Общие принципы экспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета

Современная иммунология исключительно многолика, а сферы применения иммунологических знаний и методов беспредельно разнообразны. Они используются практически во всех разделах биологии, ветеринарии и медицины — от фундаментальных молекулярно-биологических исследовании до медико-генетического консультирования и множества других сугубо практических процедур, осуществляемых растениеводами, животноводами и медиками.

И, тем не менее, особенно важным в социальном отношении и методически наиболее передовым продолжает быть тот старейший и неуклонно развивающейся раздел иммунологии, успехами которого обеспечивается развитие теории и осуществление практики противоэпидемической работы—диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний. А методы иммунологической экспресс-диагностики имеют ключевое значение для эффективного решения названных проблем и осуществления всех соответствующих противоэпидемических мероприятий. Следующие ниже материалы и посвящены именно этому разделу прикладной иммунологии, его состоянию и перспективам развития.

Важнейшей предпосылкой эффективности любых противоэпидемических мероприятий является своевременное прогнозирование и обнаружение моментов активизации тех экологических и социально-экологических взаимодействий, которые составляют существо эпидемических процессов. Исключительное разнообразие, свойственное последним и требующее дифференциации противоэпидемических мероприятий, обусловлено не только самобытностью каждой из существующего множества инфекционных болезней. Очень большое значение имеет в этом отношении фундаментальное явление гетерогенности популяций, входящих в состав соответствующих экологических и социально-экологических систем микроб—жертва. Вариабильность этих весьма сложных биосоциальных факторов и условий в очень большой мере влияет на специфику того или иного этапа существования каждого эпидемического процесса. И своевременное распознавание этих особенностей, осуществляемое, как правило, с использованием иммунологических методов, обеспечивает ту дифференциацию противоэпидемических мероприятий, благодаря которой достигается надлежащее сочетание их эффективности и оправданности.

Активизация эпидемических процессов определяется, прежде всего, изменением соотношений между двумя основными параметрами экологических систем микроб—жертва, а 'именно между болезнетворными потенциями возбудителей соответствующих инфекций и иммунологическим статусом угрожаемых контингентов в целом и каждого из их членов в отдельности. Соотношения между этими параметрами определяют сроки и интенсивность активизации эпидемических процессов, а следовательно объем и характер противоэпидемических мероприятий. Состояние же этих параметров и соотношения между ними характеризуются главным образом с помощью иммунодиагностических методов, позволяющих оценивать состояния инфицированности и иммунности, как индивидуумов, так и коллективов. Вполне понятно, что наибольшую ценность имеют экспрессные методы иммунодиагностики.

Иммунологические методы экспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета в некоторых отношениях принципиально различны, но во многих других аспектах они являются практически едиными.

Методы экспресс-диагностики инфекционных заболеваний до недавнего времени развивались главным образом на основе классических схем микробиологического анализа, который сводится к выделению в чистой культуре возбудителя и последующей его идентификации по биохимическим, тинкториальным, антигенным и другим характерным свойствам. Многоэтапность этих анализов обусловливает их длительность и практически исключает экспрессность, удовлетворяющую эпидемиологическую и клиническую практику. Длительность микробиологического анализа составляет, как минимум, несколько дней.

Экспресс-индикация — это своеобразная разведка большой армии лабораторной диагностики. Она находится на переднем крае научного поиска новых, простых, экономичных, быстрых методов индикации микробов, часть из которых в дальнейшем идет на вооружение лабораторной практики и благодаря этому последняя все время совершенствуется.

Основные объективные требования к экспрессным методам диагностики инфекционных заболеваний сводятся к следующему:

• 1. получение результатов анализа в максимально короткие сроки (часы, идеально—минуты);
• 2. возможность проведения и завершения анализа без выделения искомого микроорганизма в чистой культуре, при использовании только нативного материала, в крайнем случае—с привлечением элективных биосред для быстрого накопления возбудителей;
• 3. бесспорно высокая специфичность и высокая чувствительность, как предпосылки надлежащей достоверности анализа;
• 4. высокая производительность, простота, доступность и воспроизводимость анализов. Эти требования в равной мере приложимы и к методам экспрессной диагностики состояний иммунитета.

Предпочтительность использования того или иного из существующих методов экспресс-диагностики зависит от многих конкретных условий. Однако наиболее желательным является параллельное использование 2—3 методов. Такой подход значительно увеличивает надежность получаемого результата.

На ближайшие годы наиболее перспективными следующие направления развития экспресс-индикации микроорганизмов.

1. Энзимоиндикационное направление, связанное с экспресс-индикацией биохимических свойств и определением ферментативного спектра микробов.

По-прежнему сохранят свою значимость исследования по разработке политропных (полисубстратных) питательных сред. В нашей стране были разработаны оригинальные политропные среды и их комбинации, которые с успехом применяются в лабораторной практике.

При создании сложных поликомпонентных питательных систем необходимо исходить из различных биохимических и энергетических потребностей микроорганизмов. Для лучшего проявления жизнедеятельности и биохимической активности патогенных и других микробов в средах необходимо создавать оптимальные условия для их роста и размножения и одновременно вводить ферментируемые субстраты (углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты и др.) с наиболее чувствительными индикаторами, которые быстро бы регистрировали их ферментацию. В результате применения оптимальных полисубстратных сред производится выделение и накопление чистой культуры микробов с одновременным определением их биохимических признаков.

Перспективным следует рассматривать развитие энзимоиндикационных методов, в которых субстрат с индикатором отделен от питательной среды и фиксирован на специальном носителе. В нашей стране разработаны углеводно-бумажные диски с защитной пленкой (бумажные реагенты для определения дезаминаз у микробов) и их аналоги БИС (бумажно-индикаторные системы), углеводно-бумажные поплавки, углеводно-полимерные пленки. Все эти препараты являются весьма перспективными, они позволяют в течение кратчайшего срока (3—5 ч), используя общепринятые питательные среды и лабораторную посуду, определять ферментативную активность различных видов микроорганизмов.

Автономный препарат — карандаш-фермент, не имеющий аналогов ни у нас, ни за рубежом, позволяет без применения питательных сред непосредственно на предметном стекле определять биохимические свойства микробов.

Полисубстратная тест-система и энзимоиндикаторная лента используются для одновременной идентификации 20 биохимических признаков у микробов. Это новые виды простых «долгоживущих» препаратов, предназначенных для быстрого и экономичного определения биохимических свойств микробов.

Электрофизический метод определения ферментативной активности микробов включает посев микробной культуры на жидкие питательные среды, содержащие пептонную воду, различные углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты с последующим ферментативным расщеплением исследуемых веществ и образованием различных ионизированных продуктов распада, обнаруживаемых специальной электронной аппаратурой. Результаты энзимоиндикации регистрируются через 45—60 мин с момента посева материала. Метод позволяет обнаружить и идентифицировать конечные продукты распада, то есть конечные мотаболиты с определением их биохимической и химической природы. Безусловно, электрофизический метод заслуживает пристального внимания и нуждается в дальнейшем изучении и доработке.

2. Иммунологическое направление, связанное с быстрым определением как отдельных специфических детерминант, так и с индикацией целых антигенных групп и комплексов, характеризующих роды, виды и серовары бактерий. К собственно иммунологическому направлению мы относим классические иммунологические методы, основанные на использовании естественных реагентов. Реакции преципитации в жидкости по Асколи и в геле по Оухтерлоню и Манчини (особенно их микроварианты) сохраняют свое значение как методы экспресс-индикации патогенных микробов и выявления их антигенов в различных материалах.

Перспективными являются рапид-системы для одновременной и быстрой индикации различных видов микроорганизмов в реакциях микроагглютинации, хотя по-прежнему не решены вопросы создания оптимальных видов и наиболее экономичных форм таких систем. Иммунологические принципы распознавания антигенов являются весьма тонкими, специфическими, чувствительными, с большими индикационно-диагностическими возможностями. Комплексирование иммунологических принципов с физическими, химическими и некоторыми другими принципами способствовало дифференциации иммунологического направления на ряд самостоятельных направлений, которые приводятся ниже.

3. Иммунофизическое направление, использующее различные по природе, форме и величине виды мелкодисперсных носителей (сорбентов) антигенов и антител, способствующих повышению чувствительности комплексных иммунологических методов.

Реакции пассивной гемагглютинации и их модификации связаны с использованием эритроцитарных диагностических препаратов. Эритроцитарную диагностику с успехом применяются для ускоренного обнаружения и идентификации как патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов (например, возбудителей туляремии, бруцеллеза, сальмонеллеза и др.) в различных патологических материалах, получаемых от больных, и в объектах внешней среды. Реакции с эритроцитарными диагностикумами являются весьма чувствительными, и в этом отношении часто превосходят другие серологические реакции. Они введены в официальные инструкции по экспресс-индикации бактериальных агентов в элементах внешней среды и в материалах, полученных от пораженных людей и животных.

Одновременно продолжаются поиски новых носителей антигенов и антител, которые были бы безантигенными, стабильными, не разрушающимися при длительном хранении, а применяемые реакции — простыми по технике постановки (например, стекольные тесты) и исследования с их помощью — экономичными.

Совершенствуются реакции с применением цветных целлюлозных частиц в качестве носителей антигенов и антител.

Положительными свойствами такого рода препаратов являются:

• 1) отсутствие собственной антигенности;
• 2) стабильность при длительном хранении;
• 3) демонстративность и простота техники постановки реакции, обычно на предметном стекле;
• 4) высокая скорость прохождения реакции;
• 5) экономичность.

Кроме того, полезным и оправданным считаем поиск новых носителей антигенов и антител. В этом отношении перспективными являются ионообменные смолы, латексы, целлюлоза и ее производные и ряд других веществ, которые могут способствовать повышению чувствительности серологических реакций.

4. Иммунохимическое направление, связанное с использованием разнообразных комплексных соединений специфических антител или антигенов с химическими веществами. Присоединенные химические вещества придают им новые феноменологические способности и свойства, тем самым, расширяя возможности экспресс-индикации микробных агентов в частности и лабораторного анализа вообще.

Большую популярность и практическую значимость приобрели методы быстрого иммунофлуоресцентного анализа (прямой, непрямой, антикомплементарный), которые ныне официально используются как методы экспрессной индикации и быстрого определения микроорганизмов.

Дальнейшее развитие весьма перспективного иммунохимического направления во многом зависит от химиков, которые должны разработать достаточно яркие новые красители, вступающие в соединения со специфическими антителами и антигенами. В результате могут быть получены препараты с новыми феноменологическими свойствами, позволяющими проводить экспресс-индикацию микробных культур и отдельных клеток с помощью широко распространенных микроскопических устройств (типа МБИ различных марок).

• 5. Иммуноферментное направление, интенсивно развивающееся в последние годы. Разработаны прямой, непрямой, антикомплементарный и другие методы быстрого обнаружения микробов путем использования иммуноэнзимологического принципа; предложены новые виды ферментов, а также разнообразные виды хромогенных субстратов. Данное направление является весьма перспективным, развитие его может привести в ближайшие годы к появлению новых методов экспресс-индикации микроорганизмов.
• 6. Иммуноэлектрофоретическое направление успешно развивается с конца 50-х годов. Разработаны многочисленные методы иммуноэлектрофореза. Однако для целей экспресс-индикации микробов чаще прибегают к встречному иммуноэлектрофорезу. Применение новых химических красителей, ферментной или радиоактивной метки позволит резко повысить чувствительность метода иммуноэлектропреципитации.
• 7. Иммунорадиологическое направление связано с использованием разнообразных конъюгатов специфических антител или антигенов, соединенных с радиоактивными веществами, которые придают им новые феноменологические свойства и способности, расширяя возможности экспресс-индикационного метода. Весьма перспективно дальнейшее развитие иммунорадиологического направления, так как оно несомненно приведет к созданию новых, простых методов экспресс-индикации микроорганизмов.
• 8. Микроцитологическое направление быстрого цитоморфо-логического анализа связано с использованием светлопольной, фазово-контрастной или люминесцентной микроскопии бактериологических мазковых препаратов, обработанных и окрашенных красителями, позволяющими быстро идентифицировать микроорганизмы по их морфологии и специфическим структурным элементам микробной клетки. Исследованию подвергают как нативный (гной, мокрота, моча, СМЖ, различные экссудаты и др.), так и обогащенный (например, центрифугированием, фильтрованием и другими методами) патологический материал.
• 9. Бактериологическое направление связано с ускоренным выделением и накоплением бактериальных популяций патогенных, условно-патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Оно основано на использовании оптимальных ростовых питательных сред, содержащих необходимые биостимуляторы, для ускоренного получения бактериальной культуры и частичной их идентификации по совокупности культуральных признаков.
• 10. Фагодиагностическое направление, которое предусматривает, с одной стороны, идентификацию микробов с помощью специфических индикаторных бактериофагов, а с другой, — обнаружение и индикацию специфических фагов в патологическом и другом материалах с помощью индикаторных микробных культур.

Ускоренная фагодиагностика в ряде случаев является необходимым и полезным методом, позволяющим значительно сократить сроки исследований и установить природу возбудителя даже в тех случаях, когда другими методами, в виду его изменчивости или загрязненности материала, он остается нераспознанным.

• 11. Биологическое направление, связанное с изучением токсических и агрессивных свойств патогенных микроорганизмов. Биологические методы осуществляются на одноклеточных организмах, на культурах клеток, куриных эмбрионах, а также на здоровых, а еще лучше специально подготовленных лабораторных животных. Эти методы более трудоемкие и менее точные по сравнению с другими.
• 12. Физико-химическое направление. Это направление связано с использованием сравнительно быстрых, но в то же время и достаточно сложных по аппаратурному оформлению методов. Сюда входят методы изучения бактериальных популяций и их экстрактов с помощью хроматографии (газожидкостная и др.), спектроскопии (инфракрасной, ультрафиолетовой и др.), резистографии в отношении различных антибиотических, химических и лекарственных веществ, а также методы температурной и кислотной агрегации, коагуляции микробных суспензий и их токсинов.
• 13. Рецепторное и генетическое направления быстрой индикации патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Методы, основанные на этих принципах, только начинают развиваться. Так, с помощью целлюлозно-глобулинового или эритроцитарно-глобулинового диагностикумов быстро обнаруживают патогенный стафилококк, содержащий белок А, а путем гомологии неизвестных нуклеиновых кислот с известными нуклеиновыми кислотами устанавливают вид патогена.
• 14. Комплексное направление ускоренной идентификации патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов, использующее методы экспресс-индикации, основанные на интеграции различных принципов, связано с разработкой и созданием индикаторных тест-систем, позволяющих в течение короткого срока и с минимальными затратами на анализ определить комплекс основных признаков патогена или санитарно-показательного представителя, достаточных для его идентификации до рода, вида и даже типа.
• 15. Направления, связанные с разработкой новых принципов микробиологического анализа. Вполне вероятно, и мы вправе ожидать в ближайшие 5—10 лет появления новых идей, подходов и принципов в микробиологической науке и смежных с ней областях. Открытие новых видов рецепторной, иммунологической и генетической специфичности у микробов позволит создать новые и возможно более совершенные методы быстрой идентификации микроорганизмов.

Основные пути развития экспресс-индикации микроорганизмов на ближайшие годы:

• 1) создание и конструирование новых препаратов, способствующих ускорению и удешевлению исследований, повышению эффективности лабораторной диагностики инфекций и индикации патогенных и других микроорганизмов. На этом пути предстоит сделать очень многое, поскольку общепринятые диагностические препараты в значительной степени исчерпали свои потенциальные возможности;
• 2) разработка новых более чувствительных, простых методов лабораторного анализа.
• 3) разработка комплексных методов и видов исследований. Будет продолжаться дальнейшая интеграция методов и видов исследований, имеющих разные принципы действия, лежащие в их основе;
• 4) создание новых схем исследований. Поскольку лабораторная диагностика инфекционных болезней, а также экспресс-индикация, хотя и в меньшей степени, связаны с изучением комплекса различных свойств и особенностей микроорганизмов с использованием обычно разнообразных методов и приемов, основанных на различных принципах, то создание новых схем исследований с применением новых методов является объективной реальностью и важной задачей, вытекающей из существа самого процесса развития микробиологического анализа;
• 5) разработка и создание новых методов регистрации и учета результатов экспресс-индикационных и лабораторных исследований.
• 6) разработка новой микроминиатюрной лабораторной посуды, аппаратуры и приборов для исследований;
• 7) автоматизация и компьютеризация исследований.

В современных условиях эти вопросы должны решаться комплексно.

Таким образом, рассмотренные основные направления и пути развития экспресс-индикации микроорганизмов в период современного научно-технического прогресса естественных наук безусловно получат дальнейшее ускоренное развитие, а микробиологическая лабораторная практика обогатится новыми быстрыми методами индикации микробов.