Молекулярно-клеточные механизмы цитотоксического действия гипоксии

Динамика формирования структурных и функциональных сдвигов в различных органах и тканях при гипоксии определяются в значительной мере темпами ее развития, локализацией патологии, характером этиологических факторов, инициирующих гипоксию, и особенностями компенсаторно — приспособительных реакций в том или ином органе. (Учебное пособие для ВУЗов, 2005).

Независимо от характера этиологических факторов и механизмов развития гипоксии, наиболее ранними проявлениями нарушения оксигенации тканей являются сдвиги их энергетического обеспечения и связанные с ними нарушения углеводного, жирового и белкового метаболизма.

Одним из метаболических признаков гипоксии и соответственно недостаточности энергоснабжения нервной ткани, а также миокарда является снижение уровня креатинфосфата (КФ), выполняющего роль не только резервного источника макроэргических фосфатных связей, но и обеспечивающего их транспорт в клетках к местам энергетических трат. (Окороков А.И., 2002).

В условиях гипоксии, в случаях увеличения потенциала фосфолирирования, возникает активация ключевого фермента гликолиза — фосфофруктокиназы (ФФК) и соответственно возрастание пропускной способности реакции анаэробного гликолиза. При этом резко снижается запас гликогена в сердце, мозге, печени, почках, мышцах и других тканях и соответственно накапливаются продукты гликолитических реакций — молочная и пировиноградная кислоты.

Развитие метаболического ацидоза при гипоксических состояниях усугубляется также недостаточностью реакций окисления жирных кислот, аминокислот, чрезмерным накоплением кислых продуктов метаболизма указанных соединений. (Зайчик А.Ш., Чурилов Л. П., 2000).

Что касается окисления жирных кислот в митохондриях и их роли в энергетическом обеспечении тканей, в частности миокарда, следует отметить две главные стадии. На первой стадии происходит последовательное отщепление двууглеродных фрагментов (в виде ацетил — КоА) от карбоксильного конца цепи жирной кислоты в результате цикла ферментативных реакций. На второй стадии окисления жирных кислот ацетильные остатки ацетил-КоА окисляются через цикл лимонной кислоты до СО2 и воды в митохондриях. (Березов Т.Т., Коровкин Б. Ф., 1998).

На обеих стадиях окисления жирных кислот атомы водорода или соответствующие им электроны передаются по митохондриальной цепи переноса электронов на кислород. С этим потоком электронов спряжен процесс окислительного фосфорилирования АДФ до АТФ. Следовательно, в условиях гипоксии различного генеза блокируются процессы окисления жирных кислот в тканях, в избытке накапливаются кислые продукты, формируются метаболический ацидоз и соответственно развивается дефицит АТФ, подавление всех энергозависимых реакций. (Ленинджер А., 1999).

Большую часть метаболической энергии, вырабатываемой в тканях, поставляют процессы окисления углеводов и триацилглицеридов (в среднем 90%). Лишь 10−15% энергии поставляется в процессе окисления аминокислот. Если аминокислоты, высвобождающиеся при обычном динамическом обновлении белков не используются для синтеза новых белков, то они подвергаются окислительному расщеплению. В случаях нарушения утилизации глюкозы возникает усиление катаболизма белков, при этом аминокислоты теряют свои аминогруппы, превращаются в алфа — кетокислоты. Последние в условиях нормальной оксигенации тканей вовлекаются в цикл Кребса с образованием СО2 и воды. Естественно, что в условиях гипоксии, когда нарушаются окислительно — восстановительные реакции в цикле Кребса, развитие метаболического ацидоза усугубляется за счет избыточного накопления в тканях аминокислот, альфа-кетокислот. (Ньюсхолм Э, Старт К., 1977).

Среди механизмов, приводящих к повреждению биологических мембран при гипоксии различного генеза, выделяют следующие:

• 1) Развитие метаболического ацидоза
• 2) Выброс вазоактивных соединений тучными клетками
• 3) Активацию процессов липопероксидации
• 4) Высвобождение лизосомальных гидролаз при дезорганизации лизосомальных мембран с последующим усугублением метаболических сдвигов.

Развитие гипоксического некробиоза связано в значительной мере с дезорганизацией цитоплазматических, лизосомальных, митохондриальных и др. биологических внутриклеточных мембран, формирующих отдельные функциональные и структурные компартаменты.

В условиях гипоксии, дефицита энергетического обеспечения клеток возникает недостаточность механизмов инактивации цитоплазматического кальция и удаления его из клеток в связи с подавлением активности АТФ-зависимого Са-насоса, натрий-кальциевого обменного механизма, дестабилизацией митохондриальных мембран и мембран эндоплазматического ретикулума, играющих в условиях нормы важную роль в поддержании баланса внутриклеточного кальция. При избытке внутриклеточного кальция усугубляются процессы набухания митохондрий, усиливается дефицит АТФ и подавление всех энергозависимых реакций в клетке. Избыток кальция активизирует ядерные эндонуклеазы, фрагментирующие ДНК, индуцирует апоптоз. При высоком уровне внутриклеточного кальция активизируется нейтральные протеазы-кальципаины, разрушающие цитоскелет клетке, в частности белки фоурин и В-актин, лизирующие рецепторы и протенкиназу. (Макатария А.Д., Бизадзе О. В., 2001).

При избыточном накоплении ионов кальция в клетке, активации процессов липопероксидации при гипоксиях различного генеза резко повышается проницаемость митохондриальных мембран, возникает набухание митохондрий, пространственная дезориентация ферментативных систем транспорта электронов, синтеза АТФ. В результате происходит разобщение окислительного фосфорилирования и дыхания и соответственно подавление всех энергозависимых систем клетки: синтеза белка, трансмембранного переноса ионов, сопряжения процессов возбуждения и сокращения в мышечных структурах и т. д.

Наряду с локальными и системными метаболическими сдвигами в тканях, обусловленными гипоксией, ацидозом, активизацией процессов липопероксидации при гипоксиях различного генеза, возникает комплекс метаболических и функциональных сдвигов, обусловленных выбросом гормонов адаптации-катехоламинов, глюкокортикоидов.

При чрезмерной активации симпатоадреналовой системы (САС) реакции адаптации довольно быстро трансформируется в дезадаптационные процессы. Во-первых, при активации освобождения норадреналина происходит спазм сосудов периферических органов и тканей и соответственно усугубление циркуляторной гипоксии. На фоне активации САС при участии постсинаптических бета-адренорецепторов возможна активация процессов гликолиза, гликонеогенеза, липолиза, что безусловно, усугубляет развитие ацидотических сдвигов, свойственных гипоксии. (Зарубина И.В., Смирнов А. В., Криворучко Б. И., 2000).

Усиление адренергических влияний закономерно сопровождается активацией процессов липопероксидации, что вносит весомый вклад в механизмы развития гипоксического некробиоза клеток органов и тканей, чувствительных к ишемии. Синхронно с освобождением катехоламинов в условиях гипоксического стресса выбрасываются глюкокортикоиды, индуцирующие процессы лизиса и апоптоза в лимфоидной ткани, блокирующие процессы пролиферации и репаративной регенерации в ряде внутренних органов.

Несколько лет тому назад стало известно, что важнейшую роль в этих процессах играет кислородчувствительный протеиновый комплекс, обладающий транскрипционной активностью-гипоксия-индуцибельный фактор (hypoxia-inducible factor-HIF).

Реакция клетки на недостаток кислорода имеет особое значение для понимания патологических процессов, происходящих в организме. Тонкий баланс между потребностью в кислороде и его доставкой нарушается при заболеваниях сердца, раке, хронических обструктивных заболеваниях легких, которые являются основными причинами смертности населения. HIF считается ведущим транскрипционным регулятором генов млекопитающих, ответственных за реакцию на недостаток кислорода. Он активируется в физиологически важных местах регуляции кислородных путей, обеспечивая быстрые и адекватные ответы на гипоксический стресс, включает гены, регулирующие процесс ангиогенеза, вазомоторный контроль, энергетический метаболизм, эритропоэз и апоптоз. (Ausserer W. A., Bourrat-Floeck B., Green C. J., 1994).

Комплекс HIF является гетеродимером, состоящим из одной альфа-субъединицы (HIF-альфа) и одной бета-субъединицы (HIF-бета). HIF-альфа существует в виде множества изоформ (HIF-1альфа, HIF-2альфа, HIF-3альфа) с различными биологическими свойствами. Бета-субъединица названа aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT/ HIF-1b). Как альфа-, так и бета-субъединицы принадлежат к базисному семейству транскрипционных факторов, имеющих в своем составе мотив типа «спираль-петля-спираль» (helix-loop-helix) и зоны гомологии бетаHLH/Per-ARNT-Sim (PAS домен).

Субъединица HIF-1альфа является кислород-чувствительной, она имеет специфическую функцию в стимулированной гипоксией генной регуляции и является мишенью для кислород-чувствительных сигнальных путей. Субъединица HIF-1бета является кислород-нечувствительным конститутивным ядерным протеином, который имеет различных партнеров димеризации в других системах генной регуляции. ОбеHIF-1альфа и HIF-2альфа субъединицы подвергаются быстрой гипоксической белковой стабилизации и соединяются с идентичной мишенью в последовательности ДНК. (Uchida N., Rossingnol F., Matthay M. A., 2004).

Способность кислорода влиять на активацию HIF осуществляется на нескольких стадиях, включающих регулируемый синтез, процессинг и стабилизацию HIF, ядерную локализацию, димеризацию и взаимодействие с транскрипциональными коактиваторами.

На сегодня анализ регуляторных механизмов, обеспечивающих активацию HIF гипоксическими и негипоксическими стимулами, позволяет говорить о вовлечении различных способов активации HIF.

Присутствие кислорода запускает гидроксилирование пролинового остатка HIF-кислородзависимого домена деградации OOD (oxygen-dependent degradation domain). Это гидроксилирование катализируется семейством внутриклеточных пролин гидролаз (PHD), что служит сигналом для узнавания альфа-субъединицыбелком фон Хиппеля-Линдау (von Hippel-Lindau protein-pVHL) — компонентом убиквитин протеинлигазы Е3. Присоединение убиквитина делает HIF-1альфа мишенью протеосомной деградации. В клетках млекопитающих были идентифицированы три изоформы HIF пролил-гидроксилаз, названные PHD1−3 (prolyl hydroxylase domain enzymes 1−3). (Ivan M., Haberbenger T., Gervasi D. C., 2002).

Присутствие кислорода также вызывает гидроксилирование аспарагиного остатка С-терминального домена трансактивации (С-TAD) HIF-1альфа, блокируя взаимодействие с коактиватором транскрипции р300/СВР. Этот процесс регулируется специфической аспарагин-гидроксилазой, названной FIH-1 (factor-inhibiting HIF-1). (Bruick R. K. and McKnight S. L., 2001).

В результате, в присутствии кислорода активные ферменты PHD и FIH инактивируют HIF, тем самым блокируя опосредованную HIF генную транскрипцию. В условиях гипоксии PHD и FIH ферменты инактивируются, и отсутствие гидроксилирования ведет к стабилизации HIF и активации С-TAD, который способен формировать ДНК-связанный гетеродимер с постоянно присутствующей HIF-бета субъединицей и усиливать ко-активатор р300/СВР. Иными словами, недостаток кислорода инактивирует PHD и FIH, что ведет к активации HIF, который в свою очередь запускает экспрессию гипоксия-зависимых генов, таких как эритропоэтин (EPO) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF).

HIF-зависимые ответы на изменение концентрации кислорода могут модулироваться клеточным окружением. Последние данные свидетельствуют, что существует множество точек взаимодействия между клеточным окружением и путями гидроксилирования HIF, которые обеспечивают четко отлаженные физиологические ответы на гипоксию. Некоторые исследования указывают на то, что окисление первичных субстратов осуществляется посредством генерации высоко реактивных железосодержащих радикалов, и важной чертой этого процесса является то, что связывание их с первичными субстратами предшествует связыванию с молекулярным кислородом, таким образом лимитируя риск формирования непродуктивных и потенциально опасных радикалов. Вслед за присоединением молекулярного кислорода, один атом кислорода инкорпорируется в гидрокилированный остаток HIF, тогда как второй окисляет 2-оксиглутурат с образованием сукцината и СО2.

В нормальных физиологических условиях в организме взрослых млекопитающих поддержание HIF системы на определенном уровне во всех органах и тканях крайне важно, особенно это касается почечной ткани. HIF-альфа субъединицы определены в клетках почек в кортикальном и модулярном слоях, в S-тельцах и гломерулярных клетках.

В регуляции эритропоэза почки играют очень важную роль, поскольку служат основным физиологическим кислородным сенсором, отвечая на системную гипоксию быстрым увеличением продукции ЭПО в почечных интерстециальных клетках.

Печень также участвует в выработке ЭПО, но в значительно меньшем количестве, чем почки, и при нарушении продукции ЭПО в почках внепочечный синтез ЭПО не может компенсировать его почечные потери. Естественно, что главным регулятором продукции ЭПО является HIF-1 альфа, который и был открыт при изучении регуляции ЭПО. Однако в настоящее время показано, что и HIF-2принимает участие в регуляции эритропоэза как в печени, так и почках, но в печени его значение более выражено.