Оценка качества сырья, содержащего кумарины. 
Методы анализа

Методы выделения.

Для выделения кумаринов из растительного сырья обычно применяются различные растворители: метиловый и этиловый спирт, бензол, хлороформ, этиловый и петролейный эфиры. Спиртовое извлечение очищают от сопутствующих веществ осаждением раствором основного ацетата свинца.

Наиболее полная экстракция кумаринов как свободных, так и связанных (гликозидов) достигается этиловым спиртом.

Получаемый после отгонки спирта густой экстракт чаще всего последовательно обрабатывается растворителями: хлороформом, этиловым эфиром.

В некоторых случаях целесообразно растительный материал предварительно обрабатывать петролейным эфиром, а затем экстрагировать хлороформом, этиловым, метиловым спиртом.

Качественное определение.

Для обнаружения кумаринов в растительном сырье используют их лактонные свойства,.

• — вступать в реакцию разрыва лактонного кольца (лактонная проба);
• — давать окрашенные растворы с диазосоединениями;
• — флуоресцировать в УФ-свете.
• 1. Лактонная проба (предложена Г. А-Кузнецовой).

Реакция проводится c контрольным опытом.

Извлечение, содержащее кумарины, наливают в две пробирки.

В одну из них добавляют несколько капель 10%-ного раствора натрия гидроксида. Обе пробирки нагревают на водяной бане, затем в обе прибавляют 5 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают.

Если в пробирке, куда добавляли щелочь, раствор остался желтым и прозрачным, значит реакция положительна, так как образуется желтая растворимая в воде соль кумаровой кислоты.

В контрольной пробирке при добавлении воды раствор мутнеет, кумарины не растворяются в воде и выпадают в осадок.

При подкислении щелочного раствора лактонное кольцо замыкается и кумарины выпадают в осадок.

2. Реакция образования азокрасителя.

Реакция проводится с продуктами, полученными после разрыва лактонного кольца.

В пробирку добавляют несколько капель свежеприготовленного диазореактива.

Чаще всего в качестве диазореактива используют диазосульфаниловую кислоту. Образуется краситель от желтого до вишнево-красного цвета.

3. Для идентификации кумаринов используют методы бумажной и тонкослойной хроматографии.

При этом используют системы растворителей;

• — н-гексан-бензол-метанол (5:4:1);
• — петролейный эфир-бензол-метанол (5:4:1);
• — н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5).

Идентифицируют кумарины по характерной флюоресценции в УФ свете или проявляют хромогенными реактивами. В качестве проявляющих реактивов служат 1%-ный спиртовой раствор алюминия хлорида, 10%-ный раствор щелочи или пары аммиака.

Широкие возможности для обнаружения в растениях и сырье кумаринов, не только их суммы, но и отдельных соединений, открылись после внедрения хроматографического анализа. При этом указанные реактивы используют и для обработки хроматограмм.

4. Хроматографические методы удобны для выделения индивидуальных кумаринов.

Количественное определение.

Для количественного определения кумаринов в лекарственном РС используют гравиметрические, титриметрические и физико-химические методы анализа.

1. Гравиметрический (весовой) метод.

Основан на избирательной растворимости отдельных кумаринов в различных растворителях и способности лактонного кольца кумарина к раскрытию и обратному замыканию в зависимости от рН среды.

Используется редко только для определения суммы кумаринов.

2. Фотоэпектроколориметрический метод.

Основан на измерении оптической плотности окрашенного раствора, полученного по реакции азосочетания с солями диазония при определенной длине волны.

Содержание суммы кумаринов рассчитывают по калибровочному графику, построенному по известному веществу.

3. Спектрофотометрический метод.

Основан на способности кумаринов поглощать монохроматический свет при определенной длине волны в зависимости от концентрации исследуемого раствора.

Метод используется как для определения содержания суммы кумаринов, так и индивидуальных веществ.

Для определения содержания бергаптена и изопимпинеллина в плодах амми большой используют хроматоспектрофотометрический метод.

Получают хлороформное извлечение из плодов амми большой в аппарате Сокслета. Затем методом хроматографии на бумаге в системе растворителей н-гептабензол (4:1) проводят разделение кумаринов, после разделения бергаптен и, изопимпинеллин идентифицируют в УФ-свете по характерному свечению. Каждое вещество отдельно элюируют 95%-ным этанолом и измеряют оптическую плотность растворов с помощью спектрофотометра: бергаптен при длине волны 313 нм, изопимпинеллин — 311 нм. Рассчитывают содержание каждого соединения с учетом удельного показателя поглощения.