Патогенетические механизмы взаимодействия липополисахаридов бактерий с моноцитами и лимфоцитами крови человека in vitro

Актуальность темы

Во второй половине XX столетия несколько раз происходило изменение видового состава условно-патогенной микрофлоры, вызывающей гнойно-воспалительные заболевания [4]. Так, если в 1940;50-х гг. из гнойных очагов выделяли преимущественно стрептококки и кишечную палочку, то в последующие годы установлено преобладание стафилококков, удельный вес которых в этиологической структуре гнойно-воспалительных заболеваний возрос до 60−90% [118]. С 1980;90-х гг. ведущее значение приобрели грамотрицательные бактерии [111, 114]. Существенно увеличился удельный вес гнойно-воспалительных инфекций, обусловленных неспоровыми анаэробными условно-патогенными микроорганизмами: пептококками, пептострептококками, фузобактериями, бактероидами, превотеллами, дихе-лобактерами и др. [25, 121, 128]. Эти этиологические агенты, выделенные из очагов, как правило, ассоциируют с аэробными — синегнойной и кишечной палочками, протеем и другими, а также со спороносными бактериями — кло-стридиями и т. п.

В формировании защитно-приспособительных, компенсаторных и адаптационных реакций организма существенную роль играет система моно-нуклеарных фагоцитов благодаря неспецифическому фагоцитозу, способности разрушать некоторые белки, обезвреживать чужеродные молекулы и клетки, образовывать макромолекулы, которые специфически реагируют с чужеродными веществами [62, 84]. В связи с этим понятен закономерный интерес ряда исследователей к изучению фагоцитоза макрофагов крови при различных патологических процессах, вызванных условно-патогенной микрофлорой [85, 92]. Результаты данных исследований свидетельствуют, что наблюдается снижение показателей завершённости фагоцитоза, снижение' бактерицидности сыворотки крови и тканевой жидкости, снижение резистентности организма на всех этапах развития гнойно-воспалительных заболеваний. На первых порах иммунные нарушения создают благоприятные условия для адаптации и размножения возбудителей, в дальнейшем же способствуют распространению очагов поражения и хроническому течению процесса [5, 47, 84].

В фагоцитозе участвуют, в основном, 2 группы клеток: гранулоциты и моноциты (макрофаги) [80, 91]. Роль макрофагов состоит в распознавании, фагоцитозе, процессинге и длительной презентации детерминант этиологических агентов инфекционных заболеваний [90]. Одновременно с антигенной презентацией происходит синтез цитокинов, в частности, интерлейкина-1 (ИЛ-1). Цитокины в высоких концентрациях при выходе в кровь обеспечивают сигнальные функции, связанные с формированием генерализованной воспалительной реакции [103].

Экологические катастрофы последних лет привели к существенному снижению резистентности организма людей, что, естественно, повлекло за собой изменение сформированных микроценозов различных полостей организма человека [49, 71, 72, 85]. На фоне этих процессов генетически детерминированные свойства патогенности и вирулентности условно-патогенной микрофлоры получили своё- фенотипическое развитие в направлении их усиления. В частности, вирулентные микроорганизмы в ходе своего эволюционного развития выработали специальную систему приспособлений, направленную на модулирование фагоцитарной активности организма [106]. Одним из этих факторов является липополисахарид (ЛПС), входящий в состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий [7].

ЛПС (компонент эндотоксина) грамотрицательных условно-патогенных и строго патогенных бактерий выполняет две важные функции: определяет антигенную специфичность и является главным фактором патогенности [19, 29]. Открытие ЛПС и дальнейшее изучение его структурных и биологических свойств показало, что он вызывает иммунные реакции, в том числе поликлональную активацию иммунной системы, способен стимулировать или угнетать ответ на конкретные антигены, индуцировать поликлональную иммунную толерантность и т. п. [73]. В отношении иммунорегуля-торных В-лимфоцитов выявлена способность ЛПС вызывать in vivo и in vitro образование В-супрессоров, активность которых можно изучать в модельных опытах in vitro [102]. ЛПС способствует выделению моноцитами цитостати-ческого фактора белковой природы — фактора некроза опухоли (ФНО), который стимулирует секрецию ИЛ-1, -6, -8, лейкотриенов, тромбоксана, активность макрофаговимеет слабое влияние на Т-лимфоцитыспособствует усилению фагоцитарной активности нейтрофилов, активизирует общий коагуля-ционный потенциал крови, усиливает микроциркуляторные нарушения, обладает противоопухолевой активностью [20, 131]. Рецепторы к ЛПС есть на плазматических мембранах макрофагов, моноцитов, нейтрофилов и эндоте-лиоцитов. В эксперименте in vitro было показано, что в ответ на введение ЛПС на поверхности моноцитов через 30 минут появляется связанный с мембраной ФНО-а, через 90 минут — ИЛ-113, позднее — ИЛ-6 и другие цитокиныпозднее эти цитокины покидают поверхность фагоцитов и появляются в крови [110]. ЛПС стимулирует гуморальный ответ мышей на тимусзависимый и тимуснезависимый антигены и модулирует клеточный иммунитет, снижая интенсивность гиперчувствителыюсти замедленного типа к эритроцитам барана, влияет на функциональную активность макрофагов [23]. При этом эффекты ЛПС характеризуются дозозависимостыо: небольшие дозы стимулируют интенсивность фагоцитоза по отношению к разным бактериям, большие — снижают фагоцитарную активность и действуют цитотоксически. ЛПС, появляясь в организме, может влиять на чувствительные клетки-мишени (Т-, В-лимфоциты, макрофаги), включая мембраномолекулярные механизмы активации [1].

На сегодняшний день выделяют ряд структурных компонентов бактериальной клетки, способных непосредственно вызывать образование провос-палительных цитокинов (интерлейкинов, фактора некроза опухоли) [45, 127]. Прежде всего, это ЛПС, запускающий продукцию ИЛ-ф, -6, -8, -10, ФНО-а, интерферона, простагландинов, лейкотриенов, фактора активации тромбоцитов и др. [10, 27, 94, 102, 124]. Доказано, что продукция цитокинов, как основных провоспалительных медиаторов, индуцируется в макроорганизме грамотрицательными и грамположительными бактериями, и предопределяетбольшую" воспалительную природу бактериальных инфекций. У всех гра-мотрицательных бактерий отмечается значительный разброс по способности индуцировать образование цитокинов (в частности, ФИО): от 0,01 нг/мл у некоторых микроорганизмов до более 100 нг/мл — у других [30].

Несмотря на сходство структуры, ЛПС различных видов бактерий отличаются по определённым признакам. Вирулентность условно-патогенных анаэробных бактерий Bacteroides fragilis и Prevotella melaninogenicus зависит от ЛПС, который, в отличие от ЛПС аэробных грамотрицательных бактерий, не содержит гептозы и 2-кето-З-дезоксиктаната, но может содержать атипичный липид, А [16]. Кроме отличий в химическом составе ЛПС бактероидов и других грамотрицательных бактерий, есть отличия и в их биологических свойствах [9]. Введенный кролику 1 мг ЛПС В. fragilis не приводит к развитию феномена Шварцмана (псевдоаллергии), тогда как 3 мг ЛПС некоторых видов сальмонелл могут вызывать данный феномен [16]. Есть данные о том, что растворимый ЛПС, не угнетающий гиперчувствителыюсть замедленного типа самостоятельно, вероятно, может наделять иммуносупрессивными свойствами живые бактерии [9]. По-видимому, инвазивность этиологического агента и иммуносупрессивное действие ЛПС связано с генами плазмиды инвазивности. Выявление этого гена у шигелл позволило сделать предположение о наличии такой активности у многих грамотрицательных микроорганизмов [97].

Антигенная стимуляция иммунокомпетентных клеток, осуществлённая при дефиците факторов, обеспечивающих пролиферацию, может привести к запрограммированной гибели активированной иммунокомпетентной клетки, одним из механизмов которой является апоптоз [63, 64, 68, 75, 96, 138]. Апоптоз — это физиологическая, активная, программированная гибель клеток, информация о которой закодирована в клеточном геноме и поддаётся регуляции. Нарушение процесса программированной клеточной гибели в сторону усиления или ослабления играет существенную роль в патогенезе иммунопатологических процессов у человека, в том числе вторичных иммуно-дефицитов, аутоиммунных и онкологических заболеваний, хронических воспалительных процессов, вирусных и других инфекций [53]. Доказано, что в патогенезе иммунопатологических реакций, обусловленных суперантигенами, существенное значение имеет гибель лимфоцитов и фагоцитов в результате апоптоза. Иммуноциты (Т-лимфоциты, макрофаги и нейтрофилы) экс-прессируют рецепторы Fas (Fas R/ Аро CD95), содержащие «домен смерти», транслирующий апоптозный сигнал на внутриклеточный аппарат апоптоза. Такие клетки могут подавать «сигналы опасности» другим клеткам. В клеточных культурах на апоптоз влияют (усиливают или ослабляют) вирусы, бактерии (и их структурные компоненты), грибы, простейшие [22, 25, 46, 67, 79, 143]. С этими данными связаны новые взгляды в представлениях о молекулярных механизмах инфекционной патологии.

В доступной литературе нами не были найдены данные о комплексном изучении дозозависимого и видоспецифического влияния структурного компонента условно-патогенных грамотрицательных бактерий — ЛПС — на секреторную активность его главных мишеней — моноцитов (продукция ИЛ-ip, -6, ФНО-а) и Т-хелперов первого типа (продукция ИЛ-2) — фагоцитарную активность моноцитов, влиянии ЛПС на апоптоз моноцитов и лимфоцитов.

Связь работы с научными программами, темами. Диссертация является фрагментом плановой научной работы кафедры патологической физиологии Луганского государственного медицинского университета «Воспаление как результат действия бактерий» (номер государственной регистрации 0198U005713). Автор является исполнителем комплексной темы.

Цель исследовании: Изучить влияние липополисахаридов грамотрицательных бактерий — этиологических агентов хронического пародонтита на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека.

Для достижения цели были определены следующие задачи:

1. Исследовать in vitro продукцию моноцитами крови человека интерлейки-нов-ip, -6 и фактора некроза опухоли-а под влиянием липополисахаридов грамотрицательных бактерий.

2. Изучить секрецию интерлейкина-2 Т-хелперами первого типа под влиянием липополисахаридов грамотрицательных бактерий.

3. Определить фагоцитарную активность моноцитов крови человека под влияниехМ липополисахаридов грамотрицательных бактерий.

4. Изучить влияние липополисахаридов грамотрицательных бактерий на апоптоз моноцитов и лимфоцитов крови человека.

Научная новизна полученных результатов. Впервые установлено дозозависимое и видоспецифическое влияние липополисахаридов грамотрицательных бактерий на цитокинпродуцирующую способность моноцитов и лимфоцитов крови человека, на фагоцитарную активность и апоптоз моноцитов, апоптоз Ти В-лимфоцитов. Показано, что по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов грамотрицательных бактерий происходит прогрессивное увеличение продукции интерлейкинов-ip, -2, -6, фактора некроза опухоли-аусиление апоптоза моноцитов, Ти В-лимфоцитов, угнетение фагоцитоза моноцитов. Более значительно влияли на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека in vitro липополисахариды факультативно анаэробных бактерий — Escherichia fergusonii, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, менее значительно — липополисахариды строго анаэробных бактерий — B. fragilis, P. melaninogenicits, Fusobacterium necroforum.

Практическое значение полученных результатов. Определены теоретические подходы к трактовке патогенеза хронических пародонтитов, вызванных грамотрицательными условно-патогенными бактериями, на основе изучения биологической активности их липополисахаридов в отношении моноцитов и некоторых субпопуляций лимфоцитов крови человека. Полученные данные используются в лекционном курсе и при проведении практических занятий на кафедрах патологической физиологии и микробиологии Луганского государственного медицинского университета, что подтверждено соответствующими актами внедрения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Липополисахариды грамотрицательных условно-патогенных бактерий родов Escherichia, Proteus, Psendomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium in vitro дозозависимо и видоспецифически стимулируют секреторную функцию моноцитов и Т-хелперов первого типа крови человека, а также фагоцитарную активность моноцитов. Под влиянием липо-полисахаридов повышается продукция моноцитами интерлейкинов-1(3 иб, фактора некроза опухоли-а и продукция интерлейкина-2 Т-хелперами первого типа.

2. Липополисахариды грамотрицательных условно-патогенных бактерий in vitro стимулируют апоптоз моноцитов, Ти В-лимфоцитов, что проявляется экспрессией на данных клетках маркера готовности клеток к реализации апоптозной программы CD95. Апоптозстимулирующая способность липополисахаридов возрастает по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов и является ви-доспецифическим признаком.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на заседаниях Луганских областных обществ патофизиологов и микробиологов в 2003;2004 гг.

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 4 научных работах.

выводы.

1. Липополисахариды грамотрицательных условно-патогенных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium являются биологически активными веществами, которые влияют на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека в условиях in vitro.

2. Липополисахариды грамотрицательных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium в условиях in vitro стимулируют секреторную функцию моноцитов и Т-хелперов первого типа крови человека. Под влиянием липополисахаридов повышается продукция моноцитами интерлейкиновip и -6, фактора некроза опухоли-ос и продукция интерлейкина-2 Т-хелперами первого типа. Цитокинстимулирующая активность липополисахаридов является дозоза-висимой и видоспецифической. Продукция указанных цитокинов прогрессивно возрастает по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов. Наибольшей цитокинстиму-лирующей активностью обладают липополисахариды Е. fergusonii, Р. aeruginosa, Н. influenzae, наименьшей — липополисахариды В. fragilis, Р. melaninogenicus, F. necroforum.

3. Липополисахариды грамотрицательных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium влияют на фагоцитарную активность моноцитов в условиях in vitro. Небольшие дозы липополисахаридов (10 мкг/мл) стимулируют фагоцитоз моноцитов, большие дозы (50−100 мкг/мл) — угнетают его тем сильнее, чем выше действующая доза липополисахаридов. Наибольшим иммуно-супрессивным потенциалом обладают липополисахариды Е. fergusonii, Р. aeruginosa, Н. influenzae, наименьшим — липополисахариды В. fragilis, Р. melaninogenicus, F. necroforum.

4. Липополисахариды грамотрицательных бактерий родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium в условиях in vitro стимулируют апоптоз моноцитов, Tи В-лимфоцитов, — что проявляется экспрессией на данных клетках маркера апоптоза CD95. Способность липополисахаридов грамотрицательных бактерий усиливать экспрессию молекул CD95 на поверхности иммунокомпетентных клеток возрастает по мере увеличения действующей на моноциты и лимфоциты концентрации липополисахаридов, и более выражена у представителей родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophylus, чем у представителей родов Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Исследовательская работа, результаты которой обобщены в данной диссертации, ставила целью изучение влияния липополисахаридов грамотрицательных условно-патогенных бактерий видов Е. fergusonii, P. vulgaris, Р. aeruginosa, Н. influenzae, В. fragilis, P. melaninogenicus и F. necroforumэтиологических агентов хронического пародонтита на функциональную активность моноцитов и лимфоцитов крови человека, а также на экспрессию на I их поверхности молекул CD95.

Объектом исследования были 120 культур моноцитов и 110 культур лимфоцитов периферической крови практически здоровых доноров. Популяции моноцитов и лимфоцитов периферической крови человека получали с помощью центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографин.

ЛПС грамотрицательных бактерий получали из культур микроорганизмов родов Escherichia, Proteus, Pseudomonas, Haemophilus, Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium, выделенных от 120 больных хроническими пароI донтитами.

ЛПС грамотрицательных бактерий является их главным фактором па-тогенности — это структурный компонент эндотоксина [57]. Открытие ЛПС и дальнейшее изучение его структурных и биологических свойств показало, что он вызывает ряд иммунных реакций [83]: образование in vivo и in vitro В-суирессоров, выделение из моноцитов цитостатического фактора белковой природы, обладающего противоопухолевой активностью [127]. Рецепторы для ЛПС есть на мембранах макрофагов, моноцитов, нейтрофилов и эндоте-лиоцитов.

ЛПС запускает продукцию ИЛ-1, -6, -8, -10, ФНО-а, гамма-интерферона, простагландинов, лейкотриенов, фактора активации тромбоцитов и др. [60, 105, 110, 116]. Доказано, что цитокины, как основные медиаторы, индуцируются грамотрицательными бактериями, и предопределяют большую" воспалительную природу бактериальных инфекций. У всех грамотрицательных бактерий отмечается значительный разброс по способности индуцировать образование цитокинов (в частности, ФНО): от 0,01 нг/мл у некоторых микроорганизмов до больше чем 100 нг/мл — у других.

Определение RJI-ip, -2, -6 и ФНО-а проводили в супернатантах моноцитов и лимфоцитов в концентрации 10б/мл с помощью коммерческих наборов. Проведенное нами исследование показало, что ЛПС грамотрицательных бактерий являются биологически активными веществами, способными стимулировать продукцию ИЛ-ip, -6 и ФНО-а моноцитами и ИЛ-2 — Т-хелперами первого типа крови человека. Продукция цитокинов под влиянием ЛПС грамотрицательных бактерий прогрессивно возрастает по мере увеличения действующей дозы бактериальных ЛПС (10, 50 и 100 мкг/мл). Наиболее активными стимуляторами синтеза цитокинов являются ЛПС Е. fergusonii, наименее активными — ЛПС грамотрицательных бактерий (в частности, F. necroforum).

Проведенные нами исследования позволили установить, что ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий видов Е. fergusonii, Р. vulgaris, P. aeruginosa, Н. influenzae, В. fragilis, P. melaninogenicus и F. necroforum заметно влияли на фагоцитарную активность моноцитов, при этом выявленное влияние зависело как от действующей концентрации ЛПС, так и от его видовой принадлежности. Низкие дозы ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий усиливали фагоцитарную активность моноцитов, напротив, высокие дозы ЛПС угнетали её-. Наиболее глубокие изменения фагоцитоза наблюдали при действии на иммуноциты ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий в действующей концентрации 100 мкг/мл. В видовом отношении наиболее активными из изученных оказались ЛПС Е. fergusonii. Контакт моноцитов с данным ЛПС в дозе 100 мкг/мл вызывал наибольшее угнетение фагоцитарной активности. Наименее активно на фагоцитоз влияли in vitro ЛПС представителей родов Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium.

Антигенная стимуляция иммунокомпетентных клеток, осуществленная при дефиците факторов, обеспечивающих пролиферацию, может привести к запрограммированной гибели активированной иммунокомпетентной клетки, то есть к феномену, который получил название апоптоз [56, 64, 120]. Имму-ноциты, которые подпали под отрицательную активацию, экспрессируют рецептор Fas и его лиганд Fas, и преждевременно гибнут. Процесс апоптоза реализуется после соединения Fas-антигена с его лигандом Fas. Такие клетки могут подавать «сигналы опасности» другим клеткам. В клеточных культурах апоптоз могут усиливать или ослаблять вирусы, бактерии (в том числе их структурные компоненты и продукты жизнедеятельности), грибы, простейшие. С этим связаны новые взгляды в представлениях о молекулярных механизмах инфекционной патологии [25, 46, 63, 112].

Изучение потенциальной апоптогенной активности ЛПС условно-патогенных бактерий в отношении лимфоцитов и моноцитов проводили морфологическим методом. Экспрессию молекул CD95 на поверхности моноцитов, Т-лимфоцитов, Т-хелперов и В-лимфоцитов изучали методом непрямой иммунной флюоресценции. В результате проведенных нами исследований установлено, что ЛПС Е. fergusonii, P. vulgaris, P. aeruginosa, Н. influenzae, В. fragilis, P. melaninogenicus и F. necroforum, которые являются наиболее частыми этиологическими агентами хронических пародонтитов у человека, обладали способностью стимулировать экспрессию молекул CD95 на поверхности моноцитов, Ти В-лимфоцитов периферической крови в условиях in vitro. Количество моноцитов и лимфоцитов с маркерами CD95 увеличивалось по мере возрастания действующей концентрации ЛПС и было наибольшим у факультативно анаэробных условно-патогенных бактерий по сравнению с облигатно анаэробными, относящимися к родам Bacteroides, Prevotella и Fusobacterium. Среди лимфоцитов наиболее чувствительными к влиянию ЛПС бактерий оказались В-лимфоциты, а среди Т-клеток — Т-хелперы первого типа.

Проведенный нами анализ таблиц сопряжённости позволил подтвердить полученный экспериментальный результат — экспрессия молекул CD95 на поверхности моноцитов и лимфоцитов активировалась с повышением действующей концентрации ЛПС грамотрицательных условно-патогенных бактерий — этиологических агентов хронических пародонтитов для Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов, а для моноцитов и Т-хелперов выраженность экспрессии была дозонезависимым параметром.