Оптические свойства гранулярных клеток крови: нейтрофилы

Оптические свойства гранулярных клеток крови: нейтрофилы

Содержание нейтрофил клетка кровь патология

• Введение
• Глава 1. Обзор литературы
• 1.1 Характеристика нейтрофилов как клеток крови
• 1.2 Патологические изменения нейтрофилов
• 1.3 Методы изучения нейтрофилов
• Глава 2. Экспериментальная часть
• 2.1 Пробоподготовка клеток для измерения на ПСПЦ
• 2.2 Экспериментальная установка
• 2.3 Чувствительность и разрешающая способность прибора
• Глава 3. Результаты и обсуждение
• Результаты
• Благодарности
• Список литературы

В настоящее время аллергические заболевания относятся к числу широко распространенных заболеваний и имеют тенденцию к дальнейшему росту. При этом в структуре аллергической заболеваемости у детей ведущая роль принадлежит аллергическим заболеваниям кожи. В реализации иммунных реакций в коже важная роль принадлежит нейтрофилам. Нейтрофил занимает одну из наиболее активных позиций в системе гуморально-клеточной кооперации крови и соединительной ткани. Это делает его универсальной мишенью и, соответственно, индикатором различных нарушений гомеостаза. В свою очередь, стимулированный нейтрофил становится мощным эффектором и одним из пусковых механизмов каскадных реакций, обеспечивающих развитие воспаления.

Нейтрофилы осуществляют первую линию защиты от аллергенов различной природы благодаря их основной функции — фагоцитарной. Кроме того, нейтрофилы обладают мощным дезактивационным действием в отношении гистамина — главного медиатора аллергической реакции немедленного типа. Наряду с этим, нейтрофилы участвуют в регуляции активности базофилов и тучных клеток, секретируя в очаг воспаления вещества, вовлекающие данные клетки (мишени аллергического процесса) в воспалительную реакцию. В то же время, нейтрофилы относятся к клеткам-эффекторам поздней фазы аллергического воспаления, и от их функциональной активности во многом зависит течение и исход аллергического воспаления. Следовательно, функциональный потенциал нейтрофилов и пути его реализации имеют большое значение в развитии аллергических заболеваний [1.

В настоящее время детально изучены морфология, метаболизм и основные функции нейтрофилов, охарактеризованы десятки различных продуктов их секреции. Повреждение различных функций нейтрофилов приводит к разнообразным заболеваниям. Эти дефекты могут быть врожденными и приобретенными в результате повреждающего действия на нейтрофилы различных факторов: бактерии, вирусы, грибы, лекарственные препараты и т. д. Клиническим проявлением большинства дефектов нейтрофилов являются инфекционные поражения кожных и слизистых покровов. В течение последнего десятилетия разработаны принципиально новые поколения препаратов, корригирующих недостаточность функций нейтрофилов.

Многие заболевания имеют гематологические проявления, например, некоторые характеристики клеток крови, в частности нейтрофилов, выходят за пределы физиологических норм. Поэтому анализ крови является главным компонентом любых диагностических исследований. В настоящее время широко распространены оптические методы изучения и характеризации клеток крови, такие как светорассеяние и флуоресценция. Для анализа крови оптические методы нашли своё главное применение в проточных цитометрах, позволяющих одновременно измерять сигналы светорассеяния и флуоресценции от одиночных клеток со скоростью до сотен тысяч клеток в минуту. Что обеспечивает быстрый, качественный и главное недорогой анализ.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Характеристика нейтрофилов как клеток крови

Нейтрофилы — самая многочисленная и быстро реагирующая при патологии популяция лейкоцитов периферической крови.

Нейтрофилы периферической крови здоровых людей представлены крупными клетками (7−9 мкм в диаметре, в капле свежей крови) с характерными сегментированными ядрами. В ядре обнаруживается большое количество гетерохроматина, который плотным ободком примыкает к ядерной мембране и прерывается только в области ядерных пор. Ядрышки встречаются редко или отсутствуют, что указывает на подавление или прекращение синтеза белка. Как правило, нейтрофил имеет округлую или несколько вытянутую форму, а цитоплазматическая мембрана образует небольшое количество выростов и микроворсинок. Умеренно плотный цитоплазматический матрикс содержит свободные рибосомы и полисомы. Гранулярный эндоплазматический ретикулум представлен короткими единичными канальцами, на поверхности которых имеется незначительное количество рибосом. Митохондрии округлые или овальные, преимущественно с непрозрачным матриксом, присутствуют в нейтрофилах в небольшом количестве. Комплекс Гольджи слабо развит и образует небольшую сферу в центре клетки, часто располагается между сегментами ядра. В области комплекса Гольджи обнаруживается центриоль с отходящими от неё микротрубочками.

Нейтрофилы содержат азурофильные и специфические гранулы. Азурофильные гранулы большого размера (до 0.8 мкм), имеют высокую электронную плотность и представлены округлыми и эллипсоидными формами. В последних изредка обнаруживаются кристаллические включения. Соотношение азурофильных и специальных гранул непостоянно. Относительное число азурофильных ранул достигает 10−20% от общего количества гранул. Специфические гранулы меньшего размера (от 0.1 до 0.3 мкм) также как азурофильные гранулы, могут быть округлыми или удлиненными. Они имеют меньшую электронную плотность по сравнению с азурофильными гранулами. Незрелые клетки миелоидного ряда, продуцирующие гранулы, характеризуются ультраструктурными признаками повышенной активности. Наличие гранул с промежуточной морфологией часто затрудняет их идентификацию. Более того, некоторые исследователи описывают третичные гранулы, содержащие кислую фосфатазу, а также микросомальную фракцию со слабой активностью щелочной фосфатазы. Применение цитохимических методов позволяет с большой достоверностью определить тип гранул.

В цитоплазме нейтрофила в большом количестве выявляется гликоген в виде отдельных частиц, а также небольшое количество фагоцитарных вакуолей и пиноцитозных пузырьков.

На поверхности нейтрофилов имеется множество рецепторов, с помощью которых нейтрофил узнаёт, где находятся попавшие в организм бактерии, разрушенные собственные клетки, чужеродные белки и т. п. Хемотаксис нейтрофилов стимулируют бактериальные антигены, эндотоксины, комплексы антиген-антитело, лизосомы нейтрофилов и макрофагов. Под клеточной мембраной имеется развитый «мышечный аппарат» — система фибрилл, которые обеспечивают способность нейтрофила быстро двигаться в направлении «чужого» и быстро захватывать его. Фагоцитоз частичек и пиноцитоз чужеродных растворимых молекул — основная функция нейтрофилов. Поэтому одно из старейших определение нейтрофилов — микрофаги.

Кроме осуществления фагоцитарной функции, нейтрофилы секретируют в окружающие ткани ферменты, неферментные бактерицидные вещества, цитокины, участвуя, таким образом, во всех этапах воспалительного процесса и являясь «фабрикой медиаторов воспаления». Нейтрофилы также помогают лимфоидным клеткам уничтожать всё «чужое», участвуют в реакциях свёртывания крови и др. 5].

1.2 Патологические изменения нейтрофилов

Патология нейтрофилов может касаться их морфологических изменений, нарушения функций и количества.

Дисфункции нейтрофилов могут быть врождёнными или приобретёнными (вторичными). Последние встречаются значительно чаще. Почти все стадии фагоцитоза (приближение к объекту, захват, переваривание) страдают при заболеваниях почек, сахарном диабете, циррозе печени, тяжелых инфекциях, ожогах, лучевой болезни, приеме многих медикаментов.

Увеличение или уменьшение количества нейтрофилов в крови — наиболее частое изменение в гемограмме при различных состояниях. Изменение количества нейтрофилов в подавляющем большинстве случаев обуславливает изменение общего числа лейкоцитов крови, так как их количество составляет около 70% от всех лейкоцитов.

Количество нейтрофилов в крови определяется:

· продукцией в костном мозге;

· распределением между краевым и циркулирующим пулами;

· скоростью выхода из сосудов в ткани;

· потреблением в тканях.

У здорового человека в периферическую кровь из костного мозга выходят главным образом зрелые нейтрофилы: сегментоядерные или небольшое количество палочкоядерных (не более 6%). Появление незрелых нейтрофилов в крови (в частности, большого количества палочкоядерных) носит название «нейтрофильный сдвиг лейкоцитарной формулы влево». Глубина сдвига влево отражает тяжесть патологического процесса. Появление значительного количества нейтрофилов с гиперсегментированными ядрами называется «сдвигом нейтрофилов вправо» и расценивается как дегенеративное изменение клеток.

При тяжелых интоксикациях страдает костномозговое кроветворение. Отражением такого нарушения являются морфологические изменения нейтрофилов, среди которых различаются следующие формы.

Токсогенная зернистость нейтрофилов — грубая, обильная зернистость сине — фиолетового цвета, появляется при тяжелых инфекциях или интоксикациях (сепсис, различные гнойные процессы, распад опухолей).

Тельца Деле — маленькие округлые пятна в цитоплазме нейтрофилов, окрашенные в голубой или серовато — голубой цвет. Появляются при очень тяжелых интоксикациях.

Появление нейтрофилов с гипосегментированными ядрами — ранний морфологический признак нарушения развития клеток. При этом нейтрофилы содержат ядра в виде «пенсне», «гантелей», коротких толстых палочек, боба.

Вакуолизация цитоплазмы и ядер нейтрофилов — проявление жировой дегенерации клеток, наблюдающейся при тяжелых патологических состояниях.

Гиперсегментация ядер нейтрофилов наблюдается при нарушениях синтеза ДНК в организме (мегалобластные анемии, лечение цитостатиками). «Сдвиг нейтрофилов вправо» может быть проявлением редкой наследственной аномалии лейкоцитов. У здорового человека преобладают нейтрофилы с 3−4 ядерными сегментами.

Усиленный пикноз ядра — ядро становится темным, бесструктурным. Процесс пикнотизации распространяется либо на все ядро, либо на его отдельные участки. Пикноз ядра — морфологическое проявление апоптоза, однако, может усиливаться при некоторых патологических процессах (лейкозах, после облучения).

К дегенеративным изменениям нейтрофилов также относятся: распад ядра на фрагменты, наличие микро и макроформ нейтрофилов, асинхронность в созревании ядра и цитоплазмы, уменьшение количества гранул, лизис ядра или всей клетки.

Наличие дегенеративных изменений нейтрофилов — важный признак тяжести патологического процесса.

1.3 Методы изучения нейтрофилов

Важными биофизическими параметрами клеток являются их морфологические характеристики, под которыми понимают: объем, показатель преломления, площадь поверхности, форма, размер и плотность ядра, степень гранулированности клеток и т. д. Список измеряемых биофизических параметров клетки не ограничивается морфологией. Появление в последнее десятилетие приборов, таких, как эктацитометр, диэлектрофоретических анализаторов и многих других развивающихся инструментальных подходов, позволяет оценивать вязкость цитоплазмы отдельных клеток, жесткость, проницаемость и деформационные свойства мембраны.

В современной биологии намного больше внимания уделяется функциональным свойствам клетки, чем её морфологии. Поэтому диагностические методы бурно развиваются в направлении только дифференцировки клеток в основном по биохимическим маркерам. Тем не менее, функциональность клеток непосредственно связана с ее морфологией.

Большую часть диагностической аппаратуры в области анализа нейтрофилов и измерения их параметров составляют гематологические анализаторы и проточные цитометры [4,2.

Основные технические методы, применяемые в гематологических анализаторах и проточных цитометрах:

· кондуктометрический метод,

· светорассеяние,

· флуоресценция.

Кондуктометрический метод: Принцип кондуктометрического метода заключается в измерении импеданса клетки на постоянном токе. При этом импеданс примерно пропорционален объему клетки. Метод применяется для измерения объемов клеток крови. Так же измерение импеданса клеток на токе высокой частоты применяется для дифференцировки эозинофилов и базофилов.

Светорассеяние: Измерение светорассеяния на клетках крови в гематологических анализаторах производится в определенные телесные углы, например, измеряется полная интенсивность светорассеяния, интегрированная по интервалу углов вблизи значения угла рассеяния 5°, 10° и 90°. Так же измеряется деполяризация светорассеяния от клеток вблизи угла рассеяния 90°. Комбинирование упомянутых сигналов светорассеяния применятся для дифференцировки тромбоцитов, лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов. А в некоторых приборах светорассеяние позволяет даже дифференцировать классы гранулоцитов: нейтрофилы, эозинофилы, базофилы.

Флуоресценция: Дифференцировка всех типов клеток крови производится с помощью непосредственного маркирования клеток моноклональными антителами с флуоресцентными красителями.

Современные гематологические анализаторы используют все упомянутые методы измерений по отдельности, в комбинации или все вместе.

К критическим недостаткам всех гематологических анализаторов нужно отнести тот факт, что они не всегда надёжно работают с патологическими образцами крови. В случае какой либо патологии, при измерении могут возникнуть результаты, необъяснимые с точки зрения медицины. В таких случаях требуется повторный анализ на микроскопе, что требует значительных затрат времени и человеческих ресурсов.

Технология сканирующей проточной цитометрии:

Сканирующий проточный цитометр (СПЦ) позволяет существенно увеличить объем информации светорассеяния, получаемой от каждой анализируемой частицы. Индикатриса светорассеяния представляет собой зависимость интенсивности рассеянного света от угла рассеяния. Диапазон измеряемых углов в СПЦ составляет от 5° до 100°. Скорость измерения составляет до 500 частиц в секунду, что значительно превосходит все другие существующие методы для измерения индикатрис одиночных частиц. Технология сканирующей проточной цитометрии дополняется методами решения обратной задачи светорассеяния, которые позволяют получать информацию о морфологии клетки из индикатрисы светорассеяния. Таким образом, измерение и обработка индикатрис светорассеяния от клеток позволяет не только дифференцировать клетки крови, но и характеризовать эти клетки, а именно определять их размер, форму и структуру.

Преимущества технологии сканирующей проточной цитометрии перед существующими гематологическими анализаторами:

Индикатриса светорассеяния является своего рода одномерным отображением клетки и содержит большое количество информации о ее характеристиках. Одна индикатриса занимает примерно 2 Кб, база данных индикатрис может быть записана на один CD диск. Создание банка данных индикатрис светорассеяния патологических клеток, точно так же как это уже сделано для микроскопных изображений, позволит производить анализ в реальном времени, не прибегая к помощи микроскопа.

Благодаря развиваемым подходам в решении обратной задачи светорассеяния контроль качества работы прибора может осуществляться ежедневным измерением калибровочных сфер определенного размера, а не по свежей крови здорового донора.

Использование большого количества информации содержащейся в индикатрисе светорассеяния повышает способность СПЦ к дифференцировке клеток крови по сравнению с другими гематологическими анализаторами. Благодаря чему в анализах можно исключить использование некоторых химических реагентов. Что позволит сделать анализ крови более дешёвым.

Целями данной работы являются:

· Выделение нейтрофилов из периферической крови пациентов. Определения размера и дифференциального сечения рассеяния нейтрофила.

· Расчёт дифференциального сечения рассеяния на основе теоретического моделирования светорассеяния нейтрофила.

· Сравнение дифференциального сечения рассеяния теоретической модели нейтрофила с экспериментально полученным.

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1 Пробоподготовка клеток для измерения на ПСПЦ

Для подготовки образцов нейтрофилов использовалась периферическая цельная кровь пациентов. Кровь забирали в 3 мл пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Проведение эксперимента:

1. Забрать пипеткой 1.5 мл крови и перелить в отдельную пробирку;

2. Довести лизирующим раствором до объёма 15 мл;

3. Ждать около 2 минут;

4. Центрифугировать на 1500 оборотов/мин в течение 5 минут при комнатной температуре;

5. Аккуратно вылить жидкость из пробирки (желательно промокнуть горлышко салфеткой для уменьшения объёма и соответственного сокращения количества используемого красителя). Клетки останутся на дне.

6. Разболтать клетки, проведя несколько раз дном пробирки по ребристой поверхности;

7. Дополнить до 15 мл раствором Эрла (без фенолового красного);

8. Повторить пункты 4, 5.

9. Добавить 20 мкл антител к CD16b. Нейтрофилы экспрессируют CD16b [7;

10. Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре для обеспечения равномерного прокрашивания клеток;

11. Повторить пункты 6, 7, 8;

12. Разбавить 1 мл раствора Эрла для получения рабочей концентрации 10⁶ клеток/мл;

13. Проба готова для измерения. Держать клетки в таком состоянии желательно не более 4−5 часов в холодильнике.

2.2 Экспериментальная установка

Основная идея проточных цитометров стандартной конфигурации заключается в измерении светорассеяния и флуоресценции одиночных частиц. Для этого с помощью гидрофокусирующей головки создается два ламинарных коаксиальных потока: внутренний поток, имеющий диаметр порядка 10−30 мкм (представляет собой пробу с измеряемыми объектами), и внешний, который состоит из дистиллированной и отфильтрованной воды. За счет малого сечения внутренней струи и ламинарности потока в рабочей зоне прибора создается возможность измерения характеристик одиночных частиц. При этом максимальная скорость измерений на проточных цитометрах достигает десятков тысяч частиц в секунду. Такие измерения свойств одиночных частиц, не требующие каких либо предположений о характере распределения, позволяют легко отслеживать малые изменения во всей системе. С другой стороны, высокая скорость накопления данных позволяет измерять большое количество частиц, что дает высокую статистическую достоверность результатов.

В качестве экспериментальной установки был использован сканирующий проточный цитометр (СПЦ).

Его основные характеристики следующие:

1) индикатриса одиночной частицы измеряется в полярных углах от 5 до

120⁰ с интегрированием по азимутальному углу от 0 до 360⁰,

2) измерения, зависимостью от полярного угла, проводятся с использованием одного фотоприемника,

3) во время измерения частица движется в зоне постоянной освещенности.

СПЦ имеет оптическую систему, в которой свет, рассеянный одиночной частицей, сканируется по апертуре фотоприемника во время ее движения в потоке по капилляру кюветы.

Рис. 1. Оптическая схема сканирующего проточного цитометра стандартной конфигурации.

Схема кюветы представлена на Рис. 2. Поток, образованный гидрофокусирующей головкой, направляется в капилляр оптической кюветы (диаметр капилляра 0.254 мм, показатель преломления 1.458). Сферический рефлектор (радиус 3.0 мм) оптической кюветы направляет параллельные лучи на зеркало, расположенное под углом 45 градусов. При пересечении частицей триггерного луча (0 на Рис. 2) система измерения активируется по сигналу триггерного фотодиода. Для любого расположения частицы внутри измерительной зоны свет, рассеянный только под определенным углом отразится сферическим зеркалом параллельно оси потока. Например, углы ₁ и ₂ соответствуют точкам 1 и 2 соответственно (Рис. 2). Угол, образованный направлением падающего лазерного луча и рассеянным лучом, который отражается параллельно оси потока, непрерывно изменяется от ₁ до ₂ ?при движении частицы внутри зоны регистрации оптической кюветы. Параллельные лучи, отраженные 45-градусной пластинкой, выходят из оптической кюветы и фокусируются линзой в диафрагму, установленную перед фотоумножителем. Зависимость напряжения на фотоумножителе от времени может быть легко преобразована в зависимость интенсивности светорассеяния от угла.

Основное излучение (диодный лазер, 660 нм, 20 мВт) (лазер 1, Рис. 1) распространяется вдоль оси канала, по которому движутся частицы, и фокусируется в кювету через оптическое окно в нижней части сканирующей оптической кюветы. Фокусировка луча (линза 1, Рис. 1) обеспечивает постоянную освещенность движущейся частицы во время измерения.

Рис. 2. Упрощенная схема функционирования оптической кюветы. Основной и триггерный луч, а также лучи рассеяния показаны штриховыми линиями.

Сигнал фотоумножителя, отцифровываемый аналогово-цифровым преобразователем (сигнал СПЦ), отличается от реальной индикатрисы вследствие искажения аппаратной функцией СПЦ. Угловое разрешение зависит от положения частицы в зоне регистрации. Для нормировки наблюдаемого сигнала использован аналитический вид аппаратной функции. Ее вид представлен формулой (1) настоящего раздела при = 0, = Д/f, где — диаметр диафрагмы фотоумножителя, f — фокусное расстояние линзы.

, (1)

где

где H — расстояние от пролетающей частицы до диафрагмы фотоприёмника, n₁ — показатель преломления кюветы (кварц), h — расстояние от сферического зеркала до края подложки.

Вид аппаратной функции представлен на Рис. 3.

Рис. 3. Зависимость телесного угла () от .

2.3 Чувствительность и разрешающая способность прибора

Определим диапазон углов, в которых представляется возможным измерять индикатрису светорассеяния нейтрофила. Наибольший вклад в ограничения минимального угла вносят геометрические параметры кюветы. Минимальный угол для измерения при параметрах цитометра d =254 мкм и l =5 мм — и=1.5є.

Рис. 4. Элемент матрицы Мюллера, рассчитанный для оптической модели нейтрофила.

Ограничения для максимального угла измерения индикатрисы составляет паразитный фон, который в эксперименте составлял 10% от максимального пика сигнала (Рис. 5). Индикатриса представляет собой элемент матрицы Мюллера, проинтегрированный по азимутальному углу ц для неполяризованного света. Матрица Мюллера, или матрица рассеяния, связывает параметры Стокса для падающего и рассеянного света. В случае падения на частицу неполяризованного света интенсивностью, интенсивность рассеянного света равна. Элемент матрицы Мюллера, рассчитанный для оптической модели нейтрофила представлен на Рис. 4. Сама модель будет рассмотрена ниже [Глава 3].

Рис. 5 Регистрируемый на СПЦ сигнал светорассеяния от нейтрофила Чтобы найти число фотонов, собираемых фотодиодом в единицу времени, оценим сначала энергию светорассеяния. В нашем случае, интенсивность рассеянного света равна:

, (3)

где, лдлина волны падающего света (для диодного лазера 660 нм). Мощность падающего излучения P= 40 мВт, время облучения нейтрофила ф =0.2 мкс.

Сечение пучка лазера составляло 27· 10^-11мІ. D — ширина перетяжки лазерного излучения (радиус перетяжки), равная 4.7 мкм, где fфокусное расстояние линзы 45 мм, dрадиус пучка на выходе из лазера 2 мм.

Энергия рассеянного света выражается по формуле (4):

, (4)

здесь — поверхность сбора рассеянного света. Подставляя в (4) вместо интенсивности выражение (3) и учитывая, что, получим:

, (5)

где Jпроинтегрированный по телесному углу (Рис. 3) элемент .

Подставляя численные значения величин в формулу (5), и оставляя за варьируемый параметр J, получим:

Количество квантов N, собираемых фотоприемником:

, (7)

где hпостоянная Планка 6.626 · 10^-34 Дж· с, cскорость света 3.0 · 10⁸ м/с.

Используя выражение (6), представим (7) в следующем виде:

(8)

Осталось найти явное выражение для J. По определению, J — проинтегрированный по телесному углу элемент :

(9)

Это выражение с учетом аппаратной функции (1) и (2) можно преобразовать к виду:

(10)

Таким образом, учитывая формулу (10), находим число фотонов по формуле (8) (Рис. 6).

Найдем углы и, при которых шумы сравнимы с количеством рассеянных фотонов. Обычные источники шума, такие как флуктуации интенсивности возбуждающего излучения и флуоресценции потока частиц, в основном результат того, что эмиссия света случайный процесс. Число фотонов, достигающих фотодетектор, подчиняется статистике Пуассона, если имеется источник фотонов, дающий в среднем фот/сек., то вероятность регистрации n квантов за время t подчиняется статистике Пуассона.

(11)

Важное свойство статистики Пуассона заключается в том, что среднеквадратичные флуктуации потока равны мощности источника фотонов. Это выражение описывает так называемый фотонный шум.

В проточной цитометрии сигнал состоит из двух компонент:

1. сигнал светорассеяния от нейтрофила, имеющий n_f фотонов, Рис. 6. Количество квантов, собираемых фотодетектором

2. фоновый сигнал, n_b, вызванный в основном рассеянием на потоке частиц и оптике.

Следовательно, суммарная интенсивность, попадающая на фотокатод, есть n_f+n_b. Далее, попав на фотокатод, фотоны выбивают электроны из фотокатода. Это тоже случайный процесс и количество фотоэлектронов изменяется согласно распределению Пуассона. Следовательно, относительное стандартное отклонение сигнала с фотокатода ФЭУ будет:

(12)

где = (0.05) фотоэлектронная квантовая эффективность ФЭУ — вероятность что фотон, попадая на фотокатод, выбьет фотоэлектрон.

В итоге, максимальный угол и находится из условия, что рассеяние от нейтрофила, собранное под этим углом и падающее на фотокатод, сравнимо с шумами. Величина фона составляла около 10% от максимального пика сигнала светорассеяния, что для оценки можно взять равной n_b=0.1· (1.3•10⁶) (Рис. 6). Так как стандартное отклонение есть мера разброса значений относительно среднего, то, приравняв у_p =1, найдем величину сигнала светорассеяния n_f, при котором шумы сравнимы с данным сигналом. Решая квадратное уравнение (12) относительно неизвестной n_f, получим значение n_f = 1.6 10³. По чувствительности ФЭУ нет ограничений, так как нет угла, соответствующего полученному значению n_f, (Рис. 6). Таким образом, диапазон углов, в которых представляется возможным измерять индикатрису светорассеяния нейтрофила, ограничивается значением 120 градусов.

Глава 3. Результаты и обсуждение

СПЦ позволяет измерять абсолютные характеристики светорассеяния частиц. Индикатрисы светорассеяния полистирольных частиц, измеренные на СПЦ, хорошо согласуются с индикатрисами, посчитанными с помощью теории Ми [11], поэтому размер и показатель преломления однородных сферических частиц были определены методом наименьших квадратов (МНК).

Дифференциальное сечение рассеяния вычислялось по формуле:

(13)

Где S₁₁-сигнал с СПЦ, у-дифференциальное сечение рассеяния, n₀=1.337 показатель преломления среды, л= 660 нм — длина волны излучаемого лазера.

Дифференциальное сечение рассеяния характеризует эффективность частицы рассеивать свет. Для определения дифференциального сечения нейтрофилов на СПЦ одновременно измерялись индикатрисы полистирольных частиц (сферы) размером 5мкм и лейкоцитов четырёх различных пациентов. Пробоподготовка осуществлялась по описанной выше методике [2.1]. По флуоресценции были выделены индикатрисы нейтрофилов. Результаты измерения представлены на Рис. 7. Шкала абсолютного дифференциального сечения рассеяния была определена с помощью метода нелинейной регрессии экспериментальных индикатрис полистирольных частиц и теоретических индикатрис, посчитанных с помощью теории Ми.

Рис. 7 Дифференциальное сечение нейтрофилов и полистирольных частиц 5 мкм

В данной таблице представлены средние значения размеров нейтрофилов со стандартной ошибкой среднего и шириной распределения. Размер клеток определялся с помощью Фурье преобразования индикатрисы. Посчитано для четырёх различных пациентов.

На Рис. 8 представлены средние дифференциальные сечения рассеяния нейтрофилов для четырёх различных пациентов. Так как размеры самих клеток и гранул отличаются от пациента к пациенту, это обуславливает различия между дифференциальными сечениями рассеяния.

Рис. 8 Среднее (по пробе) дифференциальное сечение рассеяния нейтрофилов четырёх различных пациентов

Моделирование светорассеяния однородными частицами простой формы производится относительно легко. К сожалению, большинство клеток крови имеют неоднородную структуру и сложную форму. Поэтому была предложена оптическая модель нейтрофила в виде сферы, заполненной сферами меньшего диаметра — гранулами и ядром в виде четырёх сфероидов различных размеров (Рис. 9). Данная модель имеет следующий набор параметров, значения которых соответствуют литературным данным по морфологии: диаметр клетки d_с=9.6 мкм, диаметр гранул d_g=0.1, 0.15 и 0.2 мкм, показатель преломления цитоплазмы клетки m_c=1.357, показатель преломления гранул m_g=1.54, показатель преломления среды (в данной работе это физ. раствор) m₀=1.337, объёмная доля гранул f=0.1, 0.2, объёмная доля ядра — 0.11.

Рис. 9 Оптическая модель нейтрофила. Все гранулы идентичны и расположены случайным образом. Доли ядра отличаются друг от друга по размеру и расположены случайным образом.

Данная модель была использована для расчёта дифференциального сечения рассеяния методом Discrete Dipole Approximation (DDA). В настоящее время DDA самый мощный метод расчёта светорассеяния от биологических частиц произвольной формы.

Расчёт методом DDA был произведён для шести различных наборов параметров. Варьировали диаметр гранул d_g и угол в поворота клетки относительно оси z.

Рис. 10 Дифференциальное сечение рассеяния для полистирольной частицы 5 мкм и характерных нейтрофилов четырёх различных пациентов

Результаты расчёта представлены на Рис. 11. Результаты обработки теоретических индикатрис нейтрофилов для различных наборов параметров показали, что интенсивность рассеянного света в углы более 30?, зависит от размера гранул и их количества. Из Рис. 10, Рис. 11 видно, что экспериментальные и теоретические сечения рассеяния хорошо согласуются. Что позволяет сделать вывод об адекватности, предложенной нами оптической модели нейтрофила.

Рис. 11 Дифференциальное сечение рассеяния оптической модели нейтрофилов для различных наборов параметров

Приведённые выше результаты, демонстрируют возможность СПЦ анализировать светорассеивающие свойства нейтрофилов. В будущем планируется разработать методики, позволяющие определять патологии нейтрофилов при различных заболеваниях.

Результаты

В данной работе были получены следующие результаты:

1. Впервые измерена индикатриса нейтрофилов. Получена зависимость дифференциального сечения рассеяния от угла рассеяния.

2. Предложена оптическая модель, описывающая морфологию нейтрофила. Данная модель была использована для расчёта абсолютного дифференциального сечения рассеяния методом DDA.

3. Экспериментальные и теоретические сечения рассеяния хорошо согласуются, что говорит об адекватности предложенной оптической модели.

Данная работа открывает новый способ получения гематологических характеристик, которые могут быть использованы как признаки патологий нейтрофилов.

Основные результаты данной работы докладывались на:

· Биофизической мастерской-2006 Новосибирск, 21 декабря 2006 г.;

· Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс-2007, Новосибирск, 11−13 апреля 2007.;

· Биофизической мастерской-2007 Новосибирск, 16мая 2007;

· Всероссийской Научной Конференции Студентов Физиков и молодых учёных (ВНКСФ-13), Ростов-на-Дону — Таганрог, 26марта-4 апреля 2007.

1. http://medicine.belmapo.by/download/2003/H_JOURNAL_2003₁.pdf

2. А. А. Тотолян, И. С. Фрейдлин Клетки иммунной системы, С.-Пб., «Наука», 1999, т. 1.

3. Maltsev VP and Semyanov KA. Characterisation of Bio-Particles from Light 4. Scattering. Inverse and I11-Posed Problems Series, Utrecht: VSP, 2004.

M.A.Yurkin Discrete dipole simulations of light scattering by blood cells, Amsterdam, 2007.

5. A.M. Thurau, U. Schylz, V. Wolf, N. Krug, and U. Schauer, Identification of eosinophils by flow cytometry, Cytometry 23, 150−158 (1996).

6. К. А. Семьянов Отчёт о научно-исследовательской работе по теме «Разработка методик выполнения измерений характеристических параметров в Т и В лимфоцитов, ретикулоцитов, тромбоцитов и гранулоцитов цельной крови человек на сканирующем проточном цитометре», Новосибирск, 2006.

7. В. А. Павлов Поляризационные измерения на сканирующем проточном цитометре, Новосибирск 2002.

8. Д. И. Строкотов Изучение характерных особенностей морфологии лимфоцитов по светорассеянию, Новосибирск, 2006.

9. И. В. Колесникова Исследование формы тромбоцитов с помощью сканирующей проточной цитометрии, Новосибирск, 2006.

10. Soini JT, Chernyshev AV, Hдnninen PE, Soini E, Maltsev VP. A new design of the flow cuvette and optical set-up for the Scanning Flow Cytometer. Cytometry 1998;31:78−84.

11. A. Hoekstra et.al. (eds.), Optics of Biological Particles, 269−280.