За последние годы в России резко возрос ассортимент и спрос на многие цветочные и декоративные культуры. Реальная возможность обогатить рынок — воспользоваться достижениями и знаниями в области биотехнологии растений.
Одним из направлений биотехнологии растений является разработка и внедрение технологий клонального микроразмножения в производствополучение в условиях in vitro (в пробирке), неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т. е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растению. Этот метод имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения: 1) получение генетически однородного материала- 2) освобождение растений от вирусов и грибных болезней, а также от паразитических организмов- 3) высокий коэффициент размножения (105−107 ед. — для травянистых, цветочных растений, 104−105 ед. -для кустарниковых древесных, 104 ед. — для хвойных в год) — 4) сокращение продолжительности селекционного периода- 5) ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной фазе развития- 6) размножение медленно растущих и плохо размножаемых традиционными способами растения- 7) возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания маточного посадочного материала.
Микроклональное размножение необходимо применять в случаях, когда: 1) не все виды, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (в основном древесные) — 2) практически невозможно с помощью черенкования размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10−15 лет- 3) не всегда удается получать стандартный посадочный материал (накопление и передачи инфекций, приводящих к гибели растений, наличие химерности и т. д.) — 4) трудоемкость и сложность операций при размножении взрослых растений с помощью прививок- 5) неэффективность разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года- 6) высокий спрос на посадочный материал- 7) недостаточное количество исходного материала для массового размножения (дорогостоящие, плохо зимующие растения) — 8) необходимость проведения селекционных работ- 9) сохранение и размножение исчезающих в природе видов- 10) омоложение материала (реювенилизация).
В настоящее время такие страны как Голландия, Дания, Бельгия, Польша, США и др. широко применяют данный метод для размножения декоративных, цветочных, кустарниковых и других видов растений. Ы.
Актуальность темы
.
В связи с возрастающим интересом и спросом в России на новые растения и развитием внутреннего и внешнего озеленения строений, а также необходимостью сокращения импорта посадочного материала низкого качества становится актуальной проблема массового размножения однолетних и многолетних декоративно-цветочных культур. Наличие инфекционного фона у посадочного материала сказывается не только на качестве цветения, внешнем виде и продолжительности жизни растений, но и на заражение окружающей среды опасными патогенами, что оказывает отрицательное влияние на экологию данного участка.
Эта проблема может быть успешно решена методом клонального микроразмножения, который используется не только в коммерческих целях, но и для выявления общих закономерностей морфогенеза растений, их особенностей и проявления в условиях iv vitro.
Декоративно-цветочные культуры относятся к различным, как правило, отдаленным друг от друга ботаническим таксонам, значительно отличающихся уровнем тотипотентности клеток и регенерационным потенциалом, что вызывает необходимость дифференцированного подхода к применению и совершенствованию технологий клонального микроразмножения. При оптимизации таких технологий массового производства растений важно обеспечить их экономическую эффективность за счет снижения затрат на химические реактивы, удешевления питательных сред и повышения адаптационной способности пробирочных растений к условиям in vivo при увеличении выхода и качества конечной продукции.
В настоящее время такие страны как Голландия, Дания, Бельгия, Польша, США и др. широко применяют данный метод для размножения декоративных, цветочных, кустарниковых и других видов растений. Однако сведения в литературе по вопросу клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур противоречивы или технологии приведены не полностью. В связи с этим изучаемая проблема является актуальной и практически значимой.
Цель и задачи исследований.
Целью данной работы было разработать новые, усовершенствовать существующие и предложить универсальные технологии клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур в условиях in vitro.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
— разработать методику введения в культуру in vitro различных типов эксплантов и изучить зависимость прямой регенерации от типа первичного экспланта;
— изучить рост и развитие пробирочных растений на разных этапах клонального микроразмножения;
— подобрать оптимальные питательные среды и условия культивирования эксплантов на разных этапах клонального микроразмноженияизучить факторы гормональной и негормональной природы, влияющие на процессы ризогенеза;
— апробировать альтернативные питательные среды для замены среды Мурасиге-Скуга для хризантем и сенполий;
— разработать эффективные способы адаптации пробирочных растений к почвенным условиям;
— провести сравнительную экономическую оценку применения вегетативного и клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур.
Научная новизна.
Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro групп декоративно-цветочных культур: луковичных (гиацинт, лилия, рябчик), побеговых (хризантема, бальзамин) и листовых (сенполия, петуния, бегония) — разработана универсальная технология клонального микроразмножения на основе прямой регенерации растений из первичного экспланта, обеспечивающая сохранение морфофизиологических и хозяйственно-ценных признаков растений-доноров.
Впервые на исследуемых сортах хризантемы и гиацинта показана возможность их размножения в культуре in vitro с использованием в качестве первичного экспланта листовых пластинок. Эта технология позволяет многократно увеличить коэффициент размножения и сохранить целостность маточных растений.
Впервые для хризантем и сенполий испытаны комплексные минеральные смеси питательных сред, применение которых позволяет сократить время на их приготовление и снизить стоимость в 8 раз, а также проводить консервацию растений до 6−8 месяцев без пересадки при сохранении стандартных условий культивирования.
Разработаны новые технологии клонального микроразмножения декоративно-цветочных растений, предусматривающие сокращение технологического цикла в культуре in vitro с трех этапов до двух (за счет исключения стадии укоренения на питательной среде), получать чистый посадочный материал на 1,5−2 месяца раньше и в 2−3 раза дешевле, чем при традиционной технологии.
Практическая ценность работы и реализация результатов исследований. Разработанные технологии предложены для практического применения в меристемных лабораториях (для фирм-производителей, совхозов и др. учреждений), использование которых позволит снизить затраты на производство рассады в 2−3 раза по сравнению с традиционными способами и обеспечить промышленное цветоводство элитным посадочным материалом.
Предлагаемые методики регенерации целых растений из изолированных соматических тканей могут быть применены в клеточной селекции и генной инженерии декоративно-цветочных растений на устойчивость к абиотическим и биотическим факторам окружающей среды, при выведении новых сортов и восстановлении генотипического разнообразия флоры, а также в физиологических и генетических исследованиях.
Результаты экспериментальных исследований и теоретические обобщения работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов МСХА агрономических и биологических специальностей по курсу «Сельскохозяйственная биотехнология».
Апробация работы. Научные разработки экспонировались на различных выставках с 2001 года по 2004 год и были отмечены серебряной медалью ВВЦ (2001г.), в том числе на ежегодной Международной выставке «Цветы-2002» на ВВЦ, на ежегодной Всероссийской выставке «НТТМ-2004».
Результаты исследований были доложены на 2-й Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000), на научной конференции, посвященной 160-летию со дня рождения К. А. Тимирязева (Москва, 2003) — на конференции.
Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур" (2225 марта 2004, Москва) — на различных научных кружках (на каф. генетики МСХА, в клубе любителей комнатных растений), на заседаниях кафедры с/х биотехнологии МСХА.
выводы.
1. Клональное микроразмножение растений — сложный многофакторный морфофизиологический процесс, состоящий из двух принципиально разных этапов, проходящих в разных условиях — in vitro и in vivo, базирующихся на процессах онтогенеза, морфогенеза и регенерации растений в условиях in vitro и на структурно-функциональной адаптации пробирочных растений в условиях in vivo.
2. Установлено, что реализация морфогенетического потенциала декоративно-цветочных растений зависит от генотипа, соответствующей оптимизации состава питательной среды (минеральный состав, соотношение гормонов, концентрация углеводного источника), типа первичного экспланта, его полярности и времени изоляции, а также условий культивирования.
3. Впервые для луковичных (гиацинт, лилия, рябчик), побеговых (хризантема, бальзамин) и листовых (сенполия, петуния, бегония) групп растений разработана универсальная технология клонального микроразмножения, предусматривающая прямую регенерацию растений из первичного экспланта, которая обеспечивает сохранение морфофизиологических и хозяйственно-ценных признаков растения-донора.
4. Выявлено, что морфофизиологические процессы декоративно-цветочных растений в условиях in vitro зависят от соотношения гормонов (ауксинов и цитокининов) и концентрации сахарозы в питательной среде, которые находятся в обратно — пропорциональной зависимости, и может быть выражена функцией у=1/х, где уконцентрация сахарозы, х — экспериментально определяемая зависимость ауксинов и цитокининов.
5. Показано, что для сортов с темно — окрашенными цветками и незеленолистных форм растений необходимо присутствие в питательной среде аскорбиновой кислоты (30−50 мг/л), которая повышает жизнеспособность первичных эксплантов и растений-регенерантов.
6. Экспериментально доказано, что наличие сахарозы в питательной среде на этапе микроразмножения в промежуточной концентрации между применяемой для получения прямой регенерации и ризогенеза (15 г/л — для травянистых, 30 — 40 г/л — для луковичных) позволяет адаптировать микрокультуру, минуя последний этап технологииукоренение.
7. Установлено, что применение нетрадиционных компонентов питательной среды (минеральная основа — КМК и регуляторы ростациркон) являются альтернативной заменой питательной среды Мурасиге и Скуга и цитокинина — БАП, которые позволяют сохранить высокий морфогенетический потенциал микрокультуры и получить качественный посадочный материал.
8. Разработанная технология клонального микроразмножения декоративно-цветочных растений позволяет удовлетворить спрос потребителя и получать легко адаптируемый экологически чистый посадочный материал на 1,5−2 месяца раньше и в 2−3 раза дешевле, чем при традиционной технологии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
Неиспользованные возможности производства качественного посадочного материла в России и импорт декоративно-цветочных культур, инфицированных различными патогенами заставляет нас разрабатывать и усовершенствовать технологии клонального микроразмножения. Данные технологии могут быть применены не только в коммерческих целях, но и в выявлении общих закономерностей морфогенеза растений, их биологические особенностей, которые ярче проявляются в условиях iv vitro. Поэтому вовлечение современных методов биотехнологии, в частности на этих культурах, может иметь важное значение для экономики нашей страны.
Проведенные эксперименты по технологиям клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур с использованием различных фиторегуляторов, комплексных минеральных смесей и выявлением некоторых морфогенетических закономерностей и особенностей культивирования растений показали принципиальную возможность внедрения данной работы.
Методами индивидуального отбора первичных эксплантов растений и сезона введения в культуру in vitro было показано, что эффективность данного этапа зависит от многих факторов, в том числе: типа стерилизующего агента и времени обработкивидовых и сортовых особенностей растенийтипа первичного эксплантавозраста и качества растительного материала.
Исследования показали, что для всех изучаемых культур оптимальным сезоном изоляции первичных эксплантов является период с марта по май, при котором они характеризуются высокой регенерационной способностью.
К сожалению, использование импортного материала для введения в культуру in vitro ограничено наличием внешней и внутренней инфекций.
Разработанные нами приемы снижают зараженность данного материала до 15−20%, что влияет на морфогенетический потенциал первичных и вторичных эксплантов.
В ходе работы выявлена зависимость морфогенеза от полярного расположения первичных эксплантов на питательной среде. При этом было замечено, что морфогенез может быть замедлен в 2 и более раз в зависимости от вида и сорта растений. Этот факт имеет важное значение для увеличения выхода регенерантов на первом этапе технологии.
С целью сохранения ценных экземпляров растений в качестве дополнительных первичных эксплантов в работе использовали листовые сегменты — у хризантемы, гиацинта, петунии, для которых разработанные технологии могут быть применены и в селекционных работах.
Введение
в питательную среду ауксинов в сочетании с цитокининами стимулировало образование первичных и вторичных регенерантов в 1,5 и более раз по сравнению с использованием только цитокининов. Возможно, данный эффект вызван синергизмом — эффектом взаимного усиления действия веществ. Исключение составила хризантема, для которой наличие в питательной среде цитокининов приводило к остановке ростовых процессов и образованию каллусных тканей в основании микрочеренков.
Низкая жизнеспособность выявлена у темно — окрашенных сортов луковичных, листовых химер и пестролистных форм растений. Данная реакция эксплантов, вероятно, связана с выделением в питательную среду веществ фенольной природы, которые ингибируют развитие первичных эксплантов. В качестве антиоксиданта в питательную среду была добавлена аскорбиновая кислота (АК) в концентрации 20 — 50 мг/л. При этом наблюдали, что применение АК необходимо только на средах, содержащих ИУК. В то время как при наличии НУК в питательной среде не требовалось. Возможно, этот факт связан с специфическим воздействием каждого вещества, количественным содержанием обоих гормонов в питательной среде, с быстрым разрушением ИУК по сравнению с НУК, а также консервирующим и антиоксидантным действием аскорбиновой кислоты.
Для луковичных культур на этапах первичной и вторичной регенерации и микроразмножения в ходе исследований были подобраны 2 оптимальные питательные среды: 1) 1 мг/л БАП + 1 мг/л НУК- 2) 1,5−2 мг/л БАП +0,5 мг/л ИУК+ 0,5 мг/л 2,4-Д + АК. Первую среду можно рекомендовать для получения крупных луковиц (на 20−30%), а вторую для увеличения коэффициента размножения (на 25−35%).
Вторичную регенерацию гиацинтов и лилий можно стимулировать на этиолированных участках листьев, на корневых сегментах — у рябчика, что позволяет в дальнейшем увеличивать коэффициент размножения без повреждения микролуковиц. Сформировавшиеся микролуковицы в этом случае не отличались по морфологии от луковиц, индуцируемых на сегментах микрочешуй.
Важное значение на всех этапах технологии играет температура. Установлено, что для каждой исследуемой нами культуры существовал оптимальный температурный режим, который способствовал получению максимального коэффициента размножения и быстрому росту микрорастений. При температурах ниже оптимальных наблюдали торможение морфогенетических процессов, а при повышенных — активное развитие каллуса и гибель посадочного материала при тепловом стрессе.
Оптимальные концентрации сахарозы были подобраны с целью получения максимального количества микрорастений на всех этапах технологии. Обнаружена зависимость морфогенеза от применяемых концентраций сахарозы. Установлены ее оптимальные концентрации для получения максимального количества микрорастений и формирования хорошо развитой корневой системы. Пропорциональное развитие микрокультуры исследуемых нами растений наблюдалось при использовании в питательной среде промежуточных концентраций сахарозы между концентрациями, применяемых при получении прямой регенерации на этапе введения в культуру in vitro и процессами укоренения микрорастений (рис.2).
Р0 — исходная жизнеспособность эксплантовРк — морфогенетический потенциал для каллуса.
1,1'- оптимальная концентрация сахарозы для ризогенеза.
2, 2' - оптимальная концентрация сахарозы для микроразмножения.
3, 3' - оптимальная концентрация сахарозы для прямой регенерации растений 4,4' - оптимальная концентрация сахарозы для формирования каллусной ткани — потенциал для травянистых культур — потенциал для луковичных культур
Рис. 2. Влияние различных концентраций сахарозы на морфогенез микрокультуры в условиях in vitro.
Наряду с основными результатами были получены и косвенные. Например, использование для гиацинтов циркона в концентрации 2−3 мг/л в сочетании с ИУК позволили предложить его в качестве альтернативной замены БАП, что с экономической стороны позволит снизить затраты на цитокинины в 10−15 раз. Также были получены положительные результаты по применению комплексной минеральной смеси KMC (Табл. 4.3), которая оказалась пригодной для длительного депонирования микрокультуры сенполий, а добавление аскорбиновой кислоты в высоких концентрациях в питательную среду на основе МС — для микрокультуры бегоний. Данные результаты можно использовать для создания и поддержания Банка декоративно-цветочных растений и для микроразмножения и адаптации микрокультуры по мере необходимости.
С целью получения 100%-ной приживаемости микрорастений при адаптации к почвенным условиям использовали несколько приемов. Например, побеговые культуры перед посадкой выдерживали в водных растворах ауксинов, луковичные — охлаждали, листовые — опрыскивали и т. д. Данные приемы позволяют получать максимально возможный выход растений, что важно как с коммерческой, так и с научно-исследовательской стороны (в частности, для селекции растений). При этом все исследуемые культуры имеют оптимальные параметры для успешной адаптации, а для луковичек гиацинтов, лилий, рябчиков наблюдается обратная зависимость размера луковичек от количества чешуй.
Анализируя полученные литературные данные можно объяснить наличие большого количества питательных сред с различным гормональным и углеводным составом. На наш взгляд, существует четкая зависимость морфогенетического потенциала от диапазона концентраций гормонов и Сахаров, используемых для культивирования. Эту зависимость можно представить в виде функции у= 1/х, где у — концентрация сахарозы, хэкспериментально определяемая зависимость ауксинов от цитокининов (рис.
3).
Проведенные эксперименты показали, что качество разработанной технологии микроклонального размножения растений необходимо оценивать по адаптации растений.
FuHT (fayK), y.e.
1 — этап микроразмножения- 2 — этап ризогенеза- 3 — этап адаптации растений- 4 -доращивание растений-регенерантов.
Рис. 3. Зависимость морфогенетического потенциала от диапазона концентраций гормонов и Сахаров при культивировании микрокультуры.
Экономическая справка.
Окупаемость производства зависит от реализации продукции, а также определяется политикой ценообразования производителя, которая зависит от себестоимости, государственной политики цен на товары и услуги, а также налогообложения.
Производитель стремится максимизировать получаемую им прибыль, то есть разницу между выручкой от реализации продукции и затратами на ее производство. Общая сумма прибыли от реализации продукции зависит от рентабельности производства единицы продукции и объема продаж. Поэтому на предприятии должна быть разработана соответствующая ценовая политика.
При внедрении в производство технологий клонального микроразмножения растений необходимо учитывать факторы, влияющие на ценообразование адаптируемой и неадаптируемой микрокультуры.
Нами рассчитаны цены при производстве единицы посадочного материала с учетом условий, предоставляемых МСХА, и использовании различных питательных сред (Табл. 1, 2).
