Микробиологический анализ балластных вод

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ.

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Академия экологии, морской биологии и биотехнологии Отделение экологии Кафедра общей экологии Курсовая работа, 3 курс Научный руководитель:

к. б. н., доцент кафедры общей экологии ДВГУ, И. П. Безвербная ЛЕТЯГИНА АЛЕНА ВАСИЛЬЕВНА Владивосток.

Содержание ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. Литературный обзор

1.1 Микробиологические исследования переноса чужеродных микроорганизмов с судовым балластом.

1.2 Формы существования микроорганизмов в водных микробных сообществах, методы их анализа и количественного учета.

1.3 Сохранение и изменение патогенных свойств микроорганизмов в водной среде ГЛАВА 2. Материалы и методы ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

ВВЕДЕНИЕ

Одной из серьезных экологических проблем является проблема биологической инвазии. То есть вселение, несвойственных данной акватории, организмов в новые местообитания. Одним из способов попадания микроорганизмов в новые акватории осуществляется путем их сбрасывания с балластными водами. Чужеродные организмы могут перемещаться через океаны в водяном балласте судов, адаптироваться к новым условиям и в результате создавать значительные проблемы для морской среды, государственного имущества и здоровья человека. В забортной воде могут содержаться различные живые существа — от бактерий и мелких водорослей до моллюсков, медуз и даже небольших рыб. Эти живые существа попадают на борт судна в порту выгрузки, путешествуют вместе с судном на многие тысячи морских миль и сбрасываются за борт в порту погрузки.

Одним из путей попадания чужеродных морских организмов в акватории портов является транспортировка их с балластными водами. В частности это характерно и для портов города Владивосток. Природные воды могут загрязняться микроорганизмами кишечной группы (холерный вибрион, бациллы брюшного тифа, паратифов, дизентерии), лептоспирами (возбудителями инфекционной желтухи, водяной лихорадки), возбудителями туляремии, бруцеллеза, некоторыми вирусами (Коксаки, ЕСНО, полиомиелита, трахомы и др.). Следует отметить, что вредными могут являться в данных обстоятельствах не только возбудители инфекций, но и вполне мирные в своей нормальной среде обитания существа (Сагайдак, 2003).

Микроорганизмы обладают уникальной способностью к адаптации. Для них характерна высокая экологическая пластичность и способность сохранять свою жизнеспособность в широком диапазоне различных абиотических факторов — влажность, температура, органический состав, рН и др. (Бухарин, Литвин, 1997). Благодаря чему риск загрязнения акваторий портов возрастает. Микроорганизмы вступают в сложные отношения с другими обитателями экосистем. Отсюда их способность вырабатывать субстанции, которые называются «факторами патогенности». Борьба с переносом водных организмов с водяным балластом является большой и трудной задачей.

В настоящее время еще не приняты международные правила по контролю над переносом и внесением вредных водных и патогенных организмов посредством водяного балласта судов. Микроорганизмы, транспортируемые с балластными водами могут находиться в трех формах: в планктонной, в осадках и биопленках. Остается проблемой оценка количества и особенностей этих микроорганизмов. Методы отбора и микробиологического анализа балластных вод до сих пор недостаточно разработаны. Кроме того, в Приморье, где функционируют несколько крупных портов, деятельность которых связана с экспортом грузов, до сих пор не проводилось изучение переноса микроорганизмов с судовым балластом. В связи с этим актуальным является проведение поисковых микробиологических исследований для анализа ситуации с переносом микроорганизмов в балластных танках судов и подбор методик для выполнения последующих масштабных мониторинговых исследований.

Поэтому целью курсовой работы было: подобрать методы и провести микробиологический анализ балластных вод, отобранных на судах, работающих на наиболее интенсивных судоходных линиях. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) изучить существующие методы оценки численности и состава планктонных микробных сообществ, сообществ осадков и биопленок, в которых могут существовать микроорганизмы в балластных танках судов;

2) проанализировать литературные данные о микробиологических исследованиях проб из балластных танков судов;

3) изучить известные факты и условия проявления микроорганизмами, изолированными из водной среды, патогенных свойств;

4) выполнить микробиологический анализ проб балластной воды и составить коллекцию штаммов для последующих исследований.

ГЛАВА 1. Литературный обзор

1.1 Микробиологические исследования переноса чужеродных микроорганизмов с судовым балластом Вселение опасных морских видов с балластными водами судов в новую окружающую среду, было идентифицировано как одна из четырех самых больших угроз океанам в мире. Другие три — наземные источники морского загрязнения, чрезмерное использование морских ресурсов и физическое изменение/разрушение морской среды обитания (Сообщение № 4 AGPS, 1993).

У привнесенных водных видов есть потенциал вызывать крупные экологические и экономические изменения (Carlton et. al., 1990; Mills et. al., 1993) и микробные компоненты могут представлять опасность для здоровья человека (McCarthy, Khambaty, 1994; Hallegraeff, 1998). Главное направление в мировом транспорте чужеродных водных видов — это перенос их с балластными водами, сбрасываемыми с судов (Carlton, 1985; Ruiz et. al., 1997). Например, известно, что Соединенные Штаты Америки ежегодно получают более 79 млн. тонн балластных вод из-за границы (Carlton et. al., 1995). Когда суда берут воду в одном порту и сбрасывают в другом, балластные воды могут включать в себя различный состав планктона, нектона и бентоса (Carlton, Geller, 1993; Lavoie et. al., 1999).

Исследование балластных вод сосредоточилось в значительной степени на многоклеточных, однако в изобилии среди водных организмов находятся микроорганизмы. Было подсчитано, что бактерии и вирусы естественного происхождения в прибрежных водах имеют высокие концентрации (Ducklow, Shiah, 1993; Wommack, Colwell, 2000). Учитывая такой удельный вес, высокую репродуктивную способность и широкий диапазон устойчивости к физическим факторам — микроорганизмы являются частыми захватчиками прибрежных экосистем (Ruiz et. al., 2000).

Исследования микроорганизмов в балластных водах были ограниченны до настоящего времени и сосредоточились главным образом на Vibrio cholerae (McCarthy, Khambaty, 1994), динофлагелятах (Hallegraeff, 1993, 1998) и протистах (Galil, Hulsmann, 1997). Примером наиболее вероятного транспорта с балластными водами, среди микроорганизмов, является Vibrio cholerae O1. Этот вид вызывает у человека заболевание холеры. В 1991 Vibrio cholerae был найден в устрицах и кишечнике рыб в заливе Mobile Bay, Алабама (DePaola et. al., 1992). Этот вид Vibrio cholerae не отличался от вида, отвечающего за эпидемию холеры в Латинской Америке, которая была в это же время. Когда же балластные воды судов, покинувших Латинскую Америку и прибывших в Mobile Bay, были проверены на бактерию холеры, то было обнаружено, что они содержали вызывающий эпидемию вид Vibrio cholerae (McCarthy et. al., 1992). Это предполагает, что балластная вода способствовала вселению в прибрежные воды залива Соединенных Штатов вызывающего эпидемию вида. Впоследствии, Береговая охрана Соединенных Штатов организовала Международную Морскую организацию по контролю за Балластными водами. Моряки предпринимают меры по снижению распространения патогенных микроорганизмов в балластных водах (Federal Register 1991).

Сейчас единственный широко распространенный метод для управления распространением чужеродных водных микроорганизмов — это обмен балластными водами открытого океана. Эта процедура заключается в том, что судно, которое взяло балластную воду в прибрежном порту, сбрасывает эту воду в открытом океане и заменяет ее океанической водой. В свою очередь эта океаническая вода выпускается в следующем порту захода. Уменьшая плотность прибрежных организмов, и заменяя их океаническими видами, процент успеха вторжения микроорганизмов теоретически ниже. Различия между океанической водой и водой в порту получения, где происходит ее сбрасывание, обеспечивают большую вероятность гибели океанических видов (Smith et. al., 1999).

Однако есть несколько проблем с этой обменной процедурой; в первую очередь опасность для судна и команды из-за волнений в море или вследствие выполнения процедуры ненадлежащим образом. Кроме того, много судов предпринимают только частичный обмен (Carlton, 1995); даже когда обмен предпринят, это не всегда полностью эффективно (Zhang, Dickman, 1999), так как осадок в основании резервуаров судов не может быть полностью удален во время обмена (Williams et. al., 1988). Наконец, изменения в солености воды могут немного затронуть микроорганизмы и особенно их покоящиеся стадии, или вообще никак на них не повлиять.

Объемы переноса бактерий и степень их выживаемости в новой среде могут быть значительными. Так, например, анализ результатов микробиологических исследований БВ и осадков 69 судов, прибывающих в Чесапикский залив (США), и экстраполяция экспериментальных данных показали, что в заливе ежегодно выживает до 1018−1019 клеток бактерий, перенесенных с балластом (Drake et. al., 2007).

Неоднократно также сообщалось о выявлении и высокой выживаемости патогенных и условно-патогенных бактерий в пробах из балластных танков судов, в частности, энтерококков, Listeria monocytogenes, Aeromonas spp., Providencia rettgeri, Salmonella spp., Escherichia coli и других представителей сем. Enterobacteriaceae, Mycobacterium spp., Clostridium perfingens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putrefaciens, Vibrio algynolyticus, Vibrio cholerae, Vibrio spp. (Burholder et. al., 2007; Dobbs et. al. 2003; Drake et. al., 2003; Ivanov, 2006; Knight et. al., 1999; Whitby et. al., 1998).

Томсон с соавторами показали высокий уровень антибиотикорезистентности среди патогенных бактерий, обнаруженных в БВ и опасность этих особенностей превносимых бактерий для сообществ Чесапикского залива (США) (Thomson et. al., 2003).

В настоящее время сведений о микроорганизмах балластных вод не так уж и много, универсальных методов анализа и количественного учета не разработано. Известно, что микроорганизмы могут сохраняться в балластных танках в воде, в осадках и в виде биопленок. Каждое из этих типов сообществ — специфично, для каждого существуют свои методы и особенности исследования.

1.2 Формы существования микроорганизмов в водных микробных сообществах, методы их анализа и количественного учета микроорганизм водный патогенный перенос Микробные сообщества в воде могут находиться в различных видах. Они могут быть в планктонной форме, в виде биопленок или в осадках.

Биопленки. Микроорганизмы предпочитают жить, будучи прикрепленными к твердой поверхности, нежели свободно плавающими — как в водной среде, так и в воздухе. Они организованы в так называемые биопленки (Biofilm), сбалансированные по видовому составу и функциональному распределению членов сообщества. Микроорганизмы в биопленке существуют и ведут себя не так, как свободно плавающие бактерии.

Это взаимодействующая общность разных типов микроорганизмов, которые сгруппированы в микроколонии, окруженные защитным матриксом. Матрикс пронизан каналами, по которым циркулируют питательные вещества, продукты жизнедеятельности, ферменты, метаболиты и кислород. Все микроколонии имеют свои микросреды, отличающиеся уровнями рН, усваиванием питательных веществ, концентрациями кислорода. Бактерии в биопленке общаются между собой посредством химических раздражений (сигналов). Микроорганизмы в биопленке более устойчивы к антибиотикам, антимикробным средствам и другим активным агентам.

В биопленке по-иному, в сравнении с чистыми культурами бактерий, происходят их многочисленные физиологические процессы, в том числе продукция метаболитов и биологически активных веществ. Сообщество организует единую генетическую систему в виде плазмид — кольцевых ДНК, несущих поведенческий код для членов биопленки, определяющих их пищевые (трофические), энергетические и другие связи между собой и внешним миром. Реакция микроорганизмов на изменение условий окружающей среды в биопленке существенно отличается от реакции каждого отдельного вида в монокультуре. Такая организация обеспечивает ее физиологическую и функциональную стабильность и, следовательно, является залогом конкурентного выживания в экологической нише.

Микроорганизмы в донных осадках. Важнейшая из экологических зон — это водное пространство или пленка на поверхности донных осадков, где происходит массовое развитие фототрофных сообществ и осуществляется первичная продукция органического вещества. Продукция органического вещества в результате фотосинтеза является необходимым условием обеспечения жизни в водоеме. Конечные продукты фотосинтеза обычно имеют большую молекулярную массу. К этой группе веществ относят углеводы, пептиды, целлюлоза, растворимые и летучие вещества — прямые субстраты для роста микроорганизмов, а также ряд веществ ингибиторов или стимуляторов роста. Осадки характеризуются присутствием форм, способных к скользящим движениям, либо прикрепленным к субстрату. К их числу относят многие цианобактерии, диатомеи, зеленые фототрофные нитчатые бактерии, флексибактерии, нитчатые серные бактерии (Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А. и др., 2004). В балластных водах микроорганизмы могут содержаться в донных осадках.

Микроорганизмы в планктонной пленке. Поверхностная пленка воды характеризуется обилием питательных веществ, преимущественно липидов, которые вследствие высокого поверхностного натяжения накапливаются здесь из водной массы и из воздуха. Поверхностная пленка представляет собой аналог твердого субстрата, к которому прикрепляются в массовом количестве микроорганизмы.

В создании первичной продукции Мирового океана значительную роль играет фотосинтез пикопланктона. Для него характерны некоторые виды цианобактерий, фотосинтезирующие зеленые серобактерии.

Методы количественного учета микроорганизмов.

О росте микроорганизмов в естественных субстратах или в питательных средах судят по изменению количества их клеток или биомассы в единице объема. Методы определения этих показателей могут быть прямыми (подсчет клеток под микроскопом, взвешивание) или косвенными. Косвенные методы основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества или биомассы микроорганизмов (число колоний, выросших после посева суспензии клеток на питательную среду, рассеяние или поглощение суспензией света, содержание в ней белка и т. д.). Выбор метода зависит от целей исследования, свойств питательной среды или субстрата, а также особенностей роста и морфологии микроорганизмов.

Большинство микроорганизмов, растущих в природных образцах, еще ждут своей очереди быть выделенными в чистые культуры. По некоторым оценкам, можно культивировать меньше 0,1% всего микробного разнообразия.

Десятки тысяч видов микроорганизмов нуждаются в выделении и идентификации. Хотя многие из таких микроорганизмов относятся к так называемым «некультивируемым» и, таким образом остающимся недоступным классическим микробиологическим методам идентификации, существует несколько способов, позволяющих оценить их разнообразие и распространение.

Культивируемые микроорганизмы обладают способностью к росту на плотных и жидких питательных средах (Нетрусов А.И., Егорова М. А. и др., 2005); а некультивируемые — организмы, которые не прорастают на обычно пригодных для них средах. Эта категория относится к физиологическому состоянию известных организмов, а не организмам, для которых не подобраны методы культивирования (Заварзин Г. А., Колотилова Н. Н., 2001).

Поэтому выделяют следующие методы количественного учета для некультивируемых форм:

Определение количества клеток микроорганизмов под микроскопом. Метод позволяет определить общее количество клеток в единице объема (как живых, так и мертвых). Основное ограничение метода — необходимость довольно высоких концентраций клеток в единице исследуемого субстрата.

1. Подсчет клеток в счетных камерах. Это метод рекомендуется использовать для подсчета некоторых относительно крупных бактерий.

2. Капиллярный метод прямого счета микроорганизмов. Позволяет подсчитывать мелкие микроорганизмы. Применяется для подсчета микробных клеток и контроля роста бактерий.

3. Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского—Брида). Этот метод применяется в различных модификациях для определения численности микроорганизмов в разнообразных естественных субстратах. Преимущество метода заключается также в том, что фиксированные окрашенные препараты могут долго храниться.

4. Подсчет клеток на мембранных фильтрах. Данный метод рекомендуется использовать для определения численности микроорганизмов в субстратах с низкой плотностью клеток.

При выявлении и количественном учете микроорганизмов широко применяют люминесцентную микроскопию. Люминесцентная микроскопия дает также возможность выявить и оценить в исследуемой пробе численность отдельных групп микроорганизмов (Нетрусов А.И., Егорова М. А. и др., 2005).

Методы количественного учета для культивируемых форм:

Определение числа клеток микроорганизмов высевом на питательные среды. В отличие от подсчета микроорганизмов под микроскопом этот метод дает возможность определить только число жизнеспособных клеток в популяции. Поскольку сред, пригодных для роста всех микроорганизмов, не существует, метод высева дает возможность определить лишь число микроорганизмов, способных расти на среде данного состава, причем не позволяет учесть те микроорганизмы, которые не растут (например, так называемые жизнеспособные, но не культивируемые формы) или растут очень медленно.

1. Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (метод Коха). Метод широко применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и в лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки.

2. Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений). Метод используют для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не растут на плотных питательных средах.

Определение биомассы взвешиванием. Этот метод широко применяют для оценки роста микроорганизмов в жидких питательных средах. Можно использовать его и для определения массы клеток, выращенных на плотной питательной среде.

Определение количества клеток и биомассы нефелометрическим методом. Позволяет быстро и довольно точно определить концентрацию клеток в суспензии или культуральной жидкости. Нефелометрический метод пригоден лишь для тех микроорганизмов, рост которых вызывает равномерное помутнение среды и не сопровождается заметным изменением формы и размеров клеток, образованием мицелия, пленок или других скоплений (Нетрусов А.И., Егорова М. А. и др., 2005).

Кроме количественного учета микроорганизмов, чрезвычайно важно анализировать качественный состав микробного сообщества, который может указать на роль и потенциал микробоценоза в экосистемах. Существует несколько различных методов анализа структуры микробного сообщества:

1. Структура сообществ на основе липидного анализа. Информация, полученная с помощью липидного анализа, позволяет частично проникнуть внутрь микробного сообщества. ЖК образцы из природных микробных сообществ представляют в основном широкий спектр сложных молекул в которых эти образцы ЖК обеспечивают количественный анализ, но интерпретация отдельных специфических компонентов сообщества может быть трудной. Количественные сравнения суммарных образцов ЖК могут дать информацию о структуре сообщества в целом, но не могут обеспечить более детальный анализ на уровне (внутри) отдельных специфических микробных групп.

Анализ содержания специфических липидных биомаркеров не может определить каждый вид микроорганизмов в природных образцах, т.к. много видов имеют сходный ЖК состав. Некоторые специфические группы микроорганизмов, однако, имеют характерный специфический ЖК профиль.

Липидный анализ может быть чрезвычайно полезен, когда основные физические параметры или экология системы известны. В особенности, ЖК анализ обеспечивает оценку гетерогенности образцов или гетерогенность внутри образца и оценку структуры сообществ. Липидный анализ дает такую информацию о сообществах, которую невозможно получить другими методами.

2. Структура сообществ на основе анализа нуклеиновых кислот. Анализ ДНК в образцах был использован успешно для усиления ЖК анализа.

Такой подход позволяет определить физиологический потенциал микробного сообщества. По сравнению с ЖК анализом это более детальный подход для изучения структуры микробных сообществ, он представляет собой комбинацию следующих методов: амплификацию с помощью ПЦР, следующие затем денатурирующий градиентный гель электрофорез (DGGE) или температурный градиентный гель электрофорез (TGGE) — анализ генов рРНК.

Сочетание ЖК анализа и анализа НК может быть очень полезным для характеристики биомассы и структуры микробного сообщества. Липидный анализ является показателем фенотипических свойствам сообщества, которые показывают существующую в настоящий момент микробиологическую активность, скорость роста, действие токсикантов, несбалансированный рост, дефицит некоторых питательных веществ, метаболический баланс между аэробами и анаэробами, в то время как анализ НК позволяет более детально оценить структуру и физиологический потенциал микробного сообщества.

3. BIOLOG. Автоматизированная система идентификации микроорганизмов, основанная на аэробной метаболической активности, используется для определения сравнительной структуры микробных сообществ. Система основана на оценке дифференциальной бактериальной метаболической активности в отношении 92 углеродсодержащих субстратов и может показать различия в метаболизме микробных сообществ.

Структура сообществ на основе анализа изолированных штаммов. Для идентификации культивируемых микроорганизмов в настоящее время широко используется анализ содержания distinctive ester-linked FA (преимущественно для фосфолипидов и липополисахаридов клинических изолятов). Образцы уникальных (выдающихся ЖК из микроорганизмов, выращенных на стандартной среде используются для дифференцировки более чем 2000 организмов с использованием стандартной системы MIDI идентификации (MIDI, Newark, Del.). Использование этой системы требует предварительной изоляции и культивирования штаммов. Как результат этого, некультивируемые организмы, составляющие значительную часть микробного сообщества не могут быть идентифицированы (Hurst, 2002).

Многие патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, сохраняясь в балластной воде как в культивируемом, так и в некультивируемом состоянии, могут представлять угрозу для водных сообществ акваторий, куда идет сброс балласта..

1.3 Сохранение и изменение патогенных свойств микроорганизмов в водной среде Приведем некоторые факты переноса с балластными водами условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.

Было изучено бактериологическое качество балластных вод судов приходящих из иностранных портов в порты Сингапура. В результате, из-за безудержной разгрузки балластных вод и осадка от судов, была объявлена угроза вселения опасных патогенных микроорганизмов. Образцы балластных вод с судов Сингапурской гавани были сравнены по концентрации таких бактерий, как enterobacteria, Vibrio spp. и Escherichia coli. Концентрация факультативно-анаэробных бактерий, которые часто являются агентами болезней, в балластной воде судов, была выше, чем в морской воде. Образцы проб балластных вод дали следующие результаты: 0,7 — 39,5% eubacteria; 0 — 2,5% enterobacteria; 0,2 — 35,8% Vibrio spp.; 0 — 2,5% E. coli. Существенный процент Vibrio spp. в некоторых образцах балластных вод увеличивает риск вторжения патогенных микроорганизмов в прибрежные области. Так же было показано фекальное загрязнение воды. Из-за содержания в балластных водах патогенных микроорганизмов, за ними был введен регулярный контроль.

Так же известны случаи сброса балластных вод содержащих патогенные микроорганизмы, в гавани Мумбай (Индия). По микробиологическому анализу проб, содержание таких патогенных бактерий, как Escherichia coli Shigella-Alkaligens группы Dispar были в изобилии по сравнению с другими частями гавани Мумбай, где не происходило сброса вод. Даже Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus, Salmonella spp., campylobacters и aeromonads присутствовали в больших количествах.

Есть и еще ряд случаев переноса с балластными водами патогенных микроорганизмов. Которые способны не только выживать в новых условиях, но и передавать свои гены другим микроорганизмам.

Появление антибиотико-устойчивых микроорганизмов — эволюционный урок. Селекция антибиотико-резистентных бактерий и лекарственно-устойчивых паразитов часто не соответствует используемым препаратам. Патогены могут «приобретать» новые гены резистентности и для того, чтобы сохраниться в природе среди непатогенных видов. Здесь они селекционируются, а возможно даже и создаются давлением антибиотиков соперничающих видов (Morse S., 1995).

Многие вирусы обладают способностью мутировать и благодаря этому постоянно образуют новые эпидемические и эпизоотические варианты.

Вирусы, бактерии обладают способностью переносить участки генов от одного организма к другому. Это явление получило название горизонтального переноса генов. У бактерий перенос генов плазмидами, переходящими от одной бактериальной клетки к другой, служит механизмом рекомбинации. Благодаря этому механизму полезные для бактериальной популяции свойства, например устойчивость к антибиотикам, очень быстро становятся всеобщим достоянием.

Горизонтальный (латеральным) перенос генов может быть между организмами, как близкородственными, так и филогенетически отдаленными, принадлежащими даже к разным царствам. Горизонтальный перенос генов является главным источником инноваций, инструментом быстрого приобретения и возникновения новых генов, способных радикально изменить свойства клеток, расширить их адаптационный потенциал. Изменчивость организмов в результате горизонтальной передачи генов реализуется через различные каналы генетической коммуникации — процессы коньюгации, трансдукции, трансформации, процессы переноса генов в составе векторов — плазмид, вирусов, мобильных элементов. Активный перенос генов может происходить в симбиотических, паразитарных или ассоциативных системах, где осуществляется физический контакт клеток.

Возможно три варианта переносов: 1) Приобретение нового гена, для которого нет гомолога в собственном геноме и в геномах филогенетически родственных организмов. В этом случае возникает принципиально новое качество; 2) Приобретение паралогичного (структурно похожего) гена с генетически отдаленным родством. В результате такого переноса увеличивается функциональное разнообразие белков в клетке; 3) Приобретение нового гена ксенолога, функционально замещающего свой собственный ген, который при этом, как правило, элиминируется. Новый и старый гены структурно различаются между собой, но обеспечивают аналогичные физиологические функции.

В результате горизонтального переноса организм может получить следующие преимущества:

1) Новый путь биосинтеза или катаболизма, обеспечивающий организму преимущества в изменившихся условиях; например, появление способности утилизировать новый субстрат.

2) Повышение устойчивости к антибиотикам, токсинам, патогенам, подавляющим рост клеток данного вида; через горизонтальный перенос могут быть получены и гены, ответственные за средства «нападения», характерные, например, для патогенных микроорганизмов.

3) Замещение предсуществующих генов такими генами, продукты которых увеличивают эффективность функционирования клеточных систем: например, повышение термоустойчивости, резистентности к ингибиторам, оптимизация кинетических характеристик белка, интеграция в сложные комплексы и т. п.

4) Приобретенные гены могут оказаться и функционально нейтральными, дублирующими уже имеющиеся гены; такие дополнительные гены являются страховкой для организма в тех случаях, когда свой собственный ген будет поврежден мутацией или «замолчит» из-за нарушения в системах регуляции.

Приобретение «чужих» генов может изменить направление эволюции вида, существенно повлиять на фенотип организма, на его способность к адаптации в экологическом сообществе. Новый ген может дать начало новой субпопуляции, которая способна вытеснить предсуществующий вид. Горизонтальный перенос генов способствует ускорению эволюционного процесса, по сравнению с градуальным накоплением мутаций или внутригеномными перестройками. Конечно, при этом не отрицается селективное значение мутационных утрат какой-то функции и важная эволюционная роль мутаций в генах, контролирующих стабильность генома (системы репликации, репарации, модификации ДНК и т. д.) и механизмы регуляции и координации генного действия.

Поскольку гены являются сложными структурами и содержат различные домены, ответственные за разные функции в белковом продукте, то, очевидно, что через горизонтальный перенос могут передаваться не только целые гены или блоки генов, но и фрагменты генов, содержащие отдельные домены.

Микроорганизмы привнесенные в прибрежные акватории вступают в сложные отношения с другими обитателями экосистем, вмещающих их резервуары (конкуренция, симбиоз, отношение «хищник — жертва»). Отсюда их способность вырабатывать «факторы патогенности». Каждый из них ответственен за проявление конкретных свойств микроорганизма в инфекционном процессе. К ним относят: факторы адгезии и колонизации — с их помощью бактерии распознают рецепторы на мембранах клеток, прикрепляются к ним и колонизируют клетки (различные поверхностные структуры клеточной стенки); факторы инвазии — благодаря им бактерия проникает в клетку (белки наружной мембраны); факторы, препятствующие фагоцитозу — либо маскируют бактерию от фагоцитоза (капсула), либо подавляют фагоцитоз (различные белки — белок, А у стафилококков, белок М у стрептококков); факторы, подавляющие фагоцитоз — вещества, подавляющие окислительный взрыв фагоцитов (например, V-W-антигены Y. pestis); ферменты «защиты и агрессии» бактерий — способствуют распространению бактерий по тканям хозяина (гиалуронидаза, лецитиназа, протеазы и др.); эндотоксины — представлены только у грамотрицательных микроорганизмов (липосахариды и связанные с ними белки клеточной стенки). Высвобождаются в среду организма после гибели клетки и обладают многообразным воспалительным и пирогенным действием неспецифического характера; экзотоксины — токсические молекулы, активно секретируемые в окружающую среду с помощью специальных секретируемых систем (Коротяев А.И., Бабичев С. А., 1998).

Таким образом, микроорганизмы способны приобретать новые гены, переходить от условно-патогенных к патогенным, быть устойчивыми к антибиотикам, и тем самым представлять угрозу как для водных сообществ, так и для человека.

ГЛАВА 2. Материалы и методы Микробиологический анализ проб воды проводится с использованием чашечного метода Коха. Для детальной оценки опасности транспортируемого балласта параллельно используются методики прямого подсчета микроорганизмов с использованием эпифлуоресцентного окрашивания реактивом DAPI (2,4,6-диамидино-, 2- фенилиндол), анализ структуры сообществ с использованием спектра утилизируемых углеводородных субстратов (метод BIOLOG) и оценки факторов патогенности у изолируемых штаммов.

Флуоресцентные методы общего учета бактерий. Здесь используется краситель, который флуоресцирует, специфически связываясь с соответствующими компонентами клетки. Это нуклеиновые кислоты или белки независимо от того, метаболически активна клетка или нет. К такому красителю относится 4,6-диамидино-2-фенилиндол (4,6-diamino-2-phenylindole, DAPI). Этот краситель связывается с ДНК и РНК. Он специфичен и химически связывается с двойной цепочкой ДНК, особенно с участками, богатыми аденином и тимином, и в меньшей степени с неклеточными структурами. DAPI, как катионный краситель, адсорбируется негативно заряженными частицами почвы, глины, а также фосфолипидами. Он наиболее и подходит для окрашивания микроорганизмов в водных образцах.

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение Бактериологический анализ проб БВ лесовоза «Timber Star», отобранной в п. Саката (Япония), показал, что на основе общего количества КОЕ гетеротрофных бактерий, варьирующего в диапазоне 103−104 кл/мл (Таблица 1), воды характеризуются как умеренно-загрязненные (Гидрохимические показатели…, 2007). Для сравнения, аналогичные данные для вод б. Золотой Рог в августе-сентябре 2007 г. составляли 106 — 107 кл/мл, что характеризует воды как грязные (Гидрохимические показатели…, 2007).

Таблица 1.

Численность КОЕ гетеротрофных бактерий, кл/мл, в пробах воды из балластных танков лесовоза «Timber Star».

В период с 1.09.2007 по 14.09.2007 судно не осуществляло замену балласта. Это позволило проанализировать влияние продолжительности хранения БВ на численность бактерий. Отмечено, что значимого изменения количества КОЕ гетеротрофных бактерий за 13-дневный период хранения БВ не произошло (Таблица 1). Полученные данные хорошо согласуются с известными сведениями о том, что продолжительность хранения балласта от 2 до 176 дней существенно не влияет на изменение численности бактериопланктона (Burkholder et. al., 2007; Hess-Nilsen et. al, 2001). Хотя в литературе есть информация, что концентрация бактерий в БВ за 15-дневный период может снижаться более чем в 2 раза (Drake et. al., 2003).

Нами обнаружено, что за время хранения балласта снизилось морфологическое разнообразие микроорганизмов. В культуру было выделено из 1-ой пробы (1.09.2007) 28 морфологически отличающихся штаммов. Во 2-ой пробе (13 дней хранения БВ) отмечено только 12 морфологически отличающихся колоний. На значительное снижение разнообразия бактерий при хранении БВ указывают также исследования Дрейка с соавторами (Drake et. al., 2003).

В целом в пробах БВ из п. Саката (Япония) доминировали грам-отрицательные подвижные палочковидные бактерии с окислительным типом метаболизма (Таблица 2). Для сравнения, среди штаммов, выделяемых из б. Золотой Рог, также преобладают палочковидные грам-отрицательные формы бактерий, но с ферментативным типом метаболизма (до 65% от общего количества), что связывают со значительным загрязнением канализационными стоками и недостаточной насыщенностью вод бухты кислородом (Калитина и др., 2006).

Таблица 2.

Некоторые морфологические и физиолого-биохимические особенности штаммов, выделенных в коллекцию из балластной воды судна «Timber Star».

Результаты бактериологического анализа проб воды, отобранных из балластных танков танкера «Минотавр» в течение октября-декабря 2007 г., показали, что средняя численность КОЕ гетеротрофных бактерий изменялась в диапазоне 2,5· 103−4,1·104 кл/мл (Таблица 3), что характеризует образцы как умеренно-загрязненные или загрязненные (Гидрохимические показатели…, 2007). Эти показатели соответствуют, а в ноябре-декабре даже превышают среднее содержание колониеобразующих гетеротрофных бактерий в водах Амурского залива. Для сравнения численность гетеротрофных КОЕ на станции мониторинга в р-не Первой речки, где танкер осуществляет сброс БВ, варьировала в диапазоне 1,8· 104−9,2·102 кл/мл в период октябрь-ноябрь 2007 г.

Таблица 3.

Численность КОЕ гетеротрофных бактерий.

в пробах воды и осадков из балластных танков танкера «Minotaur».

Примечание: * - количество КОЕ микроорганизмов определено в 1 см³ осадков Таким, образом, микробиологический анализ проб воды, проведенный с использованием чашечного метода Коха показал, что количество КОЕ гетеротрофных бактерий в БВ судов, прибывших из портов Японии и Китая в сентябре-декабре 2007 г., характеризует эти воды как умеренно-загрязненные или загрязненные. В большинстве случаев не было значимой разницы в численности КОЕ между морской водой в месте сброса балласта и пробами балластной воды. В осадках балластных танков численность КОЕ на 2 порядка выше, чем в воде. Очевидно, что для детальной оценки опасности транспортируемого балласта требуется параллельное использование методики прямого подсчета микроорганизмов с использованием эпифлуоресцентного окрашивания реактивом DAPI (2,4,6-диамидино-, 2- фенилиндол), анализа структуры сообществ с использованием спектра утилизируемых углеводородных субстратов (метод BIOLOG) и оценки факторов патогенности у изолируемых штаммов. В ходе исследований была также отработана методика отбора и анализа образцов из балластных танков судов.

ВЫВОДЫ.

1. Существуют различные методы оценки численности и состава микробных сообществ. Одним из основных методов остается чашечный метод Коха. Прямой подсчет микроорганизмов проводится с использованием эпифлуоресцентного окрашивания.

2. Литературные данные показали, что объемы переноса бактерий и степень их выживаемости в новой среде могут быть значительными. Ежегодно может выживать до 1018−1019 клеток бактерий, перенесенных с балластом. Для микроорганизмов характерна уникальная способность адаптироваться в новых условиях, переходить от условно-патогенных к патогенным.

3. Микроорганизмы способны не только сохранять патогенные свойства в новых условиях, но и изменять их. Патогены могут «приобретать» новые гены резистентности.

4. Пробы БВ лесовоза «Timber Star», отобранные в п. Саката (Япония), характеризуют воды как умеренно-загрязненные. Доминанты — грамм-отрицательные подвижные палочковидные бактерии с окислительным типом метаболизма.

Бактериологический анализ проб воды танкера «Минотавр», охарактеризовал образцы как умеренно-загрязненные или загрязненные.

В большинстве случаев не было значимой разницы в численности КОЕ между морской водой в месте сброса балласта и пробами балластной воды.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Гидрохимические показатели состояния окружающей среды / Под ред. Т. В. Гусевой. — М.: Форум: ИНФРА-М. 2007. — 192 с.

2. Заварзин Г. А., Колотилова Н. Н.

Введение

в природоведческую микробиологию: Учебное пособие. — М.: Книжный дом «Университет», 2001. — С. 71 — 73.

3. Калитина Е. Г., Безвербная И. П., Бузолева Л. С. Динамика численности гидролитически-активной микрофлоры в условиях комплексного загрязнения бухты Золотой Рог // Электронный журнал «Исследовано в России». 2006. № 6. C. 56−66. http://zhurnal.apl.relam.ru/articles/2006/006.pdf.

4. Международная Конвенция о контроле судовых балластных вод и осадков и управлении ими 2004 года. Правило D-2.

5. Методы общей бактериологии. Т.1 / Под ред. Ф. Герхардта и др. ;

М.: Мир, 1983. — 536 с.

6. Нетрусов А. Н. Практикум по микробиологии: Учебное пособие для студ. высш. учеб. заведений / А. Н. Нетрусов, М. А. Егорова, Л. М. Захарчук и др.; Под редакцией А. Н. Нетрусова. — М.: Издательский центр «Академия», 2005. — С. 101 — 155.

7. Нетрусов А. Н. Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов / А. Н. Нетрусов, Е. А. Бонч — Осмоловская, В. М. Горленко и др.; Под ред. А. И. Нетрусова. — М.: Издательский центр «Академия», 2004. — С. 65 — 71.

8. Burkholder, J.M., Hallegraeff, G.M., Melia, G., Cohen, A. et. al. Phytoplankton and bacterial assemblages in ballast water of U.S. military ships as a function of port of origin, voyage time, and ocean exchange practices // 2007. Harmful Algae. Vol. 6. Is. 4. P. 486−518.

9. Dobbs F.C., Diallo A.A., Doblin M.A., Drake L.A. et. al. Pathogens in Ships' Ballast Water and Sediment Residuals // Proceedings of the Third International Conference on Marine Bioinvasions. La Jolla. California. March 16−19. 2003. P. 29.

10. Drake L.A., Baier R.E., Dobbs F.C., Doblin M.A. et al. Potential Invasion of Microorganisms and Pathogens Via `Interior Hull Fouling': Biofilms Inside Ballast-Water Tanks // Proceedings of the Third International Conference on Marine Bioinvasions. La Jolla. California. March 16−19. 2003. P. 35.

11. Drake, L.A., Doblin, M.A., Dobbs, F.C. Potential microbial bioinvasions via ships' ballast water, sediment, and biofilm // Marine Pollution Bulletin. Vol. 55. Is. 7−9. 2007. P. 333−341.

12. Hess-Nilsen O.K., Jelmert A., Enger I. Effects on the Microbial Community from Ballast Water Discharge at the Norwegian West Coast, Austevoll Aquaculture Research Station // Proceedings of the Second International Conference on Marine Bioinvasions. New Orleans. La. April 9−11. 2001. P. 69−70.

13. Ivanov, V. Bacteriological monitoring of ships' ballast water in Singapore and its potential importance for the management of coastal ecosystems / /WIT Transactions on Biomedicine and Health. 2006. Vol. 10. P. 59−63.

14. Knight I. T., Wells C. S., Wiggins B., Russell H. et al. Detection and enumeration of fecal indicators and pathogens in the ballast water of transoceanic cargo vessels entering the Great Lakes // Proceedings of the General Meeting of the ASM. Chicago. IL. 1999. P. 546.

15. Manual of environmental microbiology / ed. Christon J. Hurst. Washington: ASM Press, 2002. P. 35−167.

16. McCarthy, S.A., Khambaty, F.M. International dissemination of epidemic Vibrio cholerae by cargo ship ballast and other nonpotable waters // Applied and Environmental Microbiology. Vol. 60, Is. 7, 1994. P. 2597−2601.

17. Thomson, F.K., Heinemann S.A., Dobbs F.C. Patterns of Antibiotic Resistance in Cholera Bacteria Isolated From Ships' Ballast Water // Proceedings of the Third International Conference on Marine Bioinvasions. La Jolla. California. March 16−19. 2003. P. 118.

18. Whitby G., Elliot I., Lewis P., Shafer M., Christopher J. A Microbiological chemical and physical survey of ballast water on ships on the Great Lakes 1998 // Abstracts from the 8-th International Zebra Mussel and Other Nuisance Species Conference. Sacramento. California. March 16−19. 1998. P. 14.

19. Youchimizu M., Kimura T. Study of intestinal microflora of Salmonids // Fish. Pathol. 1976. V. 10. № 2. P. 243.