Электрофорез проводился в 12,5% ПААГ (рис.9). Растворы для нанесения на гель готовились по табл. 4. Ячейки геля заполнялись в соответствии со схемой (табл. 5).
|
Анализируемый компонент. | Количество компонента, мкл. | Буфер для нанесения, мкл. | Меркаптоэтанол. | Деионизованная вода. |
| Буфер для нанесения. | |
| Маркеры RainBow. | |
| BBY-препараты ФС-2. | | | | |
| ФР 6. | | | | |
| ФР7. | | | | |
| ФР 11. | | | | |
| ФР1.14. | | | |
| Фр1.19. | | | |
| ФС-2 после NaCl обработки. | | | | |
| Маркеры PageRuler. | |
Табл. 4. Растворы для нанесения на гель.
|
Буфер для нанесения, мкл. | Маркеры RainBow, мкл. | BBY-препа-раты ФС-2, мкл. | ФР 6, мкл. | ФР7,мкл. | ФР 11, мкл. | ФР1.14, мкл. | ФР1.19, мкл. | ФС-2 после NaClобработки, мкл. | Маркеры PageRuler, мкл. |
| | | | | | | | | |
Табл. 5. Схема заполнения геля.
- 1) Буфер для нанесения (контроль)
- 2) МаркерыAmershamECLRainbow — FullRange (Рис.11)концентрация белка приблизительно 2 мг / мл, спектр определения молекулярной массы 12−225 кДа.
- 3) BBY — препараты ФС-2 (описание в разделе «Получение и характеристика препаратов ФС-2»)
- 4) ФР6 — Обнаружен белок PsbP с молекулярной массой 23 кДа
- 5) ФР7 — Белка не обнаружено
- 6) ФР11 — примеси белков
- 7,8) ФР 1.14 и 1.19 — Обнаружен белок PsbQ (17 кДа) c примесями других белков.
- 9) Препараты ФС-2 после NaCl-обработки
10) МаркерыFermentasPagerulerUnstainedProteinLadder (рис. 11) Спектр определен…
Рис. 11. Маркеры Amersham ECL Rainbow — Full Range (слева), маркерыPageRuler Unstained Protein Ladder (справа)
Из результатов электрофореза видно (рис. 9; полосы геля 3 и 9), что нам удалось полностью удалить белки PsbP и PsbQ из препаратов ФС-2 с помощью обработки NaCl. Кроме того, нам удалось отделить белки PsbP и PsbQ друг от друга при помощи ионообменной хроматографии (рис. 9 полосы геля 4, 7 и 8). Таким образом, полученные фракции белков можно использовать для исследования их карбоангидразоподобной активности. К сожалению, фракции изолированных белков PsbP и PsbQ содержат примеси: во фракции белка PsbP по-видимому присутствует белок PsbS; а фракция белка PsbQ содержит некоторые белки ССК-2.Для дальнейшей идентификации примесных белков необходимы другие методы и подходы, но это не входило в цели данной работы. Кроме того, известно, что белки ССК-2 не обладают карбоангидразной активностью (Шитов с соавт., 2009) и, следовательно, не могут помешать исследованию карбоангидразоподобной активности белка PsbQ.
Итак, нам удалось разделить белки PsbP и PsbQ и мы могли производить на них по отдельности дальнейшие исследования.
