Использование липосомальных форм антимикробных препаратов для лечения раневой инфекции в эксперименте

Актуальность проблемы.

Лечение проникающих инфицированных ранений брюшной полости является актуальной проблемой современной медицины, не теряющей своей значимости с течением времени. Эффективность лечения зависит от многих факторов, которые обусловлены не только особенностями организма больного, но И’выраженностью патогенных свойств: возбудителей, способностью их. приспосабливаться к неблагоприятным условиям среды обитания, в том числе к действию антибиотиков[23, 26,. 30]. Недостаточную эффективность антибиотикоте-рапии. при проникающих инфицированных ранениях брюшной полости связывают. с внутриклеточным расположением возбудителей. Необходимость, длительных и повторных курсов лечения часто приводит к развитию побочных реакций. Наиболее грозными осложнениями являются перитонит, сепсис, аллергические реакциитоксические поражения печени и почек [32, 38, 40, 55, 73]. Большое практическое значение в борьбе с возбудителями раневого процесса приобретает разработка новых антимикробных препаратов^ их носителей и схем лечения [58, 72, 86, 99, 210].

Эффективность лечения проникающих инфицированных ранений брюшной полости может быть увеличена при применении липосом в качестве-носителей для антибиотиков. [18, 24, 60, 65, 67, 95, 117].

Липосомы — это микроскопические сферические везикулы, заполненные жидкостью-, их мембрана состоит из молекул природных фосфолипидов, аналогичных входящим в состав клеточных мембран эукариотов.

Достоинства липосок как. носителей лекарств очевидны: полученные из природных фосфолипидов липосомы полностью биодеградируемы и биосовместимы, они пригодны для иммобилизации в них многих фармакологических агентов, в том числе антибиотиков [113, 129, 156]. Антибактериальные препараты внутри липосом более устойчивы в организме, так. как изолированы ли-пидной мембраной от повреждающих воздействий внешних условий, не оказывают общетоксического действия на макроорганизм [18, 67, 85, 104, 130, 166];

Уникальной особенностью липосом является возможность доставки лекарственных препаратов внутрь клеток, где располагаются возбудители раневой инфекции, что позволяет проводить более эффективное лечение [95, 98, 162,188]. г.

Большая часть антибиотиков в течение первых 6−8 часов выводится из организма. Использование липосом позволяет удлинить время элиминации антибактериальных препаратов до 72 — 96 ч [62, 66, 70].

Таким образом, сниженная активность антибиотиков за счет их неспособности эффективно воздействовать на внутриклеточно расположенных возбудителей раневого процесса, токсическое воздействие на макроорганизм антимикробных препаратов и их быстрая элиминация дают основания считать весьма актуальной проблему разработки химиотерапевтических средств на основе липосомальной технологии и отработки схем их введения для лечения проникающих инфицированных ран брюшной полости.

Цель работы. Создание липосомальных форм антимикробных препаратов и разработка эффективной схемы лечения этими препаратами проникающих инфицированных ранений брюшной полости в эксперименте.

Задачи исследования.

1. Выделить и идентифицировать штаммы отдельных видов микроорганизмов, вызывающих раневую инфекцию в госпитальной практике.

2. Получить липосомальные формы антимикробных препаратов, оценить их физико-химические свойства, изучить их фармакокинетику и фармакодина-мику в макроорганизме.

3. Изучить в сравнительном аспекте токсичность антимикробных препаратов в свободной и липосомальной формах на экспериментальных животных.

4. Оценить эффективность лечения проникающих инфицированных ранений брюшной полости тетрациклина гидрохлоридом, стрептомицина сульфатом, гентамицина сульфатом и цефоперазоном в свободной и липосомальной формах.

Научная новизна.

Впервые показана возможность применения" липосомальных форм антибактериальных препаратов (тетрациклина гидрохлорида, стрептомицина сульфата, гентамицина сульфата, цефоперазона) для успешного лечения экспериментального проникающего инфицированного ранения брюшной полости.

Впервые разработана перспективная схема лечения проникающего инфицированного колотого ранения брюшной полости экспериментальных животных, позволяющая в 2 раза снизить дозу антибактериальных препаратов и сократить количество введений липосомальных препаратов с 15 до 8, увеличивая при этом эффективность лечения проникающих ранений брюшной полости.

Практическая ценность.

На основании результатов, полученных в ходе выполнения диссертационной работы оформлено: 3 инструкции по изготовлению и контролю липосомальных антибактериальных препаратов и 3 инструкции по их применению, внедренных на учрежденческом уровне.

1. Инструкция по изготовлению и контролю липосомальной формы гентамицина сульфата. Утверждена директором Волгоградского НИПЧИ 27.12.02 г.

2. Инструкция по применению липосомальной формы гентамицина сульфата при лечении раневой инфекции. Утверждена директором Волгоградского НИПЧИ 27.12.02 г. •.

3. Инструкция по изготовлению и контролю липосомальной формы стрептомицина сульфата. Утверждена директором Волгоградского НИПЧИ 25.06.03 г.

4. Инструкция по применению липосомальной формы стрептомицина сульфата. Утверждена директором Волгоградского НИПЧИ 25.06.03 г.

5. Инструкция по изготовлению и контролю липосомальной формы гентамицина сульфата. Утверждена директором Волгоградского НИПЧИ 25.06.03 г.

6. Инструкция по применению липосомальной формы гентамицина сульфатапри лечении раневой инфекции. Утверждена директором Волгоградского НИПЧИ 25.06.03 г.

Полученные экспериментальные данные по фармакокинетике стрептомицина сульфата и гентамицина сульфата, иммобилизованных в липосомы используются в разделе «Антибактериальные, химиотерапевтические средства «в. лекционном и практическом курсах, по фармакологии и биофармации для слушателей факультета усовершенствования врачей Волгоградского медицинского университета, по фармакологии и клинической фармакологии и интенсивной терапии для студентов В о л гоградского медици некого университета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В этиологии раневойинфекции ведущее место занимают Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, вызывающие стандартныйинфекционный процесс как в виде монокультур (91%), так и их микробных ассоциаций (9%).

2. Получение липосомальных препаратов путём обращения фаз позволяет включать во внутренний объём везикул от 50 до 85% используемых. антибактериальных средств, что повышает эффективность их лечебного действия.

3. Иммобилизованные в липосомы антимикробные препараты более интенсивно (в 4 — 5 раз), в сравнении с их свободными формами, поглощаются клетками мононуклеарно-фагоцитарной системы^ в которых, в основном, локализуются возбудители раневого воспаления, что пролонгирует действие антибиотиков в этих клетках.

4. Применение для: лечения раневой инфекции антибактериальных препаратов, включенных во внутреннийобъём везикул, значительно (в. 1,6 — 3,5 раза) снижает их общее токсическое воздействие на макроорганизм.

5. Предложенная схема лечения проникающих инфицированных ранений брюшной полости липосомальными формами антибактериальных препаратов позволяет получить высокий терапевтический эффект при снижении дозы применяемых лечебных средств и сокращения кратности (в 2 раза) их введения.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 104 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав материалов и методов, глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 233 литературных источников (отечественных и иностранных авторов).

Выводы.

1. В пробах клинического материала пациентов с проникающими инфицированными колотыми ранениями брюшной полости были изолированы и идентифицированы следующие виды микроорганизмов: S. aureus (35,5%), P. aeruginosa (32,7%), S. epidermidis (9,3%), Е. coli {8,4%), К. pneumoniae (3,7%), причем в 91% случаев они были представлены в виде монокультур и в 9% - микробными ассоциациями.

2. Методом обращения фаз получены липосомальные формы препаратов с г высоким содержанием в них (50 — 85% от исходного количества) антибактериальных средств (тетрациклина гидрохлорида, стрептомицина сульфа-■- та, гентамицина сульфата, цефоперазона).

3. Изучена динамика накопления липосомальных антимикробных препаратов в органах и тканях экспериментальных животных. Концентрация липосомальных антибиотиков в крови и паренхиматозных органах от 3 до 10 раз превышает таковую величину применяемых препаратов в свободной форме.

4. Установлено, что липосомальные формы антибиотиков, в отличие от свободных форм препаратов, гораздо интенсивнее (в 3 раза) поглощаются клетками мононуклеарно-фагоцитарной системы, являющейся местом нахождения внутриклеточных патогенов.

5. Сравнительное изучение токсичности иммобилизованных в липосомы антибиотиков и их свободных форм показало явное снижение токсичности (в 1,6 — 3,5 раза) в случае введения экспериментальным животным препаратов, приготовленных путем липосомальной технологии.

6. Разработана оптимальная схема лечения проникающих колотых инфицированных ранений, позволяющая повысить эффективность лечения в 2 — 3,5 раза. Показатель ED50 антибиотиков соответственно в липосомальной и свободной формах составили: для тетрациклина гидрохлорида 3,1 мг и 7,2 мгстрептомицина сульфата 1,9 мг и 6,8 мггентамицина сульфата 0,75 мг и 1,62 мг и цефоперазона 0,84 мг и 3,0 мг.

Заключение

.

Лечение проникающих инфицированных ранений брюшной полости является актуальной проблемой современной медицины. Причиной увеличения числа проникающих ранений брюшной' полости является всё- более возрастающее количество локальных военных конфликтовдорожный травматизм, несоблюдение населением техники безопасности при работе с механизмами в промышленном и сельскохозяйственном производстве, широкое распространение антибиотикоустойчивых возбудителей раневого процесса.

Эффективность лечения проникающих инфицированных ранений брюшной полости зависит от многих факторов, которые обусловлены не только особенностями больного организма, состоянием его защитных сил, но и выраженностью патогенных свойств возбудителей, способностью их приспосабливаться к неблагоприятным условиям среды обитания, в том числедействию антибиотиков'[23, 26, 30]. Слабый эффект антибиотикотерапии при раневой инфекции, в. основном, связывают с внутриклеточным расположением микроорганизмов: Необходимость длительных и повторных курсов лечения часто приводит к развитию побочных реакций. Наиболее грозными осложнениями являются сепсис, анафилактический, шок, аллергические реакции, токсические поражения печени, почек [32, 38, 40,. 55, 73].

Ранее для лечения проникающей раневой инфекции брюшной полости часто применяли антибиотики LII поколения: группы аминогликозидов, тет-рациклинов, цефалоспоринов:[10, 41]. В настоящее время данные препараты для лечения, инфицированных ран применяются редко в связи с возникновением к ним устойчивости у микроорганизмов, вызывающих раневой-процесс. Антибиотики данных групп не всегда эффективны при лечении инфекций с внутриклеточным расположением возбудителей [9, 12, 15, 21, 39], кроме того, они имеют узкий терапевтический диапазон и достаточно выраженные побочные эффекты. Проникновение антимикробных препаратов в клетки — мишени и поддержание их бактерицидных концентраций в течение длительного времени является одним из важных условий успеха антибактериальной терапии. Не все антибиотики обладают данными свойствами. Поэтому разработка рациональных схем лечения проникающих инфицированных ранений брюшной полости, поиск' новых, путей< и способов введения антибактериальных препаратов является актуальным.

Одним, из путей решения является использованием’липосом — носителей лекарственныхпрепаратов.

Повышение эффективности липосомальныхантибактериальных препаратов обусловлено их направленным проникновением в ткани и клетки мононук-леарно-фагоцитарной: системы, в которых, в основном, локализуются возбудители раневой инфекции, а также отсутствием побочных, эффектов самих везикул. Эффективность липосом как носителя антибактериальных препаратов определяется эффективностью доставки включенного вещества в клетки-мишени, способностью к деградации в. биологических системах без разрушения включенного вещества.

Адекватная антибактериальная терапия проникающих инфицированных ранений брюшной полости требует микробиологической: диагностики. Проведение микробиологических исследований раневого отделяемого предоставляет информацию, необходимую длядиагностики и лечения. Проведение культура-логического исследования материала, полученного от больного, для адекватного выбора, антибактериальной терапииу больных с инфицированными проникающими ранами брюшной полости остаётся важным условием успешного-лечения.

При изучении штаммов возбудителей проникающих инфицированных колотых ранений у больных хирургических стационаров г. Волгограда (МУЗ. № 4 и № 7) в пробах клинического материала от пациентов выявлено, что в 35,5% и 32,7% присутствовалиS. aureus и P. aeruginosa соответственно, S. epider-midis и Е. coli были изолированы в 9,3 и 8,4 процентах случаев соответственно. Менее всего из раневого отделяемого больных выделено штаммов /С pneumoniae и С. albicans — 3,73 и 1,86% соответственно. В 91% случаев вышеуказанные возбудители проникающей раневой инфекции брюшной полости были выделены в виде монокультур. Среди микробных ассоциаций (9%) также преобладали ассоциации aureus о P. aeruginosa и с Proteus, что согласуется с данными некоторых исследователей, которые показали, что основными возбудителями инфекционных осложнений проникающих ран различной этиологии в первую очередь являлись стафилококки и энтеробактерии [32, 34, 42].

Высокая степень включения лекарственных препаратов во внутренний объем везикул является одним из важных условий их использования в качестве транспортной системы. В настоящей работе, используя метод «выпаривания и обращения фаз» получены липосомы с высоким содержанием в. них антибиотиков (от 50 до 85%), средний размер везикул, содержащих антибиотик, составил: 1000 нм (800 -1200 нм), перекисный индекс Клейна при этом равнялся- 1,1 (1,3±0.2) условной единице, что соответствует нормальным значениям для не-окисленных липидов. Способность даже больших липосом (свыше 1200 нм), введенных, внутрибрюшинно, проникать в кровеносное русло, является очень важным фактором, подтверждающим возможность их преодолевать гистогема-тический барьер [66, 117, 128, 132, 149]. Это объясняется, во-первых, технологией получения препаратов, во-вторых, высокой растворимостьюи липофиль-ностью изучаемых антибиотиков [55]. Указанные характеристики полученных нами липидных везикул позволяют предположить высокую эффективность использованного метода, его простоту и доступность [60, 66, 67, 119].

Результаты наших исследований по изучению фармакокинетики липосо-мальных антибактериальных препаратов свидетельствуют о томчто при внутрибрюшинном введении экспериментальным животным везикул, содержащих антибиотики, их концентрация быстро (в течение 2 — 4 ч) достигает максимальных показателей, значительно превышая таковую при введении свободного антибиотика. Полученные при выполнении работы экспериментальные данные свидетельствуют о том, что после внутрибрюшинного введения животным терапевтических доз липосомальных антибиотиков, пиковые концентрации препаратов в крови являются очень высокими. В печени экспериментальных животных уже через 2 ч после введения липосомального препарата его концентра. 76 ция-составила 28,2%. После введения животным свободного гентамицина сульфата, его концентрация в печени достигла максимального значения через 4 ч и составляла всего 16,31%. В крови экспериментальных животных концентрация липосомального антибиотика через 1 ч превышала таковую свободного препарата в 7,76 раза. Максимальной концентрации в лёгких экспериментальных животных липосомальный препарат достигал уже через 2 ч после введения, далее его количество снижалось и через 48 ч составляло 1,2%. Содержание в лёгких животных свободного препарата через- 1 час после введения было всего 0,61%.

Накопление наибольшего количества липосомального гентамицина в селезёнкенаблюдалось в период от 4 до 8 ч и составило 6,73%, после 48 ч количество препаратауменьшилось до 2,74%. Концентрация свободного, гентамицина сульфата достигла. 1,82% через 2 ч и уже через 8 ч была ниже 1%. В почках наблюдалась инаякартина: ко. второму часу концентрация свободного гентамицина' сульфата, превышала показатель липосомальной формыантибиотика в 2,5 разазатем следовало быстрое снижение концентрации, что свидетельствует о значительном’выведении из организма неиммобилизованного. препарата-.

Основным местом локализации’липосом различного липидного состава и размеров при внутрибрюшинном введении являются органы мононуклеарной фагоцитарной системы. Благодаря этому в органах, содержащих большое количество макрофагов, создается повышенная концентрация препарата, причем на более длительный промежуток времени [70, 91, 94, 95, 132,1'56, 188].

Липосомы проникают в клетки мононуклеарной фагоцитарной системы (альвеолярные макрофаги, звездчатые ретикулоэндотелиоциты, макрофаги селезенки и лимфатических узлов) чаще всего путем эндоцитоза. 8, 68, 162, Л 66, 217].

В наших исследованиях показано, что уровень средних концентраций липосомальных препаратов в макрофагах значительно (в 8 — 10 раз) превосходит уровни’свободных препаратов. При введении в организм экспериментальных животных свободного антибиотика его максимальное количество в перитонеальных макрофагах через, Г ч не превышало 7,5% от введенной дозы и через 8ч составляло менее 1%. Концентрация липосомального антибиотика через час после введения в 3 раза превышала таковую свободного препарата. Иммобилизованный препарат находился в макрофагах до 48 ч в относительно высоких концентрациях, и даже через 72 ч его количество превышало 4%.

Применение в лечебной практике антибиотиков в ряде случаев сопровождается возникновением различных побочных реакций, иногда опасных для жизни больного. В последнее время этой проблеме, уделяется большое внимание, как в отечественной, так и в зарубежной печати [1, 6, 60]. Используя липосомы в качестве носителей химиопрепаратов, можно значительно снизить токсический эффект воздействия на макроорганизм.

При сравнительном изучении острой-токсичности гентамицина сульфата в свободной и липосомальной форме установлено, что иммобилизация антибиотиков в липосомы позволила уменьшить токсичность в 1,65 раза. Изучение хронической токсичности иммобилизованных антимикробных препаратов показало, что токсическая доза тетрациклина' гидрохлорида, находящегося во внутреннем объеме липосом, составила 6,46. мг/мышь, что в 3,4 раза выше, чем при использовании свободного антибиотика. Снижение токсичности антибиотиков, включенных, в липосомы, у белых мышей можно: объяснить тем, что препараты, ограниченные липидной мембранной липосом медленно разрушаются ферментными системами (фосфолипидная мембрана), выделяя ограниченное количество антибиотика, что не создает его критических концентраций в макроорганизме, что согласуется с данными ряда исследователей, изучавшими токсическое воздействие липосомальных антибактериальных препаратов на макроорганизм [18, 104]. Таким образом, иммобилизация антибиотиков в, липосомы позволила снизить их острую токсичность в 1,6 раза, хроническую в 3,5 раза. Полученные результаты по исследованию токсичности липосомальных. антибиотиков позволяют использовать их с меньшим риском развития токсического поражения макроорганизма для лечения экспериментальных проникающих инфицированных колотых ранений брюшной полости.

Преимущественный захват липосом печенью и активное поглощение их клетками мононуклеарной фагоцитарной системы, низкая токсичность явились предпосылкой-для проверки возможности их использования при лечении раневой инфекции брюшной полости.

В' наших исследованиях изучение лечебного эффекта липосомальных препаратов показало значительные преимущества фосфолипидных везикул с включенными внутрь антибиотиками перед, обычнымиформами: этих лекарственных веществ при лечении проникающего колотого инфицированного ранения брюшной полости в эксперименте.

Применение липосомального тетрациклина гидрохлорида в дозе 3,36 мг увеличило процент выживших животных до 67, в то время как свободная форма препарата в дозе 6 мг позволила выжить лишь 17% экспериментальных животных. Снижение-дозы липосомального антибиотика до 1,68 мг позволило выжить Л 7% мышей, в то же время при введении. препарата в свободной форме в дозе 3 мг — процент выживших животных равнялся нулю. Применение липосом в качестве переносчика для тетрациклина гидрохлорида снизило ЕД50 препарата в 2,3 раза, терапевтический индекс при этом увеличился 9²¹ раза, индекс клинической эффективности.(ИКЭ) был в 16,1 раза выше, чем у свободного тетрациклина гидрохлорида.

Стрептомицина сульфат в дозе 6 мг предохранял от гибели 33% животных при средней продолжительности жизни 8,1 суток.

Введение

липосомального антибиотика в дозе 2,25 мг повысило продолжительность жизни мышей до 14,1 суток и процент выживших животных до 83,3%. Липосомальный стрептомицин в дозе, вдвое меньшей (1,12 мг), чем свободный, предохранял от гибели 50% особей и увеличивал продолжительность их жизни до 13,1 суток. Иммобилизация препарата в липосомы позволила увеличить ЕД5() антибиотика в 3,5 раза по сравнению с обычным препаратом. Стрептомицина сульфат в свободной и липосомальной формах в дозах 3⁰- 1,5- 0,75 мг (для свободной формы) и 0,28 мг (для липосомальной) при лечении изучаемой инфекции был неэффективен. Гибель 100% особей отмечена в различные сроки наблюдения. Терапевтический-индекс (ТИ) свободной формы препарата (1,64) в 5,55 раз ниже, чем-у иммобилизованного в липосомы стрептомицина. Индекс клинической эффек-. тивности стрептомицина в липосомах (ИКЭ) в.3,5 раза выше по сравнению со свободной формой препарата.

При сравнительном' изученииэффективности, гентамицина сульфата в свободной и липосомальнойформах антибиотик в тривиальной форме предохранял от гибели 50% животных в дозе З мг, в липосомальной-форме — 100% в дозе 1,06 мг. При этом: возрастание средней продолжительности жизни животных отмечалось в 2 раза. Включение препарата в липосомы снизило ЕД50 антибиотика в 2,16 раза в. и увеличило терапевтический. индекс в 3,5 раза, а также индекс клинической эффективности в 6,2 раза.

Нами показано, что при использовании цефоперазона, иммобилизованного внутрь липосомальных везикул в дозе, 0,75мг/мышь, средняя продолжительность жизни экспериментальных животных возрослав 1,2 раза в сравнении со свободным антибиотикомПри лечении проникающей раневой инфекции свободной формой, препарата в дозе* 3мг/мышь. процент выживших животных возрос от 33% для свободного антибиотика до 83% при лечении иммобилизованной формой препарата ЕД50 антибиотика в липосомальной форме составила 0,84 мг, а свободного цефобида 3−0 мг.

Эффект липосомальных антибиотиков вероятно объясняется не только следствием направленного транспорта липосом к клеткам — мишеням, но и возможным воздействием на основные, звеньятечения воспалительного процесса (экссудацию и пролиферацию). Уменьшение. текучести мембран при этом способствует сохранению клеточных структур в условиях гипоксии и ишемии [116, 166, 175, 201]. Klein R. А. показал, что высокая эффективность антибиотиков включенных в липосомы, возможно, обусловлена тем, что липосомы: способны в некоторой степени ингибировать процессы перекисного окисления ли-пидов за счет экзогенного фосфатидилхолина (входящего в состав липосом), который обладает антиоксидантными свойствами [167].

Повышение эффективности липосомальных антибиотиков связано и с тем, что особенности фармакокинетики липосом способствует созданию более высоких бактерицидных концентраций не только в паренхиматозных органах, но и в крови.

Таким образом, лечение липосомальными формами тетрациклина гидрохлорида, стрептомицина сульфата, гентамицина сульфата и цефоперазона проникающего инфицированного колотого ранения брюшной полости оказалось в 2−3 раза эффективнее, чем при использовании свободных антибиотиков.

В целом, полученные результаты открывают широкие возможности для дальнейшего теоретического и экспериментального изучения липосомальных форм антимикробных препаратов в плане усовершенствования биотехнологии их получения, а также использования при лечении и профилактики особо опасных инфекций.