Обнаружение локализации фермента

клетка органелла митохондрия цитоплазма Фракционирование клеточных структур Разработан ряд методик для исследования изолированных отделов клетки.

Самым распространённым методом выделения клеточных структур является центрифугирование.

Виды центрифугирования:

1. Дифференциальное центрифугирование — специальный способ разделения веществ, основанный на разной скорости седиментации отдельных частиц.

В препаративной энзимологии чаще всего пользуются методом дифференциального центрифугирования гомогенатов тканей.

Применяют таким образом:

• -разрушают клеточную структуру с помощью подходящего дезинтегратора
• -получают гомогенизированную массу
• -массу подвергают дифференциальному центрифугированию при температуре 0−4°С.

Для выделения интактных органелл важно, чтобы среда, в которой проводится гомогенизация, была изотонической, т. е. осмотическое давление буфера должно соответствовать давлению внутри клетки. Если раствор гипотоничен, органеллы будут «впитывать» дополнительную воду и лопнут, а в гипертонических растворах они, напротив, сморщиваются.

Вслед за гомогенизацией следует фильтрование через марлю для удаления интактных клеток и соединительных тканей. Собственно фракционирование клеточных органелл проводится с помощью дифференциального центрифугирования, т. е. центрифугирования при различных скоростях вращения ротора. При этом ступенчатое увеличение центробежной силы (которую принято выражать величиной, кратной нормальному ускорению свободного падения g = 9,81 м/с2) приводит к последовательному осаждению различных органелл, т. е. их разделению в соответствии с плотностью и размером.

Изучение распределения ферментов.

Обычно распределение ферментов изучают в последовательных индивидуальных фракциях, изолированных при дробном центрифугировании гомогенатов:

а. фракции ядер, которые получают при низкой скорости центрифугирования;

б. фракции митохондрий, которые получают при средней скорости центрифугирования (фракция митохондрий не является гомогенной, поскольку из неё удаётся изолировать частицы, т. е. лизосомы, размер которых колеблется между митохондриями и микросомами) г. фракции микросом (или рибосом), которые получают при очень высокой скорости центрифугирования; (фракция микросом является гетерогенной, поскольку вместе со своим источником — эндоплазматическим ретикулуумом — имеет неоднородное строение) д. растворимая фракция цитоплазмы — супернатант.

Выделение клеточных органелл обычно проводят при низких температурах (0−5°С) для того, чтобы уменьшить степень деградации материала за счет реакций, катализируемых ферментами; последние высвобождаются в процессе разрушения ткани. Добавление тиолов и хелатирующих агентов необходимо для защиты функциональных SH-групп от окисления.

Молекулы-маркеры В процессе фракционирования важно контролировать чистоту фракций. Присутствие в определенной фракции той или иной органеллы и наличие других компонентов определяют с помощью молекул-маркеров. Обычно это органеллоспецифичные ферменты (ферменты-маркеры). Распределение ферментов-маркеров в клетке отражает локализацию в ней соответствующих каталитических реакций. Более детально эти вопросы обсуждаются в разделах, посвященных отдельным органеллам.

Зональное центрифугирование Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц.

В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму.

Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем) большинство этих частиц в достаточной степени разделяется центрифугированием при 100 000 д в течение 1—4 ч.

Центрифугирование в градиенте плотности Наиболее распространенный способ создания градиента плотности — центрифугирование раствора полимера в смеси двух или более жидкостей, отличающихся по плотности, молекулярным массам или по обоим показателям. Полимер собирается в области, где плотность раствора близка к плотности полимера в растворе, т. е. где создаётся парциальный удвоённый объем полимера в смеси растворителей.

Метод центрифугирования в градиенте плотности имеет две разновидности:

• 1) метод, основанный на измерении скорости седиментации в градиенте сахарозы;
• 2) метод равновесного центрифугирования, в котором используется градиент хлористого цезия.

В первом варианте используется заранее приготовленный градиент, а во втором — градиент создается под действием поля центробежных сил непосредственно в ходе эксперимента.

Другие методики разрушения клеток включают ферментативный лизис, разрушающий клеточные стенки, или механическое разрушение замороженных тканей (размолом или с помощью вращающихся ножей; под большим давлением; осмотическим шоком; многократным чередованием замораживания и оттаивания).

Сравнительно легко, обнаружить локализацию фермента методами цито — и гистохимии. Для этого тонкие срезы органа инкубируют с соответствующими субстратами и после инкубации локализацию продукта реакции открывают добавлением подходящих химических реактивов по развитию специфической окраски.