Помощь в учёбе, очень быстро...
Работаем вместе до победы

Клонирование генов полипептидных нейротоксинов яда членистоногих

Диссертация: Клонирование генов полипептидных нейротоксинов яда членистоногих
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Яд членистоногих, как правило, состоит из большого количества низкомолекулярных белковых компонентов, которые токсичны для различных классов животных, включая человека. Для отдельных токсичных компонентов, выделенных из яда членистоногих, характерна таксоспецифичность действия. Так, например, из яда скорпионов «Старого» и «Нового Света» выделены токсины, избирательно воздействующие… Читать ещё >

Содержание

  • 1. ВВЕДЕНИЕ
  • 2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТОКСИНОВ ПАУКООБРАЗНЫХ"
    • 2. 1. Введение
    • 2. 2. Анализ структуры сигнальных пептидов и 3'- нетранслируемых последовательностей кДНК, кодирующих токсины скорпионов
    • 2. 3. Анализ кодирующей последовательности кДНК
    • 2. 4. Клонирование геномной ДНК
    • 2. 5. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей токсинов скорпионов, выведенных на основе последовательности их кДНК
    • 2. 6. Семейства гомологичных токсинов из яда паукообразных
    • 2. 7. Пространственное строение токсинов пауков

Клонирование генов полипептидных нейротоксинов яда членистоногих (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Природные токсины являются ценными инструментами исследования функций биологических систем на молекулярном уровне. Особую группу составляют нейротоксины, с высокой специфичностью воздействующие на те или иные компоненты нервной системы. Их изучение оказало огромное влияние на прогресс в области нейрохимии и нейробиологии, позволило идентифицировать и охарактеризовать некоторые ионные каналы, нейрорецепторы и другие белки, участвующие в процессах нейросекреции и нейрорегуляции. Хорошими примерами этому могут служить ацетилхолиновый рецептор никотинового типа, ГАМК-активируемый С1″ -канал, потенциал зависимые Ыа± и Са2± каналы. Использование нейротоксинов позволило выявить чрезвычайное разнообразие рецепторов и каналов в нервной системе, подтвержденное в последние годы данными молекулярной биологии. Удивительная способность многих нейротоксинов специфически взаимодействовать с определенным подтипом того или иного рецептора или канала позволяет детально изучить их роль в различных процессах, происходящих в нервной системе. Многообразие клонированных подтипов рецепторов и каналов стимулирует поиск новых высокоселективных нейротоксинов. В этом поиске заметно возрастает роль современных методических возможностей молекулярной биологии [1]. Скрининг библиотек кДНК, основанный на структурной гомологии, а также различные методы на основе полимеразной цепной реакции [2] позволяют идентифицировать компоненты, присутствующие в яде или тканях организма в ничтожных количествах.

Фундаментальные проблемы современных нейрохимиии и нейробиологиине единственная область применения нейротоксинов. В последние годы резко возрос интерес к другому свойству, присущему многим нейротоксинам — видовой специфичности (таксоспецифичности) их действия и ее молекулярным основам.

Выяснение механизмов таксоспецифичности может способствовать созданию пестицидов нового поколения с высокой избирательностью действия. Интересными примерами в этой области являются работы [3, 4], в которых удалось использовать экспрессирующую систему на основе бакуловирусов для создания высокоэффективных инсектицидов. Другой областью практического использования данных о молекулярных основах действия нейротоксинов является создание новых лекарств. Детальное изучение поверхности контакта нейротоксина и его рецептора служит основой для создания расчетных молекулярных моделей этого взаимодействия, которые могут быть использованы для направленного конструирования высокоселективных лекарственных препаратов.

Среди представителей типа Членистоногие (Апкгоройа) обнаружено большое количество нейротоксинов, обладающих различными механизмами действия. Наиболее распространенными молекулярными мишенями этих токсинов являются ионные каналы. Блокирование ионных каналов или модификация их характеристик быстро приводит к параличу и гибели жертвы, чем, по-видимому, и объясняется широкое распространение токсинов данного типа. Большинство изученных нейротоксинов, действующих на ионные каналы, обладает рядом сходных принципов структурной организации и механизма действия. Как правило, это полипептиды, состоящие из 30−80 а.о., имеющие жесткую пространственную структуру, стабилизированную несколькими дисульфидными связями. Для многих из них характерны различные пост трансляционные модификации, например, отщепление С-концевого ди-(три-)пептида, амидирование С-концевой аминокислоты или образование А^-концевого остатка пироглутаминовой кислоты. Механизм действия этих токсинов обычно заключается в простом взаимодействии с областью молекулярных ворот ионного канала. Одним из наиболее известных и хорошо изученных примеров нейротоксинов этого типа является семейство пептидных токсинов из яда скорпионов, избирательно действующих на Ка±, К±, Са2± или.

СЬканалы [5 — 8]. Другим характерным примером могут служить токсины пептидной природы, выделенные из яда пауков Agelenopsis aperta — агатоксины [9] и Plectreurys tristis — плектотоксины [10, 11] - модификаторы Na± и Са2± каналов.

В состав большинства исследованных ядов членистоногих входят семейства высоко гомологичных токсин-подобных белковых молекул. Представительность в яде отдельных полипептидов из этих семейств колеблется от тысячных долей процента и редко, когда достигает 2%. На сегодняшний день нет четкого объяснения такому многообразию близких по структуре полипептидов. Некоторые из них являются токсинами, другие по своей первичной структуре похожи на токсины, но пока не удается точно установить функции этих белков. Можно предположить, что токсины членистоногих произошли от небольшого числа генов-предшественников, которые дуплицировались, и отдельные гены-дупликанты подвергались различному селективному отбору. Эта гипотеза может быть одним из вероятных объяснений огромного количества высоко гомологичных токсинов членистоногих.

Данная работа является частью комплексного исследования новых биологически активных компонентов ядов членистоногих, проводимого в ИБХ им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН в рамках структурно-функционального изучения полипептидных нейротоксинов, действующих на различные классы животных. Цель работы состояла в клонировании кДНК, кодирующих отдельных представителей и целые семейства токсин-подобных полипептидов из различных видов членистоногих.

Автор выражает признательность своему научному руководителю д.х.н., член-кор. РАН, профессору Е. В. Гришину, к.х.н. Т. М. Волковой, к.х.н. Е. Д. Носыревой, к.х.н. К. А. Плужникову, а также всему коллективу лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов за постоянную помощь, внимание, многочисленные дискуссии и ценные советы в работе. Автор также признателен к.х.н. Н. С. Быстрову за синтез олигонуклеотидных зондов.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР «МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТОКСИНОВ ПАУКООБРАЗНЫХ».

2.1 Введение.

Яд членистоногих, как правило, состоит из большого количества низкомолекулярных белковых компонентов, которые токсичны для различных классов животных, включая человека. Для отдельных токсичных компонентов, выделенных из яда членистоногих, характерна таксоспецифичность действия. Так, например, из яда скорпионов «Старого» и «Нового Света» выделены токсины, избирательно воздействующие на млекопитающих [12, 13] и на насекомых [14]. В то же время, найдены токсины, активные по отношению к обеим группам животных, а также действующие на ракообразных [15 — 17]. Кроме того, даже среди токсинов, действующих на млекопитающих, обнаружены токсины обладающие разными механизмами действия. Токсины а-типа, найденные, в основном, у скорпионов «Старого Света», связываются с тремя участками Ма±канала [18]. Связывание зависит от мембранного потенциала и приводит к замедлению инактивации канала. а-Токсины не влияют на активацию и стабилизируют канал в открытом состоянии. В отличии от них токсины Р-типа, обнаруженные у скорпионов «Нового Света», оказывают влияние на активацию, сдвигая ее в область более положительных потенциалов. Они связываются с четырьмя участками На±канала [19]. В литературе описаны также токсины у-типа, выделенные из яда скорпиона ТЫуш serru.la.tus [13], которые отличаются от токсинов (3-типа тем, что сдвигают кривую активации канала в область более отрицательных потенциалов.

Большинство инсектотоксинов можно разделить на две группы, отличающиеся по механизму действия: на возбуждающие и депрессантные инсектотоксины [14]. Возбуждающие инсектотоксины, обнаруженные в яде скорпионов [20], подобно a-токсинам, замедляют инактивацию Ка±каналов насекомых, однако их связывание с каналом не зависит от мембранного потенциала. Депрессантные инсектотоксины из яда скорпионов [21, 22] могут конкурировать с возбуждающими токсинами за места связывания с каналом, но, в отличие от последних, вызывают полную деполяризацию мембраны и блокаду передачи нервного импульса.

Такая классификация токсинов удобна, но не абсолютна. Так, токсин АаН1Т4 из яда скорпиона Androctonus anstralis Hector [15] сочетает в себе свойства токсинов [3-типа и возбуждающих инсектотоксинов. Токсин LqhaIT из яда скорпиона Leiurus quinquestriatus hebraeus [14, 16] действует на каналы млекопитающих и насекомых подобно a-токсинам, хотя его связывание не зависит от мембранного потенциала. В то же время его действие на насекомых отличается от действия и возбуждающих, и депрессантных инсектотоксинов.

В настоящее время интенсивно исследуются полипептидные токсины скорпионов, которые, благодаря своей низкой молекулярной массе и высокой стабильности структуры, являются превосходной моделью для исследования структурно — функциональных взаимодействий молекул белковой природы и уникальным инструментом для изучения механизма действия ионных каналов. Токсины скорпионов способны в пикои наномолярных концентрациях взаимодействовать с каналами и изменять их характеристики. Содержание этих токсинов в яде скорпионов может достигать нескольких процентов от общей массы белков, они являются главными биологически-активными компонентами яда. Относительно недавно были использованы современные методы молекулярной биологии для клонирования, мутагенеза и гетерологической экспрессии генов, кодирующих токсины скорпионов. Первое сообщение о клонировании генов из скорпиона Atulroclonus australis Hector (АаН) относится к 1989 году [23]. В этой работе были опубликованы четыре структуры кДНК, кодирующие токсины, действующие на млекопитающих, и три последовательности кДНК, кодирующие токсины специфичные для насекомых.

Целью данного обзора является: 1. представление информации, полученной в результате клонирования и определения нуклеотидной последовательности генов токсинов скорпионов, действующих на Ма±каналы различных видов животных;

2. рассмотрение молекулярной организации семейств высоко-гомологичных токсинов на примере полипептидов (3−8 кДа), выделенных из ядов паукообразных;

3. описание общих принципов пространственной организации токсинов паукообразных. В обзоре также описываются особенности строения сигнальных пептидов и З'-нетранслируемых областей последовательностей кДНК, кодирующих токсины скорпионов, экзон-интронная организация генов этих токсинов. Значительное внимание уделено сравнению первичных и вторичных структур зрелых токсинов скорпионов, действующих на Ма±каналы животных и имеющих различную видовую специфичность, и различающихся по механизмам функционирования, а также взаимосвязи структуры токсина с его функцией. Рассматриваются также механизмы процессинга зрелых токсинов из их предшественников. кДНК, кодирующие нейротоксины из семейства скорпионов Androclonus, Ceniruroides, Leiurus, Tityns и Buthus, действующих на Ыа±каналы различных видов животных, были клонированы и была определена их нуклеотидная последовательность. Данные по анализу последовательности кДНК, кодирующих токсины скорпионов, упомянутых выше, и данные по клонированию генов токсинов скорпионов из семейств Tityns и Androclonus дали информацию для определения структуры транскрибируемых единиц, связанных с генами токсинов этих скорпионов. Стало очевидным, что при транскрипции этих геномных регионов синтезируется пре-мРНК, состоящая, примерно, из 800 нуклеотидных остатков, содержащая единственный интрон из 470 нуклеотидов остатков, локализованный внутри региона, кодирующего сигнальный пептид. Процессинг этих пре-мРНК приводит к зрелой молекуле, состоящей, примерно, из 330 нуклеотидных остатков. Трансляция таких зрелых молекул мРНК дает белковый предшественник (препротоксин), в состав которого входят 82−89 а.о. //-Концевой сигнальный пептид токсинов скорпионов состоит из 18−21 а.о. и необходим для секреции токсина из клетки. Иногда наблюдается дополнительный этап процессинга, состоящий в удалении от одной до трёх С-концевых аминокислотных остатков. Его функциональная роль не ясна, однако можно предположить, что это еще одна сигнальная последовательность, необходимая для правильной транспортировки токсинов в клетке и пространственной организации молекул этих токсинов. В некоторых случаях карбоксильный процессинг сопровождается амидированием С-концевой аминокислоты.

5. ВЫВОДЫ.

1. Осуществлено клонирование и определены структуры кДНК, кодирующих полипептидный инсектотоксин 051−1, а также семейство из 4-х высокогомологичных токсинов яда скорпиона ОпкосЫгих ясгоЫсиЬхш1.

2. Показано, что в зависимости от ареала обитания скорпиона в его яде присутствуют различающиеся по молекулярной массе токсины.

3. Клонировано семейство из 8 экспрессирующихся генов кодирующих высокогомологичные инсектотоксины яда паука /¡-огепйпа.

4. В результате скрининга полученной библиотеки кДНК ядовитых желез каракурта клонирован структурный ген низкомолекулярного полипептида, образующего функциональный комплекс с а-латротоксином.

5. Определены аминокислотные последовательности 14 новых полипептидных токсинов, продуцируемых тремя видами паукообразных.

6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

НМБ — низкомолекулярный белковый компонент яда паука каракурта a-JIT — а-латротоксин.

АТР — аденозин-5'-трифосфат.

BSA — бычий сывороточный альбумин.

ДНК, кДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, комплементарная ДНК ДТТ — дитиотрейтол DMS — диметилсульфат.

EDTA — этилендиаминтетрауксусная кислота.

IPTG — изопропил-/Ш-тиогалактопиранозид.

РНК — рибонуклеиновая кислота.

SDS — додецилсульфат натрия трис — трис-гидроксиметиламинометан.

MALDI — масс-спектрометрия с ионизацией лазерной дисорбцией.

ПААГ — полиакриламидный гель.

TEMED — К, М,>Г, К'-тетраметилэтилендиамин.

SDS — додецилсульфат натрия.

ПЦР — полимеразная цепная реакция ед. акт. — единица активности а. о. — аминокислотный остаток п. о. — пара оснований.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Adams, M.E., Olivera, B.M. (1994). Neurotoxins: overview of an emerging research technology. Trends in Neurosci, 17, 151−155.
  2. Gurevitz, M. and Zilberberg, N. (1994). Advances in Molecular Genetics of Scorpion Neurotoxins. J. Toxicol-Toxin. Rev, 13, 65−100.
  3. Stewart, L.M.D., Hirst, M., Ferber, M.L., Merryweather, A.T., Cayley, P.J. and Possee, R.D. (1991). Construction of an improved baculovirus insecticide containing an insect-specific toxin gene. Nature, 352, 85−88.
  4. Tomalski, M.D., Miller, L.K. (1991). Insect paralysis by baculovirus-mediated expression of a mite neurotoxin gene. Nature, 352, 82−85.
  5. , W.A. (1976). Purification of a toxic protein from scorpion venom which activates the action potential Na+ ionophore. J. Biol. Chem., 251, 5528−5536.
  6. Garcia, M.L., Galvez, A., Garcia Calvo, M., King, V.F., Vazquez, J., and Kaczorowski, G.J. (1991). Use of toxins to study potassium channels. J. Bioenerg. Biomembr., 23, 615−646.
  7. Valdivia, H.H., Kirby, M.S., Lederer, W.J., and Coronado, R. (1992). Scorpion toxins targeted against the sarcoplasmic reticulum Ca2+ -release channel of skeletal and cardiac muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 12 185−12 189.
  8. Debin, J.A., Maggio, J.E., and Strichartz, G.R. (1993). Purification and characterization of chlorotoxin, a chloride channel ligand from the venom of the scorpion. Am. J. Physiol., 264, C361−9.
  9. Adams, M.E., Bindokas, V.P., and Venema, .V.J. (1992). Probing Calcium Channels with Venom Toxins. In: Neurotox'91: The Molecular Basis of Drug and Pesticide Action, edited by Duce, I.R.Elsevier, 33−44.
  10. Branton, W.D., Rudnick, M.S., Zhou, Y., Eccleston, E.D., Fields, G.B., Bowers, L, D. (1993) Fatty acylated toxin structure. Nature, 365, 496−497.
  11. Quistad, G.B., Skinner, W.S. (1994) Isolation and sequencing of insecticidal peptides from the primitive hunting spider, Plectreurys tristis (Simon). J. Biol. Chem. 269, 11 098−11 101.
  12. , G.R. (1987). Scorpion toxins as a tool to study voltage-gated sodium channels. Annu. Rev. Neurosci., 10, 237−267.
  13. Zlotkin, E., Eitan, M., Pelhate, M., Chejanovsky, N., Gurevitz, M., and Gordon, D. (1994). Insect Specific Neurotoxins from Scorpion Venom That Affect Sodium Current Inactivation. J. Toxicol-Toxin. Rev., 13, 25−43.
  14. , W.A. (1991). Structure and function of voltage-gated sodium and calcium channels. Curr. Opin. Neurobiol., 1, 5−13.
  15. , E. (1985). Neuropharmacology and Pesticide Action. M.G. Ford, G.G. Lunt, R.C. Reay, and P.N.R. Usherwood, B. Bacerril,. (VCH), 352−383.
  16. Kopeyan, C., Mansuelle, P., Sampieri, F., Brando, T., Bahraoui, E.M., Rochat, H., Granier, C. (1990). Primary structure of scorpion anti-insect toxins isolated from the venom of Leiurus quinquestriatus quinquestriatus. FEBS-Lett., 261, 423−426
  17. Zlotkin, E., Eitan, M., Bindokas, V.P., Adams, M.E., Moyer, M., Burkhart, W., and Fowler, E. (1991). Functional duality and structural uniqueness of depressant insect-selective neurotoxins. Biochemistry, 30, 4814−4821.
  18. Bougis, P. E., Rochat, H. and Smith, L. A., (1989). Precursors of Androctonus australis scorpion neurotoxins: Structures of precursors, processing outcomes, and expression of a functional recombinant toxin II", J. Biol. Chem., 264, 19 259−19 265.
  19. Becerril, B., Vazquez, A., Garcia, C., Corona, M., Bolivar, F. and Possani, L. D., (1993). Cloning and characterization of cDNAs that code for Na±channal-blocking toxins of the scorpion Centruroides noxius Hoffmann, Gene, 128, 165−171.
  20. Gurevitz, M., Urbach, D., Zlotkin, E. and Zilberberg, H., (1991). Nucleotide sequence and structure analysis of a cDNA encoding an alpha insect toxin from the scorpion Leiurus quinquestriatus hebraeus. Toxicon, 29-, 1270−1272.
  21. Xiong, Y., Ling.M., Chi, C. and Wang. D, (1995). cDNA sequence of mammal neurotoxin in Mesobuthus martensis Karsch scorpion, g887972 (U28659 MMU28659).
  22. Xiong.Y., Ling.M., Chi.C. and Wang. D,(1995). cDNA sequence of mammal neurotoxin in Mesobuthus martensis Karsch scorpion, g887974, (U28660, MMU28660).
  23. , W. A., (1988). Structure and function of voltage-sensitive ion channels. Science, 242, 50−61.
  24. Vazquez, A., Becerril, B., Martin, B. M., Zamudio, F., Bolivar, F and Possani, L. D., (1993). Primary structure determination and cloning of the cDNA encoding toxin 4 of the scorpion Centruroides noxius Hoffmann. FEBS-Lett., 320, 43−46.
  25. Zlotkin, E., Gurevitz, M. and Adams, M. E., (1993). Depressant insect selective neurotoxins from scorpion venom: chemistry, action and gene cloning. Arch. Insect Biochem., 22, 55−73.
  26. Becerril, B., Corona, M., Mejla, M. C., Martin, B. M., Lucas, S., Bolivar, F. and Possani, L. D., (1993). The genomic region encoding toxin gamma from the scorpion Tityus serrulatus contains an intron, FEBS-Lett., 335, 6−8.
  27. Delabre, M. L., Pasero, P., Marilley, M. and Bougis, P. E., (1995). Promoter Structure and Intron-Exon Organization of a Scorpion a-Toxin Gene, Biochemistry, 34, 6729−36.
  28. Meves, H., Simard, M. J., and Watt, D. D., (1984). Biochomical and electrophysiological characteristics of toxins isolated from the venom of the scorpion Centruroides sculpturatus, J. Physiol., 79, 185−191.
  29. Lima, M. E., Martin, M. F., Hue, B., Loret, E. P., Diniz, C.R. and Rochat, H., (1989). On the binding of two scorpion toxins to the central nervous system of the cockroach Periplaneta anericana,. Insect Biochem., 19, 413−417.
  30. Pelhata, M. and Zlotkin, E., (1981). Voltage-dependent slowing of the turn off of Na+ current in the cockroach giant axon induced by the scorpion venom «insect toxin», J. Physiol., 319, 30−36.
  31. Loret, E. P., Sampieri, F., Roussel, A., Granier, C. and Rochat, H., (1990). Conformational flexibility of a scorpion toxin active on mammals and insects: a circular dichroism study, Proteins, 8, 164−72.
  32. Noda, M., Ikeda, T., Kayano, T., suzuki, H., Takeshima, H., Kurasaki, M., Takahashi, H. and Shosaku, N., (1986). Existence of distinct sodium channel messenger RNAs in rat brain. Nature, 320, 188−192.
  33. Kopeyan, C., Martinez, G., Lissitzky, S., Miranda, F. and Bochat, H., (1974). Disulfide bonds of toxin II of the scorpion Aidroctonus australis Hector, Eur. J. Biochea., 47, 483−489.
  34. Fontecilla-Camps, J. C., Almassay, R. J., Suddath, F. L., Watt, D. D. and Bugg, C. E., (1980). Three dimensional structure of a protein from scorpion venom: a new structural class of neurotoxins,. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 6496−6500.
  35. Fontecilla-Camps, J. C., Harbersetzer-Rochat, C. and Rochat, H., (1988). Orthorhombic crystals and three-dimensional structure of the potent toxin II from the scorpion Aidroctonus australis Hector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7443−7447.
  36. Fonteeilla-Camps, J. C., (1989).Three-dimensional modal of the insect-directed scorpion toxin from Aidroctonus australis Hector and its implication for the evolution of scorpion toxins in general, J. Mol. Evol., 29, 63−67.
  37. Bontems, F., Roumestand, Ch., Gilquin, B., Menez, A. and Toma, F., (1991). Refined structure of charybdotoxin: Common motifs in scorpion toxins and insect defensins. Science, 254, 1521−1523.
  38. Menez, A., Bontems F., Roumestand, Ch., Gilquin, B. and Toma, F., (1992). Structural basis for functional diversity of animal toxins. Proceedings of the Royal Society of Edinburgh, 998, 83.
  39. Venema, V.J., Swiderek, K.M., Lee, T.D., Hathaway, G.M. and Adams, M.E.1992) Antagonism of synaptosomal calcium channels by subtypes of omega-agatoxins. J. Biol. Chem. 267, 2610−2615.
  40. Ertel, E.A., Warren, V.A., Adams, M.E., Griffin, P.R., Cohen, C.J. and Smith, M.M. (1994) Type III omega-agatoxins: a family of probes for similar binding sites on L- and N-type calcium channels. Biochemistry 33, 5098−5108.
  41. Omecinsky, D.O., Holub, K.E., Adams, M.E. and Reily, M.D. (1996) Three-dimensional structure analysis of mu-agatoxins: further evidence for common motifs among neurotoxins with diverse ion channel specificities. Biochemistry 35, 2836−2844.
  42. Yu, H., Rosen, M.K., Saccomanov N.A., Phillips, D., Volkmann, R.A., and Schreiber, S.L. (1993). Sequential assignment and structure determination of spider toxin omega-Aga-IVB. Biochemistry, 32, 13 123−13 129.
  43. Qu, Y., Liang, S., Ging, J., Liu, X., Zhang, R. & Gu, X. (1997) Proton nuclear magnetic resonance studies on huwentoxin-l from the venom of the spider Selenocosmia huwena: 2. Three-dimensional structure in solution, J. Protein Chem. 16, 565−574.
  44. Mintz, I.M., Venema, V.J., Swiderek, K.M., Lee, T.D., Bean, B.P., and Adams, M.E. (1992). P-type calcium channels blocked by the spider toxin omega-Aga-IVA. Nature 355, 827−829
  45. Adams, M.E., Mintz, I.M., Reily, M.D., Thanabal, V., and Bean, B.P. (1993). Structure and properties of omega-agatoxin IVB, a new antagonist of P-type calcium channels. Mol. Pharmacol. 44, 681−688.
  46. Nishio, H., Kumagaye, K.Y., Kubo, S., Chen, Y.N., Momiyama, A., Takahashi, T., Kimura, T., and Sakakibara, S. (1993). Synthesis of omega-agatoxin IVA and its related peptides. Biochem. Biophys. Res. Commun. 196, 1447−1453.
  47. Reily, M.D., Holub, K.E., Gray, W.R., Norris, T.M., Adams, M.E. (1994). Structure-activity relationships for P-type calcium channel-selective w-agatoxins. Struct.Biol. 1, 853−856.
  48. Narasimhan, L., Singh, J., Humblet, C., Guruprasad, K., Blundell, T. (1994). Snail and spider toxins share a similar tertiary structure and 'cystine motif. Struct.Biol. 1, 850−852.
  49. Pallaghy, P.K., Nielsen, K.J., Craik, D.J. & Norton, R.S. (1994) A common structural motif incorporating a cystine knot and a triple-stranded p-sheet in toxic and inhibitory polypeptides, Protein Sci. 3, 1833−1839.
  50. J., Helfman D., Smart S., Burridge K., Thomas G. (1982). 130-kd and 152-kd vinculin-like proteins. J. Biol.Chem. 257, 11 024−11 031.
  51. J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.
  52. , T.M., Дулубова, И.Е., Тележинская, И.Н., Гришин, Е.В., (1984). Токсические компоненты яда среднеазиатского скорпиона Orthochirus scrobiculosus. Биоорган, химия. 10, 1100−1108.
  53. , J. М. (1988). Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Research, 16, 9677−9686.
  54. Dover, W.J., Miller, J.f., and Ragsdale, C.W. (1988). High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research, 16, 6127−6145.
  55. , D.J. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Mol.Biol., 166, 557−580.
  56. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463−5467.
  57. Tabor, S., Richardson, C.C. (1987). DNA sequence analysis with a modified bacteriophage T7 DNA polymerase. Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 84, 4767−4771.
  58. Vargas, O., Martin, M.F. and Rochat, H. (1987). Characterization of six toxins from the venom of the Moroccan scorpion Buthus occitanus mardochei. Eur. J. Biochem., 162, 589−599.
  59. Zilberberg, N., Zlotkin, E., and Gurevitz, M. (1992). Molecular analysis of cDNA and the transcript encoding the depressant insect selective neurotoxin of the scorpion Leiurus quinquestriatus hebraeus. Insect Biochem. Mol. Biol. 22, 199−203.
  60. Sagdiev, N.Z., Valieva, L.A., Korneev, A.S., Sadykov, A.A., and Salikhov Sh.l. (1987). Toxic components of the venom of the cellar spider Segestria florentina. Bioorg.Khim. 13, 1013−1018.
  61. Newcomb, R., Palma, A., Fox, J., Gaur, S., Lau, K., Chung, D., Cong, R., Bell, J.R., Home, В., and Nadasdi, L. (1995). SNX-325, a novel calcium antagonist from the spider Segestria florentina. Biochemistry 34, 8341−8347.
  62. Skinner, W.S., Dennis, P.A., Li, J.P., Quistad, G.B. (1992). Identification of insecticidal peptides from venom of the trap-door spider, Aptostichus schlingeri {Ctenizidae). Toxicon, 30, 1043−1050.
  63. Kiyatkin, N.I., Dulubova, I.E., Chekhovskaya, I.A., and Grishin, E.V. (1990). Cloning and structure of cDNA encoding alpha-latrotoxin from black widow spider venom. FEBS Lett. 270, 127−131.
  64. Kiyatkin, N., Dulubova, I., Grishin, E. (1993). Cloning and structural analysis of alpha-latroinsectotoxin cDNA. Abundance of ankyrin-like repeats. Eur. J. Biochem. 273,121−127.
  65. Kiyatkin, N. Dulubova, I., Chekhovskaya, I., Lipkin, A., and Grishin, E. (1992). Structure of the low molecular weight protein copurified with alpha-latrotoxin. Toxicon 30, 771−774.
  66. Н.И. Кияткин, И. Е. Дулубова, T.M. Волкова, И. А. Чеховская, А. В. Липкин, Е. В. Гришин. (1992) Структурный анализ белкового компонента яда паука каракурта, взаимодействующего с а-латротоксином. ДАН, 323, 178−180.
  67. Tashmukhamedov, В., Usmanov, P., Kazakov, I. (1983). In: Toxins as Tools in Neurochemistry. В.: Walter de Gruyter and Co. 311−323.
  68. Volkova, T.M., Pluzhnikov, K.A., Woll, P.G., Grishin, E.V. (1995). Low molecular weight components from black widow spider venom. Toxicon, 33, 483−489.
  69. U., Hoffman B.J. (1983). A simple and very effective method for generating cDNA libraries. Gene 25, 263−269.
  70. Teen, T.T., Kumar, V., Lehtovaara, P., Knowles, J. (1987). Construction of cDNA libraries by blunt-end ligation: high-frequency cloning of long cDNAs from filamentous fungi. Anal.Biochem. 164, 60−67.
  71. D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557−580.
  72. Chuvpilo S.A. Kravchenko V. V (1985) A simple and rapid method for sequencing DNA. FEBS Lett., 179, 34−36.
  73. Pearson, W.R. and Lipman, D.J. (1988). Improved tools for biological sequence comparison. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 85, 2444−2448.
  74. Ducancel, F., Guignery-Frelat, G., Boulain, J.C., Menez, A. (1990). Nucleotide sequence and structure analysis of cDNAs encoding short-chain neurotoxins from venom glands of a sea snake (Aipysurus laevis). Toxicon, 28, 119−123.
  75. Meredith, J., Ring, M., Macins, A., Marschal,! J., Cheng, N.N., Theilmann, D., Brock, H.W., Phillips, J.E. (1996). Locust ion transport peptide (UP): primary structure, cDNA and expression in a baculovirus system. J. Exp. Biol. 199, 1053−1061.
  76. M. (1990). Gene transfer and expression: a laboratory manual. Stockton Press, NY.
  77. Dower, W.J., Miller, J.F., and Ragsdale, C.W. (1988). High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucl. Acids Res. 16, 6127−6145.
Заполнить форму текущей работой

Пора сдавать?