Клеточные взрывы у растений в условиях дефицита кальция

Несмотря на то, что кальций является одним из основных элементов почвенного раствора, в последние десятилетия возросло число сообщений о физиологических нарушениях растений, вызванных недостаточным поступлением кальция в отдельные органы и ткани. Для возникновения «болезней Са-дефицита» есть внешние и внутренние причины. К первым относится недостаточное внесение кальциевых удобрений, которое происходит вынужденно в напей стране, в частности, в Ленинградской области, в последнее десятилетие. Та же тенденция отмечается западными исследователями, подчеркивающими, что рост урожайности при интенсивном земледелии увеличивает потребность растений в почвенном кальции (Simon, 1978; Kirkbey, Pi1beam, 1984). Относительный дефицит кальция возникает также при выращивании растений на засоленных и кислых почвах (Орлов, 1985, С. 133- Cramer et ah, 1985). Внутренние причины «болезней Са-дефицита» состоят в особенностях транспорта и распределения кальция внутри растения, которые приводят к возникновению локального Са-дефицита в запасающих органах и развивающихся меристемах.

Механизмы повреждения растительных клеток в условиях Са-дефицита остаются неясными. Наиболее распространенной остается гипотеза о развитии неспецифической проницаемости плазмалеммы при замещении на ее поверхности ионов СаЕ+ на ионы Na+ или К4' (Kauss., 1987; Cramer et al., 1985; Demarty et al., 1984; Kirkbey, Pilbeam, 1984). Однако эти представления, развитые ранее для животных клеток, не учитывают специфических особенностей растительных клеток, которые окружены Са-еодержащей клеточной стенкой, во многом определяющей потребность растении в почвенном кальции. Впервые на возможность альтернативных путей повреждения растительной клетки — либо с опережающим повреждением плазмалеммы путем плавной потери тургора, либо с опережающим повреждением стенки путем клеточного взрыва (cell burst) — указал Simon (1978). Однако его взгляды не имели достаточного экспериментального подтверждения и не получили дальнейшего развития. Немногочисленные исследования, проведенные к настоящему времени на клеточном уровне, в условиях, моделирующих условия Caдефицита, выполнены на клеточных суспензиях. При этом выявлена десорбция кальция с плазмалеммы" как возможная первична?! реакция и утечка калия из клеток как поздний неспецифический признак гибели (Cramer et al., 1985; Enoch, Glinka, 1983), Результаты интерпретированы авторами в рамках гипотезы о развитии неспецифической проницаемости плазмалеммы, хотя это не позволяло объяснить наблюдавшийся эффект защита осмотиками. Исследования, выполненные на отдельных клетках, отсутствовали. В этой ситуации представлялось актуальным проследить за динамикой физиологического состояния индивидуальной растительной клетки в процессе развивающегося Ca-дефицита, уделяя особое внимание свойствам ее плазматической мембраны и клеточной стенки.

Основными объектами исследования были клетки харовой водоросли Nitella syncarpa. Гигантское междоузлие Nitella традиционно используется в качестве модели фотосинтезирующей клетки высших растений и достаточно хорошо изучено, чтобы по изменению электрических параметров мембран и скорости движения цитоплазмы судить о нарушениях ионного гомеостаза клетки и обсуждать их причины и следствия. Кати-онообменные свойства, клеточных стенок харовых водорослей близки к свойствам стенок двудольных растений, как по величине емкости кати&tradeонного обмена стенки, так и по величине констант диссоциации кальция и протона, из фазы стенки. Корневые волоски высшего водного растения Trianea bogatensis выбраны в качестве вспомогательного объекта для сравнения путей повреждения клеток водоросли и высшего растения в условиях Ca-дефицита.

Целью данной работы было исследовать механизмы повреждения клеток харовой водоросли М: Шз11а з. и корневых волосков высшего водного растения Тгхапеа Ьода1епз1з в условиях развивающегося Са~дефицита. Главы представленной диссертации отражают этапы исследования, посвященные решению ряда последовательных задач.

Задачей первого этапа работы было подобрать условия проведения экспериментов (состав растворов), наблюдая за клеточными повреждениями в световой микроскоп. При этом было впервые показано, что молодые клетки Nit.el.Ia з. и корневые волоски Тг1апеа Ь. «взрываются» через несколько минут экспозиции в нейтральных растворах комплексо-образователя (ЗДТА.) или в аквариумной воде после 10-минутной экспозиции в децимолярных растворах солей Ма01 или КС1. Клетки, прекратившие рост, в тех же условиях дольше сохраняют жизнеспособность и погибают без признаков клеточных взрывов.

Задачей второго этапа работы было охарактеризовать динамику физиологического состояния клеток ЫИеПа б. в процессе развивающегося Са-дефицита, используя наблюдения за движением цитоплазмы и непрерывную регистрацию электрических параметров плазмалеммы и тоноплас-та. При этом впервые с помощью микроэлектродной техники зарегистрированы изменения электрического потенциала и сопротивления плазма-леммы и тонопласта растительной клетки в условиях развивающегося Са-дефицита. Показано, что клеточный взрыв сопровождается мобилизацией эндогенного кальция, которая может иметь двоякий смысл для дальнейшей судьбы клетки: в качестве кратковременного сигнала рост концентрации свободного цитозольного Са2+ способствует заживлению раны, но устойчивое нарушение кальциевого гомеостаза цитозоля (при повторяющихся взрывах) может быть одной из причин клеточной гибели.

Задачей третьего этапа работы было исследовать динамику тургор-ного давления при клеточных взрывах ИгЬеПа з. и проанализировать причины возникновения взрывов, используя существующие теоретические представления о механической устойчивости мембран. При этом впервые зарегистрирован пульсирующий режим клеточного лизиса и показано, что клеточные взрывы растений имеют ту же физическую природу, что и осмотический лизис животных клеток: в обоих случаях происходит нарушение механической устойчивости плазмалеммы. Если на животных клетках при прочих равных условиях устойчивость плазмалеммы зависит от радиуса клетки, то на клетках растений механическая устойчивость плазмалеммы зависит от радиуса пор клеточной стенки.

Задачей четвертого этапа, работы было дать некоторые количественные оценки, характеризующие условия возникновения клеточных взрывов МН-е11а б. Проведенные опыты и расчеты показали, что к моменту взрыва содержание кальция в клеточной стенке 1Ше11а б. становится на порядок меньше емкости катионного обмена стенки, которая в норме практически полностью заполнена кальцием. Показано, что время ожидания первого клеточного взрыва М11е11а б., которое можно варьировать в опыте в пределах от секунд до суток, зависит от условий диффузии кальция в наружном неперемешиваемом слое раствора.

В заключении обсуждается возможность использования результатов, полученных в модельных условиях, для анализа событий, развивающихся в клетках высших растений в условиях Са-дефицита.

— 182 -ВЫВОДЫ.

1. Впервые в опытах на растительных клетках (междоузлия Ы^еПа зупсагра и корневые волоски Тг1апеа Ьода1епз1з) систематически наблюдали и исследовали новое явление: возникновение серии клеточных взрывов, приводящей к клеточной гибели. Показано, что клетка восстанавливает жизнеспособность после единичных взрывов и сохраняет ее, если причина взрывов устранена. Взрывы вызываются дефицитом Са2+ в клеточной стенке, появляющимся в результате Са2+/Ма+ и Са2+/К+ обмена при экспозиции клеток в растворах Ыа-соли комплексо-образователя (водные растворы ЫагЭДТА и Са-ЭДТА буферы) или деци-молярных растворах НаС1 и КС1. В этих условиях взрывы возникают, когда содержание кальция в клеточной стенке оказывается на порядок ниже содержания одновалентных катионов (Ыа, К). Клеточные взрывы наблюдаются только у молодых растущих клеток и корневых волосков. На зрелых клетках клеточные взрывы не наблюдаются. Показано, что дефицит Са2+ в клеточной стенке, появляющийся в результате Са2+/Н+ обмена при экспозиции в миллимолярных растворах кислоты, не приводит к клеточным взрывам.

2. С гюмошью датчика малых перемещений исследована динамика тур-горного давления и объема клеток И^еПа в процессе возникновения Са-дефицита и в течение всей серии клеточных взрывов вплоть до плазмолиза клетки. Показано, что при клеточном взрыве фаза сброса тургорного давления продолжается доли секунды и завершается формированием пробки, после чего тургор восстанавливается за несколько секунд. Окончание серии клеточных взрывов сопровождается необратимой остановкой движения цитоплазмы, вслед за которой после лаг-периода длительностью до получаса развивается плазмолиз (клеточная гибель). Показано, что зрелые клетки Ш, е11а дольше сохраняют жизнеспособность в условиях Са-дефицита, а их повреждение проявляется как монотонное уменьшение тургора, связанное с развитием неспецифической проницаемости плазмалеммы, которое зарегистрировано в электрофизиологических опытах.

3. Проведены электрофизиологические исследования динамики разности потенциалов и электрического сопротивления плазмалеммы и то-нопласта клеток МИеПа в процессе возникновения Са-дефицита и клеточных взрывов вплоть до клеточной гибели либо восстановления мембранных. параметров и сохранения жизнеспособности при условии своевременного переноса клетки в контрольный раствор. Показано, что возникновение Са-дефицита в клеточной стенке возбудимых клеток Ш1е11а сопровождается спонтанной генерацией серии потенциалов действия, в течение которой движение цитоплазмы отсутствует. Окончание фазы электрической активности сопровождается переходом плазмалеммы в вы-сокопроводящее состояние, близкое по сопротивлению к состоянию возбуждения (менее 1 ком *см2) и возобновлением циклоза. Из этого состояния молодые клетки МЬеПа взрываются. Взрыв сопровождается сбросом сопротивления обеих мембран (ниже 0,1 ком-см2), деполяризацией плазмалеммы, гиперполяляризацией тонопласта до уровня — 60 мВ и остановкой движения цитоплазмы. Два последних факта удовлетворительно объясняются выбросом кальция в цитоплазму из внутренних депо до превышения уровня цитозольного кальция [Сац2+3 > 10 мкМ, при котором на клетках харовых водорослей наблюдается активация Са2+~зависимых С1~- каналов тонопласта и остановка движения цитоплазмы. Временное повышение концентрации Сац2+ играет защитную роль, способствуя коагуляции цитоплазмы и формированию пробки, закрывающей отверстие в двухслойной системе плазмалемма-клеточная стенка. Неспособность клетки восстановить после серии клеточных взрывов низкую концентрацию Сац2+ (- 0,1 мкМ). свойственную интактным клеткам, может быть одной из причин клеточной гибели.

4. .Проведен анализ механизма клеточных взрывов с позиций теории осмотического лизиса везикул (Козлов, Маркин, 1984), Клеточный взрыв возникает при постоянном тургорном давлении в результате увеличения радиуса водной поры стенки до некоторого критического значения, при котором нарушается механическая устойчивость мембраны. Вывод подтверждается опытами на тенях клеток Nitella, заполненных раствором полиэтилен!'ликоля мол. м. 20 000, с использованием датчика малых перемещений. Показано, что Ca2+/Na+ обмен в стенке вызывает постепенное снижение тургора тени вплоть до нуля, что указывает на увеличение размера водных пор стенки, приводящее к выходу полиэти-ленгликоля из тени. Показано, что экспозиция теней в сантимолярном растворе кислоты, когда Са2+клеточной стенки практически полностью обменивается на Н+, не приводит к увеличению размера водных пор стенки.

5. Обосновано представление о клеточном взрыве как одном из возможных путей повреждения и гибели тургесцентых клеток растений в природе, связанном с нарушением структуры клеточной стенки, несущей механическую нагрузку. Вероятность клеточных взрывов в условиях дефицита Са увеличивается вследствие физического разрыхления структуры стенки, которое может усугубляться ферментативным разрыхлением вследствие облегченного проникновения патогенов в этих условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

За последние десятилетия сформировались представления об уникальной роли иона Са2+ как вторичного посредника в системе внутриклеточной сигнализации у животных (Rasmussen, 1982) и растений (Marine, 1982). Показано, что импульсный рост концентрации свободного цитозольного кальция в диапазоне [Сац2+] = 0Д-10 мкМ является сигналом, участвующим в регуляции физиологического состояния клеток, их роста и дифференцировки, а также программируемой клеточной гибели (апотоза), сопровождающей нормальный рост и развитие животного и растительного организма (Pennell, Lamb, 1997). Установлено также, что в условиях «непреодолимого стресса», вызванного действием внешних повреждающих факторов, происходит необратимое нарушение Са2±гомеостава цитозоля животных клеток. При этом показано, что долгосрочное превышение уровня ССац2+] = 10 мкм является достаточным условием для развития характерного некротического типа гибели животных клеток (Campbell, Luzio, 1981; Farber, 1982). В этом случае цитозольный кальций выступает не как элемент системы внутриклеточной сигнализации, а как повреждающий агент, «убийца клетки», вызывающий нарушения транспорта и метаболизма, активацию фосфолипаз и нарушения компартментализации. В случае гибели растительных клеток также различают некроз и апотоз, как «насильственную» и «физиологическую» гибель (Penneil, Lamb, 1997). Однако число экспериментов, направленных на исследование механизма гибели растительных клеток, сравнительно мало. Так, на растительных клетках до сих пор не описана конкретная ситуация, в которой нарушение гомеостаза цитозольного кальция вело бы к клеточной гибели. Однако, элементы, чувствительные к повреждающему действию высоких концентраций цитозольного кальция, присутствуют как в животных, так и в растительных клетках. Это дает основания некоторым авторам справедливо полагать, что в ситуациях, когда следует ожидать нарушения Са2±гомеостаза цитозо-ля, в частности, при холодовом стрессе растений, рост концентрации Сац2+ может быть непосредственной причиной клеточной гибели (Мг-погэку, 1985). Таким образом, несмотря на недостаточность конкретных экспериментальных фактов, полученных на растительных клетках, сложилось мнение о важнейшей роли цитозольного кальция в вопросах «жизни и смерти» на клеточном уровне.

Быстрые обратимые колебания [Сац2+] возможны благодаря тому, что и животная, и растительная клетка обладают набором «кальциевых депо», окруженных мембранами, снабженными управляемыми системами Са2±транспорта. Одним из таких депо является и клеточная стенка растений, накапливающая кальций в соответствии с катионообменными свойствами карбоксильных групп уроновых кислот, содержащихся в стенках всех растительных клеток. Клеточная стенка является своеобразной буферной системой, поддерживающей достаточно высокие концентрации катионов вблизи поверхности плазмалеммы. Это существенно, как для стабилизации нативной структуры плазмалеммы, так и для эффективного транспорта катионов, в частности, К+. В условиях кальциевого дефицита следует ожидать истощения кальциевых депо растительной клетки при сохранении нативной низкой концентрации кальция в цитозоле [Сац2+] ОД мкМ. Логично предположить, что истощение Са—депо является непосредственной причиной клеточной гибели в условиях Са дефицита. По-видимому, истощение клеточной стенки по кальцию разовьется раньше, чем у внутренних депо — вакуоли, энд (c)плазматического ретикулума и др. Действительно, содержание Са2+ в клеточной стенке определяется только составом среды и ионообменными свойствами стенки. В эндогенные депо кальций закачивается системами активного транспорта, что предполагает возможность регуляции. Кроме того, содержание Са во внутренних депо мМ Са2+), по-видимому, избыточно для нужд внутриклеточной сигнализации, так что снижение его более, чем на порядок, некритично для функционирования клетки. Это предположение подтверждается тем, что потребность растений в кальции определяется, главным образом, свойствами клеточных стенок. Так, для водорослей, лишенных клеточной стенки, кальций попадает лишь в число необходимых микроэлементов (O'Kelley, 1968).

Истощение клеточной стенки по содержанию кальция может существенно повлиять как на свойства самой клеточной стенки, так и на свойства плазмалеммы. Именно повреждение плазмалеммы, вызванное десорбцией кальция с ее наружной поверхности, считается первопричиной гибели животных клеток в условиях Са-дефицита. Этими представлениями, как правило, ограничиваются и физиологи растений.

Роль кальция в регуляции метаболизма клеточной стенки и ее механических свойств так или иначе обсуждается в большинстве исследований, посвященных динамике состояния стенки в жизненном цикле растительной клетки. Однако возможность повреждений, в том числе, летальных, вызванных дефицитом Са в стенке, как правило, упускается из виду. Впервые на возможность альтернативных типов повреждения растительных клеток — либо по пути повреждения плазмалеммы, либо по пути повреждения стенки — указал Simon (1978). Однако его взгляды не имели достаточного экспериментального подтверждения и не получили дальнейшего развития. Мы надеемся, что данная работа в некоторой степени восполнит этот пробел и привлечет внимание исследователей к клеточной стенке как важной мишени повреждающего воздействия Са-дефицита на клетки растений.

Выполненное исследование доказало реальность клеточных взрывов растительных клеток в условиях Са-дефицита, вызванного Ca2+/Na+ или Са2+/К+ обменом на клеточной поверхности. Факт возникновения клеточных взрывов свидетельствует, что для молодых клеток Nitella в условиях Ca2+/Na+(K+) обмена развитие критических повреждений клеточной стенки опережает развитие критических повреждений плазмалеммы. Выявлены критические по содержанию кальция условия среды, в которых становится возможным развитие клеточных взрывов Nitella. На основе модели равновесного распределения ионов в системе стенка-среда (Sent enac, Gr i gnon, 1981) сделаны количественные оценки уровня свободного и связанного кальция в стенке Nitella к моменту первого взрыва. Они показали, что для развития взрыва необходимо снижение общего содержания Са в стенке до уровня — 10% емкости ка-тионного обмена. При этом концентрация свободного кальция в стенке составляет [Са2+]кс «мМ, что на порядок выше критической концентрации наружного кальция (ССа2+ ]0 — ОД мМ, при которой можно ожидать клеточной гибели по механизму развития неспецифической проницаемости плазмалеммы (Baur et al. Д975- Bihler J., Saw Chandrabaer, 1977; Cheung et al., 1982).

Мы показали, что прекратившие рост клетки Nitella и корневых волосков Trianea дольше сохраняют жизнеспособность в условиях Са-дефицит а, вызванного Ca2+/Na+ обменом и погибают с плавной потерей тургора вследствие развития неспецифической проницаемости плазмалеммы. В наших опытах впервые на растительных клетках непосредственно показано снижение электрического сопротивления плазмалеммы в условиях Ca2+/Na+ обмена, на ее поверхности. Оно развивается постепенно. Перед клеточным взрывом сопротивление плазмалеммы снижается до уровня, типичного для состояния возбуждения. При этом ионный го-меостаз цитозоля поддерживается, о чем свидетельствует сохранение неизменных электрических параметров тонопласта и скорости движения цитоплазмы. Это подтверждается и опытами с датчиками малых перемещений, которые показали, что тургор к моменту первого взрыва не снижается. Следовательно, увеличение в определенных пределах, пассивных ионных потоков через плазмалемму компенсируется работой систем активного транспорта. Благодаря этому обстоятельству, зрелые клетки относительно долго сохраняют жизнеспособность. Однако со временем неспецифическая проницаемость плазмалеммы нарастает, движение цитоплазмы останавливается и клетка постепенно теряет тур-гор, погибая без признаков клеточных взрывов.

Мы показали, что феноменология клеточного взрыва получает объяснение в рамках теории мембранного лизиса (Козлов, Маркин, 1984). Таким образом, мы имеем основания утверждать, что клеточный взрыв растений и осмотический лизис животных клеток и везикул имеют общую физическую природу. С точки зрения теории мембранного лизиса, разработанной для липидных везикул, основным фактором, определяющим устойчивость липидной мембраны к перепаду гидростатического давления, оказывается ее радиус кривизны. Нарушение устойчивости проявляется в образовании в мембране водной поры диаметром > 50 А, через которую происходит гидродинамический выброс порции внутреннего содержимого в наружную среду. Для набухших животных клеток и везикул радиус кривизны мембраны совпадает с радиусом клетки (везикулы). Теория мембранного лизиса не учитывает специфику липидного состава и возможности включения в мембрану белков. То обстоятельство, что предсказания теории подтверждаются в опытах на животных клетках, показывает, что специфика мембран в данном случае несущественна, и что, по-видимому, пора образуется в зоне чистого липида. В таком случае нет препятствий для распространения теории и на растительные клетки. Мы рассмотрели участок плазмалеммы растительной клетки, растянутый и изогнутый на участке водной поры клеточной стенки, подобно мембране липидной везикулы. Анализ его механического состояния показан, что устойчивость плазмалеммы растений при данном тур-горном давлении определится локальным радиусом кривизны плазмалеммы на участке водной поры клеточной стенки. Этот радиус ограничен снизу радиусом поры клеточной стенки, так что при увеличении последнего по той или иной причине следует ожидать нарушения устойчивости плазмалеммы, проявляющегося как клеточный взрыв. Это утверждение, не требующее никаких допущений о специфике мембраны или стенки, по-видимому, справедливо для любой растительной клетки и любой ситуации, вызывающей увеличение размера пор стенки. Таким образом, клеточных взрывов следует ожидать при механических нагрузках, сопровождающихся растяжением клеточной стенки, и при патогенной атаке, когда структура стенки разрыхляется ферментативно. На это указывают данные электронной микроскопии о разрывах в клеточных стенках клеток высших растений, погибших от инфекции (Ва1егпап, ВазЬат, 1986) Возможно также, что этот механизм гибели может использоваться как один из механизмов «программируемой, физиологической» гибели". Действительно, известно, что дегенерация стенок сопутствует отмиранию клеток чехлика корня, опадению листьев и плодов. Разрывы плазмалеммы и стенки наблюдались в секреторных клетках пыльцы, погибших после выполнения своей физиологической функции (СаЬап, 1981). Тот же автор отмечает аутолизис первичной стенки и разрывы плазмалеммы и тонопласта на последних стадиях дифференцировки ксилемы. Таким образом, возникновение клеточных взрывов растений в природе не ограничено условиями Са-дефицита. С другой стороны, наши данные показывают, что не при каждом варианте Са-дефицита следует ожидать клеточных взрывов молодых растущих клеток. Так, мы не наблюдали взрывов клеток ЫИеПа и корневых волосков Тг1апеа, если Са~ дефицит в стенках возникал в результате Са2+/Н+ обмена, происходившего в мнллимолярных растворах соляной кислоты. Клетки погибали с постепенной остановкой движения цитоплазмы и потерей тургора в течение получаса. Можно предположить, что дефицит кальция в этих усдовиях не является первопричиной клеточной гибели. Представляется вполне вероятным предположение Feng Yau et al. (1992) о том, что клеточная гибель в этих условиях связана с нарушением рН-гомеостаза цитозоля.

В опытах, выполненных на «клеточных тенях» Nitella, мы показали что размер пор клеточной стенки действительно увеличивается при десорбции из нее Са2+ в обмен на Na+, но не на Н+. Увеличение размера пор может произойти по двум причинам. Во-первых, очевидно, что обмен двухзарядного иона Са2+, который, к тому же, находится в стенке частично в связанной форме, на однозарядный Na+ или К+ увеличивает осмотическое давление в фазе стенки и создает условия для входа воды и набухания стенки. Логично предположить, что набуханию сопутствует увеличение размера водных пор. Второй причиной увеличения размера пор клеточной стенки может быть увеличение растяжимости стенки. Литературные данные подтверждают, что десорбция кальция из структуры стенок растений увеличивает их растяжимость (Taiz, 1984). В наших опытах увеличение растяжимости стенок Nitella проявлялось как сдвиг порога продольной «ползучести» материала стенки в растворе ЗДТА (рис.1б). В то же время объемный модуль упругости клеточной стенки Nitella не изменялся вплоть до первого клеточного взрыва. Это свидетельствует о том, что причиной взрыва оказывается локальное событие, развивающееся в некотором «слабом месте» структуры стенки, отличающейся неоднородностью размера пор. Так, у корневых волосков Trianea клеточные взрывы происходят исключительно в кончиках зонах роста, где клеточная стенка отличается исходно более рыхлой структурой. Известно, что растяжимость клеточных стенок снижается при старении. Таким образом, отсутствие взрывов в зрелых клетках Nitella и Trianea можно объяснить упрочением структуры стенки, которая становится менее растяжимой и способной к набуханию 17o в условиях Ca2+/Na+(K+) обмена.

Анализируя литературные данные, мы пришли к заключению, что у растений в условиях Ca-дефицита десорбция кальция из стенки опережает десорбцию кальция с наружной поверхности плазмалеммы. Из немногочисленных количественных оценок, имеющихся в литературе, складывается впечатление о, по крайней мере, десятикратном различии соответствующих констант связывания кальция. Нам представляется, что такие различия должны быть общим явлением для растений разных видов, так как они целесообразны. Действительно, клеточная стенка может играть роль Ca-депо и Ca-буфера для плазмалеммы только если она связывает кальций менее прочно, чем сама мембрана. Если это так, то мы имеем предпосылку для опережающего развития повреждений стенки по сравнению с нлазмалеммой в условиях Ca дефицита, если только размер водных пор стенки увеличивается по мере десорбции из ее структуры кальция. Таким образом, тип повреждения клеток растений в условиях Ca-дефицита должен зависеть от значимости Ca-мостиков для поддержания структуры стенки. Для двудольных растений, так же как и харовых водорослей, полагают, что «Ca-мостики» между полимерами являются «связями, несущими нагрузку» в клеточной стенке (Virk, Cleland, 1990). Следовательно, в первую очередь, для двудольных растений есть все основания ожидать клеточных взрывов в условиях Caдефицита. Возникновением клеточных взрывов можно объяснить и появление разрывов в стенках высших растений (Simon, 1978), и факт защиты осмотиками, обнаруженный в опытах на суспензии клеток моркови в условиях Са-дефицита.

Можно предположить, что различия по типу гибели между старыми и молодыми клетками, обнаруженные как для харовой водоросли Nitella, так и для высшего водного растения Trianea, характеризуют общее явление, проявляющееся и на клетках высших растений в условиях Са-дефицита. Этого следует ожидать, поскольку упрочение клеточных стенок на стадии остановки роста представляет собой общее явление. С этой точки зрения удается объяснить преимущественное повреждение развивающихся меристем корня в условиях Са-дефицита. Для развивающихся меристем наземных органов возможна и другая причина, связанная с особенностями транспорта и распределения кальция в растении.

Таким образом, причины клеточных взрывов могут быть чисто физическими, связанными с набуханием стенки и разрывом Са-мостиков между полимерами, как это, по-видимому, происходит у молодых клеток Nitella в условиях Ca2+/Na+(K+) обмена. Но реакция клетки на взрыв — это физиологический, защитный ответ. Каждый взрыв сопровождается формированием пробки и восстановлением движения цитоплазмы, кроме последнего взрыва, когда циклов более не возобновляется. Клетка способна сохранить жизнеспособность после нескольких клеточных взрывов при условии устранения причины взрыва. Нами показано, что клеточный взрыв сопровождается ростом концентрации [Сац2+]. Это событие существенно для залечивания образовавшейся раны, которое может происходить так же, как после механического ранения. Последнее хорошо изучено в опытах, когда раны наносились металлической иглой (Russo, Bushnel1,1989; Foissner, 1987). Авторы этих работ также отмечали рост концентрации [Сац2+] и обсуждали возможную защитную роль его в коагуляции цитоплазмы и образовании пробки. Однако они предполагали, что кальций входит в клетку снаружи через поврежденный участок, что практически невозможно в момент взрыва и следовательно, не может быть причиной коагуляции цитоплазмы и образования пробки. Наши опыты показывают, что возможен выброс кальция из внутренних депо, как клеточная защитная реакция, сигналом для которой служит гидродинамический стресс, который испытывают Са-депо в момент взрыва. Таким образом, мы полагаем, что выброс Са2+ из депо не является особенностью возбудимых клеток, а является общей защитной реакцией, которая переводит клетку в состояние, которое в известном смысле можно назвать стрессовым. При этом останавливается движение цитоплазмы и цитоплазма переходит в состояние геля. Уменьшаются энергозатраты клетки и снижается механическая нагрузка на двухслойную систему плазманемма-стенка.

Клетка, претерпевшая серию клеточных взрывов, погибает, несмотря на формирование пробки после последнего взрыва. Наши эксперименты указывают на то, что причиной клеточной гибели может быть необратимое нарушение гомеостаза Сац2+. Этому способствует ряд причин. Во-первых, при каждом взрыве клетка выбрасывает наружу часть своих органелл и функциональных единиц, в частности, ферментов. Во-вторых, оставшиеся органеллы могут повреждаться в результате гидродинамического стресса, обусловленного распространяющейся волной гидростатического давления. Это, в первую очередь, должно привести к нарушению энергопродукции и осложнить восстановление гомеостаза ци-тозольного кальция после каждого следующего клеточного взрыва. Долгосрочное повышение уровня цитозольного кальция [Сац2+] > 1.0 мкМ может привести к ингибированию активного транспорта, активации фос-фолипаз, повреждению мембран, нарушению компартментализации и энергопродукции и в конечном итоге, к клеточной гибели.

Таким образом, проведенные опыты в сочетании с литературными данными о разрывах в клеточных стенках высших растений в условиях Са-дефицита, позволяют утверждать, что клеточный взрыв является одним из возможных путей повреждения растительных клеток, если Са-дефицит возникает вследствие обмена Са2+ на Ыа+ или К+. В естественных условиях клеточный взрыв у растений может быть результатом совокупности причин, включая микробную и грибную инфекцию, механические нагрузки и ранения. В условиях относительного Са-дефицита, возникащего при интенсивном земледелии, а также на засоленных почвах, реализации клеточных взрывов способствует физическое разрыхление структуры стенки, возникающее вследствие Ca2+/Na+(K+) обмена.

Известно, что относительный дефицит кальция возникает и на кислых почвах. Повреждение клеток растений в условиях кислых почв, как правило, связывают с трудностями поддержания рН. гомеостаза цитозоля.

Feng Yau et al., 1992). Наши опыты показали, что Са2+/И+ обмен на клеточной поверхности не вызывает интегрального разрыхления структуры стенки и не приводит к клеточным взрывам. Однако, следует иметь в виду,&bdquoчто в условиях кислых почв снижается соотношение Са2+/Ма+ и Са2+/К+ в почвенном растворе (Май, Тинкер, 1980, С.51). Ото может привести к заполнению ЕКО стенок развивающихся меристем «разрыхляющими» катионами ~ Na+ и К+. На данном этапе исследований для кислых почв трудно дать сравнительную оценку возможностям клеточного повреждения, но тому или иному пути. Вопрос заслуживает дальнейшего изучения в конкретных ситуациях. Поскольку в кислых почвах проявляется токсичность А1, представляет интерес исследование изменений структуры стенки при варьировании в среде Са, В и А1. Новейшие исследования показали, что образование боратных мостиков в стенках высших растений может способствовать связыванию в них Са и снижать токсический эффект Al (Blevins, Lukaiszewski, 1998; Flndek-lee, Goldbach, 1996; Kobayashi et al., 1996; 0 Weill et al., 1996).

Выявление клеточной стенки в качестве «мишени» повреждающего действия Са-дефицита существенно для выбора способа защиты растения и прогнозирования устойчивости растений, отличающихся свойствами клеточных стенок и их способностью к адаптации. Представления о взрывах растительных клеток могут быть использованы при разработке экспресс-методов оценки устойчивости, базирующихся на сравнительном анализе свойств их клеточных стенок.