицательные прямые палочки 5-аминосалицилат, п-аминофенол Кометабо-лизм при сбраживании глюкозы Сиволодс-кий и др., 1994

В условиях кометаболизма чистая культура, как правило, не размножается и трансформирует чужеродное соединение с постоянно низкой скоростью, накапливая продукты трансформации в среде. Потребление ко-субстрата, повидимому, является источником восстановительных эквивалентов для реакции трансформации.

Некоторые бродилыцики {Syntrophus aciditrophicus, Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum) способны сбраживать бензоат (Elshahed, Mclnerney, 2001, Plugge et al., 2002), a Sporotomaculum hydroxybenzoicum — 3-гидроксибензоат (Muller, Schink, 2000). Информация о сбраживании чистыми культурами микроорганизмов-бродилыциков какой-либо аминоароматики отсутствует.

ВЫВОДЫ:

1. Из илов очистных сооружений и донных осадков природных водоемов выделены и изучены анаэробные микробные сообщества, стабильно (5−10 лет) и с высокой активностью обесцвечивающие азокрасители и конвертирующие аминоароматические кислоты (0,07−0,8 мМ/сут) в биогаз, что делает их перпективными для биотехнологического использования.

2. Установлено, что анаэробная конверсия азокрасителей в биогаз, осуществляемая микробными сообществами, включает неспецифическую стадию обесцвечивания и специфический этап трансформации образовавщихся ароматических аминов, различающиеся механизмами, регуляцией и отношением к параметрам культивирования.

3. Определены продукты фрагментации испытанных азокрасителей и впервые идентифицированы основные ароматические и линейные интермедиаты анаэробной деструкции ААК. Предложена общая схема процесса разложения ААК путем первичной трансформации до соответствующих ароматических спиртов, окисляющихся до бензойной кислоты, с ее последующей деароматизацией и образованием смеси ЛЖК, спиртов, СОг и Н2, превращающихся через синтрофную стадию в биогаз. Установлено, что метаногенные сообщества разрушают ААК по бензоил-КоА-пути.

4. Показано, что ААВ оказывают селективное воздействие на метаногенные микробные сообщества, снижая общее количество клеток и биоразнообразие в них и вызывая смену доминирующих видов. В свою очередь, активные консорциумы в определенных пределах способны к самокоррекции своей структуры в ответ на воздействие различных факторов.

5. Определен компонентный состав активных метаногенных сообществ и показано преобладание в них некультивируемых микроорганизмов, близких к Bacteroidetes и Clostridium. Выделено и идентифицировано до вида 7 чистых культур, установлены их возможные функции и предложена схема трофических связей при конверсии ААК в биогаз.

6. Показана принципиальная возможность «конструирования» сообществ с заданными свойствами как из микроорганизмов, выделенных из консорциумов различного происхождения, так и из коллекционных культур с аналогичными свойствами.

7. Путем лабораторного моделирования продемонстрирована необходимость проведения тщательного мониторинга судьбы ААВ в окружающей среде и в организме человека и животных из-за их неполного разложения в ЖКТ, способного привести к негативным изменениям структуры и функционирования нормальной микробиоты млекопитающих. Показана принципиальная возможность использования кишечных микробных сообществ для первичного тестирования пищевых азокрасителей.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность своему научному консультанту д.б.н., проф. Нетрусову А. И. и д.х.н., проф. Калюжному C.B., по инициативе которых было начато это исследование, за постоянное внимание, помощь и заинтересованное обсуждение результатов.

Автор искренне признателен своим соратникам, принимавшим участие в работе на разных ее этапах: сотрудникам, дипломникам и аспирантам каф. микробиологии биологического факультета МГУ им. Ломоносова — к.б.н. Линьковой Ю. В., Дьяконовой А. Т., к.б.н. Савельевой О. В., Есаковой A.A., Куликовой И. А., Пуреховской К. А. и сотрудникам каф. химической энзимологии химического факультета МГУ им. Ломоносова — к.х.н. Скляру

B.И., к.х.н. Емашовой H.A. и к.х.н. Гладченко М.А.

Хотелось бы выразить огромную благодарность д.б.н., проф. Егорову Н. С., в группе которого я начинала свою научную деятельность, и с бесконечной признательностью вспомнить моего первого наставника к.б.н. Н. С. Ландау.

Автор искренне благодарен д.б.н. Т. Г. Юдиной за консультации и помощь в осуществлении электронно-микроскопических исследований, к.б.н. Е. С. Милько — за консультации и методическую помощь в вопросах диссоциации микроорганизмов, к.б.н. Е. В. Семеновой — за критическое обсуждение проблем биодеградации ксенобиотиков, к.б.н. Т. А. Чердынцевой — за участие в работе с лактобациллами, постоянную экспериментальную помощь и моральную поддержку.

Автор признателен д.б.н. Т. П. Туровой (Институт микробиологии им.

C.Н.Виноградского РАН) и сотрудникам группы молекулярно-биологической идентификации Центра «Биоинженерия» РАН за помощь в проведении и интерпретации результатов филогенетического анализа.

Хочется поблагодарить проф. А. Стамса и сотрудников его лаборатории (Университет Вагенингена, Нидерланды) за предоставление аппаратурной базы, методическую помощь, обсуждение результатов и советы по дальнейшим направлениям исследований.

Автор выражает признательность всем сотрудникам и преподавателям кафедры микробиологии, оказывавшим разнообразную помощь и поддержку в процессе выполнения работы.

Большое спасибо членам моей семьи и моим друзьям за постоянную моральную поддержку и веру в успех.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Природные и синтетические вещества, содержащие в молекулах ароматическое кольцо, обладают значительной стабильностью, что препятствует их разложению до простых соединений и приводит к дисбалансу синтетических и деструктивных процессов в глобальных циклах элементов. Повсеместное использование в промышленности и в быту азокрасителей и аминозамещенных ароматических веществ ведет к возрастанию их выброса в окружающую среду, создает избыточное давление на самоочищающую способность естественных местообитаний и принимает угрожающий характер из-за их быстрого распространения по трофическим цепям и токсического, мутагенного или канцерогенного влияния на живые организмы даже в малых дозах. Неэффективность традиционных способов очистки по отношению к таким соединениям стимулировала нас к изучению их анаэробной деструкции с упором на полную минерализацию загрязнителя с образованием биогаза как альтернативного источника энергии. Поскольку метаногенное разложение природных органических отходов давно и успешно применяется в очистке сточных вод, оно и было взято нами за основу. Главной целью работы было детальное изучение процесса полной метаногенной деструкции ААВ и соотнесение с ним изменений в структурно-функциональной организации активного сообщества. Такие исследования к моменту написания нашего труда в литературе представлены не были.

Выбор биологического материала диктовался наличием или теоретической возможностью осуществления метаногенного разложения органических веществ у его источника, т. е. из доступных это могли быть анаэробные донные отложения природных водоемов, анаэробные осадки очистных сооружений, а также ЖКТ животных. Нами проведен скрининг одиннадцати видов анаэробных осадков различного происхождения на их способность разрушать ААВ. Выделен ряд активных микробных сообществ, полностью минерализующих субстрат с образованием биогаза в качестве конечного продукта и сохраняющих такую способность при повторных добавлениях новых порций субстрата и при многократных пересевах в свежую среду. Такие активные сообщества выделены нами как из источников, где подобные загрязнения могли иметь место, так и из естественных водоемов, не загрязнённых соответствующими веществами.

Для исследования полной трофической цепи метаногенной конверсии ААВ и изучения структурно-функциональной организации осуществляющих ее сообществ был применен комплексный подход с использованием микроскопических, микробиологических, молекулярно-биологических и химических методов. Поскольку априори результат был непредсказуем, то на начальной стадии работы задействовали максимально возможный спектр сред и условий культивирования: применяли анаэробную и аэробную инкубацию на минеральных и богатых, жидких и твердых средах, содержащих или не содержащих основной ксенобиотик, а также предполагаемые интермедиаты его деструкции. Наше предположение, что классическая схема анаэробного разложения биополимеров с превращением в биогаз, изменится на начальных этапах (см. рис. 22), подтвердилось. Нам удалось получить анаэробные микробные сообщества, которые стабильно (более 5−10 лет) с высокой скоростью разрушают азокрасители и ААК до биогаза, что делает их перпективными для технологического использования. Множественность подходов к решению глобальной проблемы очистки окружающей среды от отходов и загрязнений, особенно антропогенных и ксенобиотических, позволяет надеяться в будущем на их полную переработку в полезные продукты наиболее «дружественными» природе способами.

Несмотря на разнообразие использованных сочетаний температуры инкубации и кислотности среды, оптимальными для процесса биодеградации в

382 целом оказались 30 °C и рН=6,5−7,5, хотя для реакции обесцвечивания нами продемострированы несколько отличающиеся параметры. Так, самая лучшая в испытанном диапазоне температура для обесцвечивания азокрасителей (55°С) приводила к полному ингибированию деструкции ААК (т.е. последующих реакций в цепи полной минерализации). Стадии трансформации и деароматизации требовали значительной плотности инокулята (50% и более), тогда как для разрыва азосвязи было достаточно 5−10% содержания посевного материала. Эти данные еще раз свидетельствуют о различном механизме этапов обесцвечивания азокрасителей и дальнейшего преобразования аминов-интермедиатов. Следует также особо подчеркнуть, что в природных местообитаниях, из которых происходят илы донных отложений, физико-химические параметры не соответствуют оптимальным для эффективного и полного процесса деструкции ААВ. Это несоответствие является одним из существенных ограничителей протекания анаэробной биодеградации таких соединений при показанной нами его потенциальной возможности и наличии микроорганизмов необходимых функциональных групп. Медленная и неполная биодеструкция может приводить к появлению и длительному персистированию в природных водоемах токсичных для живых организмов (амино)ароматических интермедиатов. Эти соединения, быстро накапливаясь, могут оказывать значительное влияние на структуру всей экосистемы. Поскольку в природных водоемах невозможно привести физико-химические факторы к требуемым значениям, то при сбросе стоков, загрязненных ААВ, необходимо применять дополнительные методы очистки в искусственных системах с использованием специально разработанных препаратов на основе анаэробных микробных сообществ.

Выделенные нами микробные сообщества с высокой скоростью и без лагпериода обесцвечивали структурно различные азокрасители путем восстановления азосвязей, что свидетельствует о неспецифичности этой реакции. Интересен также факт, что микробные сообщества, полученные из

383 ила КСА, обычно растущего и функционирующего при значительной аэрации (активный ил КСА), при культивировании без доступа кислорода обесцвечивали азокрасители. При длительной инкубации в анаэробных условиях у них проявилась устойчивая способность не только к обесцвечиванию (что неудивительно, так как в дальнейшем нами показано участие в этом процессе факультативных и аэротолерантных анаэробов), но и к осуществлению дальнейшей деструкции ароматических аминов вплоть до полной метаногенной минерализации. Это подтверждает имеющиеся в литературе сведения о присутствии строго анаэробных микроорганизмов в аэробных местообитаниях, если они входят в состав сложных агрегированных ассоциаций (находятся в их глубинных локусах) совместно с аэробными и факультативно анаэробными партнерами (Elvers, Lappin-Scott, 2000; Leadbetter, 2000; Заварзин, 2003; Литти, 2012).

Нашими исследованиями установлено, что реакция восстановления азосвязей в анаэробных сообществах имеет преимущественно внеклеточную локализацию и неспецифический характер и происходит под действием восстановленных веществ-медиаторов (сульфида, НАДН и др.), являющихся продуктами метаболизма микробного сообщества в анаэробных условиях.

Живые микробные клетки постоянно пополняют пул таких веществ за счет ферментативного восстановления их окисленной формы. Широко распространенный в живых клетках медиатор рибофлавин может участвовать в переносе восстановительных эквивалентов для этой реакции. Попаданию в среду определенного количества внутриклеточных восстановительных эквивалентов способствует происходящий в любом микробном сообществе лизис части популяции. Следует отметить, что возможен также лизис клеток за счет экзогидролаз, выделяемых микроорганизмами группы целлюлозолитиков, вида Proteiniphilum acetatigenes и штаммов Pseudomonas aeruginosa в виде Мдиссоциантов, наличие которых в сообществах показано нами. Поскольку в сообществах отмечено присутствие факультативных анаэробов, не исключена

384 возможность участия в процессе обесцвечивания азокрасителей и каких-то специфических механизмов (например, восстановление азоредуктазами этих микроорганизмов), однако, предложенный нами механизм, вероятно, является преобладающим в случае именно анаэробных микробных сообществ.

Образующиеся в результате восстановительного расщепления азокрасителей в анаэробных условиях различные ароматические амины могут быть как менее, так и более токсичными, чем исходные соединения. Наши исследования подтвердили, что традиционный быстрый и удобный метод оценки токсичности по снижению ацетокластической активности свидетельствует об угнетении именно метаногенов и не позволяет выявить ингибирующее влияние исследуемых соединений на другие группы микроорганизмов-членов анаэробного микробного сообщества. Проверка влияния ААВ, осуществленная нами на выделенных из сообществ чистых культурах, показала, что одно и то же соединение может не ингибировать ацетокластический метаногенез и одновременно значительно подавлять развитие других членов трофической цепи (например, Тп в концентрации 1 мМ не влиял на ацетокластический метаногенез в сообществе, но на 12−40% подавлял рост лактобациллнетоксичная в концентрации 9 мМ для ацетокластической активности сообщества 5-АСК в той же концентрации полностью ингибировала рост С. /геипсШ Д? А1). Доказательством «небезразличности» ААВ для микроорганизмов-членов сообщества также является наблюдаемое снижение общего количества клеток и изменение соотношения морфотипов, более выраженное в случае ароматических аминов как начальных субстратов.

Если первая стадия деструкции азокрасителей «микробиологически» неспецифическая и протекает сравнительно быстро и, как правило, без лагпериода, то следующий этап, наоборот, требует значительных периодов адаптации и наличия определенных микроорганизмов, способных к реакциям трансформации и деароматизации. Поскольку образующиеся в качестве продуктов обесцвечивания ароматические амины различаются по

385 биодеградабельности, то полная минерализация азокрасителей в метаногенных условиях иногда затруднительна. Более того, ряд аминов-интермедиатов, которые подвергались преобразованиям в случае деструкции азокрасителя как основного субстрата, при использовании в качестве исходных субстратов либо не потреблялись совсем (как ДМФ), либо минерализовались более медленно как 4-аминорезорцин, изомеры АБК и 5-АСК). Довольно длительные лагпериоды при адаптации к ААК и сходные природа и последовательность появления промежуточных и конечных продуктов, наблюдаемые у микробных сообществ из различных источников, говорят об универсальности цепи реакций утилизации этих субстратов, имеющей в основе классическую схему метаногенной минерализации биополимеров. Выявленный нами наиболее вероятный в данных условиях путь разложения ААК (бензоил-КоА-путь) считается преобладающим анаэробным путем в мире микробов (Heider, Fuchs,

1997). Реализация альтернативных (флороглюцинового и резорцинового) путей в изученных сообществах нами не обнаружена. Внесение доступного косубстрата в микробное сообщество существенно увеличивало скорость деградации субстратов, однако этанол, действенный для стадии обесцвечивания, был малоэффективен на стадии трансформации и деароматизации, что может объясняться тем, что С. freundii WA1, ответственный за эту стадию, не растет на этаноле. Пиру ват же является важнейшим амфиболитом клеток и обеспечивает многочисленные пути взаимопревращений органических веществ, поэтому его использование в качестве легкодоступного субстрата приводило к стимуляции процесса кометаболизма ААК. Увеличение скоростей обесцвечивания азокрасителей и деструкции ААК при внесении доступного ко-субстрата в сообщества и его необходимость в случае потребления ААВ выделенными чистыми культурами подтверждает «энергетическую напряженность» метаногенной конверсии ААВ для сообществ) и невозможность использования ААВ в качестве ростовых субстратов (для чистых культур). Внесение дополнительного акцептора

386 электронов в активные метаногенные сообщества, длительно контактирующие с ААВ, имело разные последствия для стадий обесцвечивания азокрасителей и деструкции ААК. Так, наличие сульфата и особенно нитрата в среде резко замедлило деколоризацию на фоне прохождения сульфатили нитратредукции, что было ожидаемо, а вот в сообществах, разрушающих ААК, восстановления нитрата и сульфата не наблюдали, хотя в исходных илах сульфати нитратредуцирующая активность присутствовала, а при определении количества сульфатредукторов в активных сообществах их количество составило более 106 клеток/мл. Даже в «свежих» накопительных культурах из исходных илов добавление нитрата и сульфата, вопреки ожиданиям, либо стимулировало незначительно, либо вообще ингибировало разложение ААК по сравнению с условиями метаногенеза. Таким образом, нами установлено, что в сообществах присутствуют микроорганизмы, способные к сульфат- (WSR) и нитрат- (P. aeruginosa ASA2 и Tsaydam-5-ASA, С. freundii WA1, В. subtilis ЕР-ABA) редукции, но эта функция у них «выключена», реализуется при каких-то дополнительных условиях либо количество клеток недостаточно для ее проявления.

Ингибирование последней метаногенной стадии процесса биодеградации при отсутствии доступного углеродного субстрата полностью прекращает деструкцию ААК и практически не влияет на активность обесцвечивания азокрасителей, что еще раз говорит о «дополнительности» и неспецифичности реакции восстановления азосвязи, за которую могут отвечать сразу несколько групп микроорганизмов и она, вероятно, регулируется другим способом.

Очевидно, именно специфические стадии и ответственные за них микроорганизмы являются определяющими при формировании структуры активного сообщества (его компонентного состава, морфологии агрегатов, соотношения членов). Даже такой простой и грубый, но наглядный способ изучения изменений состава сообществ как подсчет морфотипов клеток под микроскопом, продемонстрировал, что контакт с ароматическими аминами приводит к более серьезным подвижкам структуры сообщества, чем с азокрасителями. Именно при деградации аминов (на примере ААК) отмечено соответствие фазы процесса деструкции и изменений культуральных признаков и микроскопической картины сообществ. Особенно четко это прослеживалось в первых циклах потребления субстратов, когда скорость процесса была невелика и удалось зарегистрировать основные ароматические и линейные интермедиаты. В последующих циклах при стабилизации активности эти волнообразные повторяющиеся колебания параметров сглаживались (интермедиаты практически не улавливались, колебания структуры не наблюдали). Активные и стабильные анаэробные сообщества независимо от происхождения представляли собой сбалансированные микробные ассоциации с минимизированным числом компонентов.

Отсутствие прямой корреляции между концентрацией и степенью морфологического разнообразия исходного биологического материала и последующей активностью биодеградации в выделенных из него сообществах мы объясняем следующими причинами. Во-первых, на сегодняшний день не существует метода, адекватно отражающего реальное содержание живых клеток в агрегированном биоматериале, поскольку его значительную часть составляет матрикс и заключенные в нем метаболиты. Во-вторых, для протекания процесса биодеградации важны скорее не систематические позиции микроорганизмов, а их метаболические (функциональные) возможности, а морфологическое разнообразие может отражать большее присутствие «сателлитных» (необязательных для процесса) микроорганизмов.

Для определения состава активных сообществ мы сочетали молекулярнобиологические и микробиологические методы анализа. Следует отметить, что не все микроорганизмы, присутствующие в сообществе по данным ДГГЭ, были получены в виде чистых культур, так же как и ряд выделенных культур не был выявлен при молекулярно-биологическом анализе. Такое частичное несовпадение результатов из-за отсутствия универсального, единого, не имеющего ограничений способа определения состава сложных многокомпонентных сообществ отмечают многие авторы (Diaz et al., 2006; da

Cruz Pedrozo Miguel et al., 2010; 2011; Chen et al., 2011). Как и ожидалось, большинство микроорганизмов в сообществе оказалось некультивируемыми, а те, которые удалось выделить в виде чистых культур, являлись представителями рутинных систематических групп, факультативными или аэротолерантными анаэробами с довольно пластичным метаболизмом.

Присутствующий в сообществе и зарегистрированный с помощью ДГГЭанализа штамм Proteiniphilum acetatigenes нам выделить пока не удалось. В то же время, ряд штаммов, не детектированных путем ДГГЭ-анализа, были получены в виде чистых культур при рассевах (С. freundii WA1, P. aeruginosa

ASA2 и Tsaydam-5-ASA). Следует отметить, что легче выделяться будут не только штаммы, которые численно преобладают в сообществе, но и те группы микроорганизмов, которым больше подходят условия культивирования на использованных в работе средах. При вхождении в состав агрегата большого количества видов микроорганизмов может не происходить четкого разделения материала при ПЦР и форезе. Кроме того, могут не разделиться ампликоны близкородственных и немногочисленных по количеству клеток штаммов, которые в то же время могут хорошо расти на использованных средах, накапливаться там и легко выделяться в виде чистых культур. Действительно, мы наблюдали на гелях многочисленные полосы низкой интенсивности или размытые участки, которые было невозможно амплифицировать. С другой стороны, и микробиологический анализ из-за отсутствия универсальных сред и неполного соблюдения условий естественного развития микроорганизмов в ассоциациях не может считаться всеобъемлющим. Поэтому наиболее полно удалось охарактеризовать состав активного метаногенного сообщества с помощью комплекса методов (ДГГЭ-анализ, классические микробиологические приемы выращивания и выделения культур и прямые микроскопические наблюдения). Однако точное определение метаболических

389 возможностей и других свойств микроорганизмов, входящих в изучаемые сообщества, возможно только после выделения их в виде чистых культур. Такие исследования необходимы для определения роли каждого члена сообщества в процессе образования конечного продукта.

По нашим данным выделенные микроорганизмы могут осуществлять в сообществе несколько функций. Так, С. freundii WA1 проводит реакцию первичной трансформации изомеров АБК и АСК, за короткое время (25−32 ч) восстанавливая и одновременно дезаминируя их до бензилового (БС) и 2-гидроксибензилового (2-ГБС) спиртов, соответственно, а также восстанавливая бензальдегид (БА) до БС. Это первый из микроорганизмов, способный к такой реакции, поскольку другой известный «первичный деструктор» Desulfovibrio vulgaris PY1 (Bock et al., 2000) восстанавливает 3-АБК на фоне сбраживания пиру вата только до 3-аминобензилового спирта (без отщепления аминогруппы) со значительно более низкой скоростью (17−20 сут). Так как С. freundii WA1 не может восстанавливать соответствующие незамещенные карбоксильные ароматические кислоты, то вероятно восстановление ААК включает два этапа (см. рис. 113), как показано для ряда бактерий (Genthner et al., 1997; van den Ban et al., 1999; Bock et al., 2000), с образованием БА как промежуточного продукта. Однако в культуральной жидкости С. freundii WA1 БА не обнаруживался. Это может свидетельствовать о том, что культура восстанавливает альдегид до спирта намного быстрее, чем превращает ААК в БА, аналогично клеткам P. furiosus (van den Ban et al., 1999). Интересно, что в сообществе зарегистрировано превращение 2-ГБС в БА, который затем окислялся до БК. У С. freundii WA1 нами не обнаружена способность к дисмутации Б А, показанная Parshina et al. (2003) для Soehngenia saccharolytica, когда БА эквимолярно восстанавливался до БС и окислялся до БК. Наши данные также показывают «предпочтения» культуры в положении заместителя ароматического кольца. Так, 5-АСК и ее стерео-изомер 3-АБК (по аминогруппе) восстанавливались С. freundii WA1 с высокой скоростью, тогда как другие изомеры — значительно менее эффективно.

Нам не удалось выделить микроорганизмы, осуществляющие раскрытие кольца, хотя эксперименты показывают, что активные сообщества потребляют БК, превращая ее в линейные интермедиаты. Вероятно, за эту реакцию могут отвечать детектированные в сообществе некультивируемые микроорганизмы, близкие к роду Clostridium, и сульфатредукторы из выделенных нами ко-культур или это интегральная функция, возникающая при наличии определенного сочетания микроорганизмов. Первое предположение основано на сведениях об универсальности клостридий, которые способны сбраживать широкий спектр химически разных субстратов, включая салицин и метоксилированные бензоаты (Clostridium methoxybenzovorans, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2009). Вторая возможность базируется на наличии у ко-культуры WSR сульфатредуцирующей активности и сведений из литературы о сбраживании бензоата и 3-гидроксибензоата Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum (Plugge et al., 2002) и Sporotomaculum hydroxybenzoicum (Muller, Schink, 2000), а также об окислении ароматики Desulfobacterium sp. тАВ1и Desulfobacterium anilini (Schnel et al., 1989; Schnell, Schink, 1991, 1992) в условиях сульфатредукции. Наконец, нельзя исключать, что свойство раскрывать бензольное кольцо может возникать при сочетании метаболических возможностей нескольких микроорганизмов, что подтверждается фактами деароматизации в искусственных сообществах, созданных нами из микроорганизмов и ко-культур, отдельно не показавших такой способности.

Основным «местом действия» других выделенных нами чистых и кокультур (кроме псевдомонад), очевидно, является «бродильный блок» трофической цепи разложения ААВ. Они способны осуществлять различные виды брожений образовавшихся линейных интермедиатов деароматизации.

Присутствующий в сообществе и зарегистрированный с помощью ДГГЭ

391 анализа штамм Proteiniphilum acetatigenes нами пока не выделен, однако предположение о его функциях основаны на описании штаммов этого вида, полученных также из UASB-реактора, обрабатывающего стоки пивоваренного производства (Chen, Dong, 2005). Изученные авторами штаммы не использовали сахара, спирты и жирные кислоты, но конвертировали пируват в ацетат и С02. Поэтому в цепи реакций сообщества он должен быть поставлен на стадию брожения. Ко-культура WAC, обладающая активностью гомоацетогенеза, может также обеспечивать дополнительный небольшой «поток» ацетата. «Классических» синтрофных микроорганизмов в сообществе выявить не удалось, однако, как известно, сульфатредукторы могут становиться синтрофами в отсутствие сульфата, что в данном случае и может иметь место. Завершающие этапы полной минерализации ААВ в сообществе осуществляют выявленные с помощью Д11 Э-анализа Methanosarcina mazeii (в основном, водородотрофный и Ci-метаногенез) и Methanosaeta concilii (ацетокластический метаногенез).

Таким образом, основные члены метаногенных сообществ, разрушающих ААК, выделены в виде чистых или ко-культур. Изучение их свойств и последующее совместное культивирование позволило нам проследить возможные трофические связи в сообществе (см. рис. 128) и подтвердить цепь реакций конверсии ААК в биогаз (см. рис. 78). В активном сообществе, где отсутствуют какие-либо другие источники углерода, кроме ААК, восстановительные эквиваленты, необходимые для первых стадий трансформации субстрата, поставляются, вероятно, последующими реакциями окисления ароматических спиртов (БС или 2-ГБС) или бензоата (БК).

В качестве дополнительных возможностей выделенных лактобацилл и С. freundii WA1 нами показана их способность к восстановлению азосвязей. Не исключено, что выделенные нами штаммы псевдомонад, В. subtilis и М. osliensis тоже могут участвовать в этой реакции, но нам не удалось создать им подходящие для этого условия роста вне сообщества. Другие авторы отмечают

392 такую способность для представителей этих видов (Pandey et al., 2007; Dafale et al., 2008). По-видимому, обесцвечивание азокрасителей сообществами следует рассматривать как «надстроечную», необязательную (дополнительную) функцию, что подтверждается ее наличием у консорциумов, разрушающих ААК, но никогда ранее не контактировавших с азокрасителями.

Роль в процессе биодеградации ААК выделенных из активных сообществ представителей вида P. aeruginosa нам выявить не удалось, поскольку в условиях существования сообщества они не участвовали ни в одной из стадий процесса. Однако показанная нами возможность функционирования химического пути трансформации ААК подтверждена созданием искусственных ассоциаций P. aeruginosa ASA2+nrraMM WH. Впервые показана возможность опосредования клетками псевдомонад химической реакции трансформации ААК за счет биологической нитратредукции в присутствие нитрата. Реакция образования арилдиазония (диазонирования) в нашем случае, в отличие от литературных данных, наблюдалась при нейтральном рН и низком значении окислительно-восстановительного потенциала. Искусственная ассоциация P. aeruginosa АБА2+штамм WH продемонстрировала вероятность протекания таких микропроцессов в реальных стоках как альтернативную метаногенной конверсии при изменении физико-химических условий и как дополнительную и локальную внутри агрегированного сообщества.

Другие свойства выделенных культур, возможно, реализуемые в активных сообществах, могут быть проанализированы с привлечением литературных данных. Так, для факультативных анаэробов-членов сообщества одной из защитных функций может считаться поглощение проникшего кислорода для поддержания анаэробных условий. Снабжение партнеров различными ростовыми факторами также следует отметить как дополнительную роль в консорциуме для таких культур как Proteiniphilum acetatigenes, Мдиссоцианты P. aeruginosa, лактобациллы и В. subtilis, для которых

393 установлено наличие экзогидролазной (в частности, протеолитической) активности (Chen, Dong, 2005; Милько и др., 2008, 2010; Bergey’s Manual of

Systematic Bacteriology, 2005, 2009). Это качество важно при создании легкоусваиваемых (ко-)субстратов внутри сообщества для осуществляющего в процессе кометаболизма трансформацию ААК С. freundii WA1, а также для развития лактобацилл, требующих богатой среды для роста. Выделяющие значительное количество слизи клетки М-диссоциантов псевдомонад-членов сообщества могут участвовать в образовании матрикса агрегатов. Для В. subtilis показана способность продуцировать обладающие перекрёстным действием адаптогены, защищающие клетки от стрессорных воздействий (в том числе, от влияния токсических веществ, Николаев, 2011). В микробном сообществе, где имеют место межвидовые взаимодействия, осуществляющиеся с участием низкомолекулярных видонеспецифичных метаболитов, перекрёстное действие внеклеточных адаптогенов может обеспечивать его устойчивое функционирование. Входящие в состав консорциума представители рода Pseudomonas, способные, по данным литературы, к синтезу внеклеточных поверхностно-активных веществ (ПАВ)биосурфактантов (Милько и др., 2010; Семенова и др., 2011), могут помогать более эффективному проникновению гидрофобных и малорастворимых ксенобиотиков через цитоплазматическую мембрану клеток (Fuchedzhieva et al., 2008). Внесение ПАВ используется как один из приемов при очистке почвы и воды от ксенобиотиков, поэтому микроорганизмы, вырабатывающие биосурфактанты, часто включают в биопрепараты. Так, выделенный из почвы, загрязнённой тринитротолуолом (ТНТ), штамм Pseudomonas putida BS320, активно трансформирует данный ксенобиотик в присутствии глюкозы и одновременно синтезирует ПАВ, ускоряющие деградацию ТНТ в почве и воде

Воробьёв и др., 2007). Штамм Pseudomonas sp. 51, обладающий способностью образовывать ПАВ, при внесении в разлагающую нефть микробную ассоциацию повышает эффективность деструкции нефти с 50 до 80%

Семёнова и др., 2011). Вероятно, одной из функций выделенных нами штаммов P. aeruginosa может быть синтез внеклеточных ПАВ, увеличивающих эффективность биодеструкции ААК микробным сообществом. Для псевдомонад также показана способность синтезировать алкилоксибензолы (АОБ) с радикалами С2-С8 (Николаев, 2011), проявляющие ауторегуляторные и адаптогенные эффекты. АОБ повышают физиологическую активность клеток в неоптимальных для роста условиях, проявляя в том числе антиоксидантное действие. Адаптогенный эффект в этих случаях может выражаться в существенном повышении пролиферативной активности клеток при «дозах» стрессового фактора, приближающихся к границам толерантности для вида.

Таким образом, микроорганизмы в составе сообщества могут иметь не только основные «биохимические» функции по выполнению этапов процесса деструкции ААК, но и участвовать в стабилизации, регуляции и защите консорциума, тем самым повышая его активность. Возможности регуляции метаболизма сообщества, по-видимому, не ограничиваются отмеченными нами индукцией аминоароматическими кислотами и влиянием конечного продукта («прекращением» метаногенеза), но и включают такие механизмы как ауторегуляция, диссоциация (показана нами для С. freundii WA1 и псевдомонад) и воздействие специфическими и неспецифическими продуктами жизнедеятельности членов сообщества (кислоты, аммиак, антибиотические и низиноподобные вещества, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2001, 2005, 2009).

Неполная деградация AAB в условиях искусственно созданных микробных ассоциаций свидетельствует о неполноте их состава и несоблюдении пропорций содержания партнеров, вероятно, сказывается также отсутствие полноценной агрегации сообщества. Тем не менее, сведения, полученные при конструировании искусственных сообществ, могут быть использованы для корректировки состава микробиоты анаэробных реакторов с целью увеличения

395 эффективности и оптимизации процесса деградации ААВ. Микробные ассоциации из чистых культур микроорганизмов с известными свойствами могут помочь проследить и имитировать вероятные модификации и ответвления основного процесса при изменении условий (например, повышении содержания нитратов и нитритов в сточных водах). Наши исследования показали, что «сборка» искусственных сообществ возможна как из микроорганизмов с аналогичными функциями, но из других источников, так и из выделенных в чистые культуры членов разных консорциумов, выполняющих одинаковый процесс биоразложения ААВ.

Для моделирования реальной ситуации поступления загрязнителя в очистные сооружения были изучены влияние смены субстрата (кросс-акклиматизации) и температурного режима культивирования, а также внесения бинарной смеси ААК на эффективность «работы» анаэробных консорциумов. Выделенные нами активные и стабильные метаногенные сообщества показали способность без адаптационного периода переходить на деструкцию другой ААК, использовать субстраты из их бинарных смесей и выдерживать кратковременные перепады температуры культивирования в диапазоне 20−55°С, т. е они проявляли значительную устойчивость к изменению условий культивирования без потери деградирующей активности.

Наши исследования подтвердили, что ААВ проявляют селективный эффект по отношению к микробным сообществам. Наиболее тесный контакт человека с веществами этого ряда происходит через его нормальную микробиоту при потреблении с едой, питьем, косметикой и лекарствами пищевых азокрасителей, которые давно и активно используются в промышленности и в быту. Анализ собственных данных и описанных в литературе научных исследований показывает необходимость проведения тщательного мониторинга судьбы этих соединений не только в окружающей среде, но и в организме человека и животных. Выяснение самого процесса разрушения азокрасителей в пищеварительной системе млекопитающих необходимо для

396 понимания механизмов пагубного воздействия этих соединений на организм человека. Первым шагом является лабораторное моделирование, которое мы осуществили в своей работе. Показано, что кишечные сообщества млекопитающих разрушают азокрасители по той же схеме, что и анаэробные консорциумы из илов разного происхождения. Детекция ароматических и линейных интермедиатов в кишечных сообществах легко осуществима и позволяет судить о возможных превращениях азокрасителя внутри ЖКТ. Даже в условиях наших опытов, которые не вполне соответствовали реальной ситуации, было установлено, что не только запрещенные к использованию (Chung et al., 1978; Cerniglia et al., 1982; Xu et al., 2007), но и разрешенные пищевые азокрасители подвергаются неполному разложению за времена нахождения в организме, а значит могут вызывать негативные изменения в структуре и функционировании нормальной микробиоты человека и животных. Поскольку отказ от их использования в современной жизни не представляется реальным, то следует прежде всего ограничить контакт с пищевыми азокрасителями чувствительных групп населения (особенно детей) и проводить очистку сточных вод от этих соединений вследствие риска для здоровья.

Таким образом, наши исследования показали, что не только микробные сообщества могут преобразовывать азокрасители и ААК вплоть до полного превращения в биогаз, но и ААВ, в свою очередь, воздействуют на микробные сообщества, изменяют их структуру и функционирование. Еще раз подтвержден огромный потенциал анаэробных микробных сообществ, который должен быть использован в области очистки окружающей среды от токсичных веществ.

Моделирование в лаборатории поведения резидентных микроорганизмов в ответ на «вброс» загрязняющего вещества, а также мониторинг активности внесенных извне, в том числе и искусственно созданных, микробных сообществ поможет прогнозировать их поведение в природных экосистемах

397 как по отношению к ксенобиотику, так и по отношению к естественной микробиоте. Данные по взаимодействию партнеров внутри сообщества помогут осмысленно и более грамотно управлять процессами биодеструкции в нем как при промышленной переработке отходов, так и при естественном самоочищении природных экосистем. Практическое воплощение полученных знаний может выразиться в стимуляции активности уже имеющихся микробных ассоциаций, либо в грамотной интродукции структурно оформленных анаэробных микробных сообществ, заведомо обладающих необходимой активностью в отношении определённой группы ксенобиотиков, в загрязнённые места. При этом микробные консорциумы могут быть как получены из естественных мест обитания и адаптированы к соответствующим веществам, так и «сконструированы» из микроорганизмов, имеющих аналогичные функции.