Оптимизация условий микроклонального размножения

Оптимизация условий микроклонального размножения

Методы культуры клеток и тканей широко используется для размножения декоративных растений в развитых странах. В настоящее время более одного миллиарда продаваемых декоративных растений производится посредством культуры тканей. Из них значительная часть представлена цветами на срез и горшечными растениями. На долю декоративных многолетников и садовых растений приходится лишь 2% от общего числа растений, полученных методом in vitro. В соответствие с этим варьирует и объем торговли. Так, согласно оценкам экспертов, декоративные многолетники ежегодно продают на сумму 8 млрд. долларов США, тогда как емкость рынка цветов на срез и горшечных растений превышает в десятки раз и составляет 90 и 60 млрд. долларов США, соответственно. Как видно, существует большая потребность и резервный потенциал для применения методов культуры тканей в размножении декоративных многолетников и садовых растений [1].

Одним из ценных декоративных многолетников является культура клематиса. Род Clematis L. относится к семейству лютиковых Ranunculaceae Juss. и насчитывает около 300 видов, которые встречаются в 28 флористических областях Земли Большинство сортов клематисов по жизненной форме являются лианами [2].

Клематис обладает рядом важных свойств, которые определяют его коммерческую ценность для декоративного озеленения в Казахстане. Прежде всего, это высокая декоративность и разнообразная цветовая гамма этой культуры. Клематисы восхищают белыми, розовыми, красными, лиловыми, фиолетовыми цветками. Гармоничное сочетание колеров позволяет создавать уникальные декоративные композиции для ландшафтного озеленения.

Традиционно клематисы размножают семенами и вегетативно. Семенное воспроизводство используется в основном в селекционной работе для получения новых сортов. С точки зрения получения стандартного посадочного материала существенным недостатком размножения семенами является расщепление основных признаков исходного сорта. Отмечается высокая степень гетерогенности полученных сеянцев по окраске и форме цветков, по высоте и срокам цветения растений. Поэтому для сохранения исходных признаков все сорта размножают только вегетативно: черенками, отводками, прививкой [3]. Однако, вегетативное размножение достаточно медленное, трудоемкое, зависит от природных условий, недостаточно эффективно и способствует накоплению инфекции в растительном материале [4]. Необходимы альтернативные способы для ускорения клонального размножения клематиса и получения массового посадочного материала. Целью данного исследования является оптимизация питательной среды для ускоренного и массового размножения клематиса Clematis alpina сорта «Ruby».

Объектом исследований являлся высокодекоративный сорт клематиса Clematis alpina сорта «Ruby» из коллекции АО «Лесной питомник». Эксплантами для введении в культуру in vitro служили различные органы растений: листовые сегменты, узловые сегменты с пазушными почками и сегменты междоузлий, взятые с растений, активно вегетирующих в условиях фитотрона.

Эффективность режима стерилизации оценивали по степени освобождения от инфекции, по токсичности и максимальному выходу жизнеспособных эксплантов. Предварительно исходный материал тщательно промывали в проточной водопроводной воде 1−1,5 часа, после чего ополаскивали дистиллированной водой. Дальнейшая обработка проводилась в ламинарном боксе. В качестве стерилизующего агента использовали сулему, соединение, которое обладает сильным дезинфицирующим действием и часто применяется для дезинфекции растительного материала [5].

Для поиска оптимального режима стерилизации были применены различные варианты стерилизации, различающиеся по времени обработки стерилизующими агентами: 70% этиловым спиртом и 0,1% раствором сулемы.

Для культивирования эксплантов в качестве основной среды использовали среду Мурасиге и Скуга (МС). С целью оптимизации гормонального состава было изучено 7 вариантов сред с разными комбинациями и концентрациями фитогормонов: бензиламинопурина (БАП), индолилмасляной кислоты (ИМК), индолилуксусной кислоты (ИУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), гибберелловой кислоты (ГК). В качестве антиоксиданта в питательную среду вносили аскорбиновую кислоту (АК). Гормональный состав сред представлен в таблице 1.

Таблица 1 — Гормональный состав питательной среды МС.

Наблюдения за ростом и развитием пробирочной культуры проводили каждую неделю и фиксировали результаты. Повторность опыта трехкратная.

Результаты и их обсуждение В результате проведенных нами экспериментов было установлено, что последовательная обработка 70% раствором этилового спирта в течение 30 сек и обработка 0,1% раствором сулемы в течение 8 мин дает положительные результаты. При использовании такого способа дезинфекции выход жизнеспособных эксплантов был максимальным и составлял 90,9%.

Результаты экспериментов по влиянию режима стерилизации на выход жизнеспособных эксплантов приведены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, наибольшее число инфицированных эксплантов отмечалось в варианте опыта, где дезинфекция эксплантов осуществлялась только 0,1% сулемой. Предварительная обработка 70% спиртом значительно понижала инфицированность и увеличивала выход жизнеспособных эксплантов до 90,9%.

Таблица 2 — Влияние режима стерилизации на жизнеспособность эксплантов Clematis alpina сорт Ruby в условиях in vitro.

Следовательно, кратковременное выдерживание в этаноле — обязательный этап для эффективной стерилизации растительного материала. Обработка этиловым спиртом необходима для удаления с поверхности эксплантов воскового налета и для усиления действия стерилизующих веществ. В результате первого режима стерилизации 0,1% сулемой в течение 5 минут количество зараженных эксплантов составило 5 шт, что свидетельствует о недостаточной экспозиции для удаления спорофитной микрофлоры.

Выбор экспланта для последующей индукции процессов роста и развития в условиях in vitro играет очень важную роль. По литературным данным для микроклонального размножения клематисов часто используют конус нарастания (апекс) с листовыми примордиями, латеральные почки вегетирующих побегов и узловые сегменты [6−8]. В наших экспериментах были использованы различные экспланты, изолированные в феврале-марте с маточных растений, начинающие вегетацию в условиях фитотрона.

Установлено, что сегменты листьев обладали высокой способностью к каллусогенезу, почти 100%. На всех испытанных вариантах среды появление плотного зеленого каллуса отмечалось на месте среза и первые видимые признаки каллусогенеза отмечались на двадцатый день культивирования (рисунок 1, А).

Рисунок 1 — А — образование каллуса на листовых сегментах на среде МС с 1 мг/л БАП и 0,3 мг/л НУК; Б — образование каллуса на сегментах междоузлий на среде МС с 2 мг/л 2,4-Д и 10 мг/л АК.

Сегменты междоузлий также обладали способностью к каллусогенезу, но не столь высокой. Данные экспланты продуцировали белый рыхлый каллус на поверхности срезов. Каллусогенез проходил на тех же двух вариантах среды с внесением фитогормонов 2,4-Д и БАП (Рисунок 1, Б). Индуцированные каллусы сильно отличались по структуре и окраске. Если каллус, полученный из листьев, имел плотную консистенцию и яркозеленую окраску, то каллус, образовавшийся из черенков, был белым и сильно обводненным. Для индукции органогенеза плотный каллус далее пассировали на среду для регенерации с внесением 4 мг/л БАП, 0,5 мг/л ИМК и 10 мг/л АК. Однако культивирование каллуса в течение месяца не дало положительных результатов, каллус разрастался без видимых признаков дифференцировки.

Более успешным для индукции морфогенеза in vitro было использование узловых сегментов побега с пазушными почками. У этих эксплантов отмечалось отрастание побегов и закладка дополнительных почек через 3 недели культивирования на индуцирующей среде с 1 мг/л БАП и 10 мг/л АК.

Выявлено, что на эффективность регенерации пазушных почек существенное влияние оказывал размер экспланта. Экспланты с почками от пяти мм длиной и более формировали жизнеспособные побеги, тогда как у почек меньшего размера формирования побегов не происходило (Рисунок 2 А, Б).

Рисунок 2 — Экспланты клематиса с недоразвитыми почки (А) и прорастание пазушных почек и формирование побегов на среде МС с 1 мг/л БАП и 10 мг/л АК (Б).

Следовательно, для размножения клематисов in vitro рекомендуется использовать экспланты с почками размером более 5 мм, которые хорошо выживают в культуре, обладают высокой скоростью роста и формируют побеги. Выявлено, что на регенерационную способность эксплантов микрочеренков существенно влияет гормональный состав питательной среды (таблица 3).

Таблица 3 — Влияние гормонального состава среды МС на прорастание пазушных почек Clematis alpina сорт Ruby.

Из данных, представленных в таблице 3 видно, что процент прорастания почек варьировал от 66 до 100% в зависимости от индуцирующей среды. Невысокий процент прорастания 66,6%, отмечался у микрочеренков, культивируемых на среде с 1 мг/л БАП и 10 мг/л АК. Повышение концентрации БАП до 1,5 мг/л и снижение концентрации аскорбиновой кислоты до 2 мг/л способствовало увеличению побегообразующей способности до 100%.

В вариантах среды № 3 и № 4 дополнительное внесение ГК в сочетании либо с НУК, либо с ИМК приводило к разным результатам. Высокий процент прорастания почек наблюдался на среде с 0,2 мг/л НУК, в то время как на среде с 0,01 мг/л ИМК прорастание составило 77,7%. Однако в варианте № 3 после прорастания почек наблюдался некроз тканей, тогда как на среде № 2 успешно происходила закладка адвентивных побегов в количестве 5−10 штук. Спонтанное образование корешков отмечалось при пассировании побегов на среду Ѕ Куорина-Леповре с 1,5 мг/л БАП + 2 мг/л АК (Рисунок 4 А, Б).

Рисунок 4 — Закладка адвентивных побегов на среде МС с 1,5 мг/л БАП + 2 мг/л АК.

Проведенные эксперименты позволили выделить ключевые факторы, определяющие эффективность применения метода культуры тканей для микроклонального размножения клематиса Clematis alpina сорт Ruby. Установлена зависимость реализации регенерационного потенциала как от физиологических факторов (природа экспланта и его размер), так и гормонального фактора питательной среды. В результате проведенных экспериментов можно сделать следующие выводы:

• · наиболее оптимальным режимом стерилизации является последовательная обработка в 70% спирте в течение 30 секунд и в 0,1% сулеме в течение 8 минут;
• · для размножения клематисов in vitro рекомендуется использовать микрочеренки с пазушными почками более 5 мм, которые хорошо выживают в культуре, обладают высокой скоростью роста и формируют побеги;
• · оптимальной средой для прорастания почек и для последующего культивирования побегов является среда МС с 1,5 мг/л БАП + 2 мг/л АК.

климатис эксплант почка стерилизация.

• 1. Stephen Oluwaseun Amoo Micropropagation and medicinal properties of Barleria Greenii and Huernia Hystrix // Submitted in fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of philosophy. Nigeria, 2009, с.
• 2. Насурдинова Р. А., Жигунов О. Ю. Дикорастущие клематисы в коллекции ботанического сада г. Уфы // Вестник ОГУ № 6, 2009, с. 272−274.
• 3. Клематисы от, А до Я.
• 4. Шевелуха В. С., Калашникова Е. А., Дегтярев С. В. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. Учеб./ Под ред. B.C. Шевелухи. — М.: Высш. шк., 1998, 110 с.
• 5. Избасаров Д. С., Клоконос Н. П. Технология оздоровления и размножения ягодных культур в Казахстане. — Алматы: Мектеп, 2002, с.
• 6. Коротков О. И. Формирование и комплексное изучение коллекции (род Clematis L.): биотехнологические и молекулярно-генетические аспекты.//Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. — Москва,
• 7. Сидякин А. И., Бугара А. М., Белова О. Н. Оптимизация состава питательных сред для индукции каллусообразования в культуре in vitro вегетативных органов ломоноса виноградолистного.// Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского/Серия «Биология, химия». Том 22 (61). 2009. № С. 71−77.
• 8. Mandegaran & V.K. Sieber Somatic embryogenesis in Clematis integrifolia x C.viticella. //Plant Cell, Tissue and Organ Culture 62: 163−165, 2000.