Определение микробной биомассы

Измерение биомассы применяют для подсчета урожая микроорганизмов, понимая под биомассой сухую массу живого материала, выраженную в единицах веса (г/л). Измерение биомассы природных проб часто не приводит к желаемым точным результатам вследствие большого количества побочных эффектов, связанных с отбором проб и их измерением. Поэтому для определения биомассы в природных образцах наиболее приемлемы методы, связанные с определением биохимических параметров клеток. Они предполагают, что количество измеряемого компонента одинаково для всех видов клеток, что, конечно же, идеализировано. Поэтому измерения биохимических параметров биомассы необходимо экстраполировать с осторожностью.

При измерении биомассы наиболее популярно измерение количества АТФ и общего содержания адениновых нуклеотидов с последующим пересчетом на содержание углерода клетки или веса сухой биомассы. Метод позволяет быстро и точно (с люциферин/ люциферазной пробой) измерить содержание АТФ в образце. Количество АТФ строго соответствует биомассе живых клеток, так как после их отмирания пул АТФ в ней резко снижается или исчезает вовсе. Общий пул аденилатов (А_т = АТФ + АДФ + АМФ) не зависит от метаболического состояния клетки и более полно соответствует содержанию биомассы в анализируемой пробе.

Другим способом является измерение содержания компонентов клеточных стенок — мурамовой кислоты (МК) или липополисахаридов. Мурамовую кислоту гидролизуют для высвобождения лактата, который определяют энзиматически. Установлено, что все грамположительные бактерии содержат 44 мкг МК/мг С клетки, тогда как для грамотрицательных клеток это соотношение равно 12 мкг/мг С.

Для оценки содержания грибной биомассы используют определение концентрации хитина, на точность метода влияет количество почвенных членистоногих и насекомых.

При отсутствии в пробе растений можно определять биомассу фототрофных водорослей и бактерий, измеряя количество хлорофилла. По концентрации хлорофилла а судят о содержании биомассы водорослей и цианобактерий после экстракции пробы хлороформ-метанольной смесью с последующим измерением поглощения при 665 нм. Поглощение того же экстракта, измеренное в максимуме при 850 нм, будет отражать количество всех бактериальных хлорофиллов — таким образом оценивают количество пурпурных фототрофных бактерий. Содержание различных хлорофиллов можно измерять и по спектрам флуоресценции.

Концентрация ДНК в клетках микроорганизмов довольно постоянна, и определение ДНК может способствовать определению биомассы. В природных образцах, где чувствительность метода определения ДНК имеет первостепенное значение, применяют пробы с флуоресцентными красками, такими, как этидиум бромид или Hoechst 33 258 с использованием спектрофлуорометрии. Перед измерением необходима тщательная очистка тотальной ДНК. Необходимы также контроли на наличие эукариотической ДНК.

Белок определять легко, а бактериальные гемопротеины имеют характерную хемилюминесценцию. При определении белка следует, однако, убедиться, что фоновые концентрации белков незначительны. Поскольку различные микроорганизмы содержат очень разные количества белка, определение этого компонента биомассы целесообразно проводить в ситуациях, когда в пробе присутствует один вид микробов.

Определение липидов служит хорошим маркером для учета биомассы, поскольку все клетки окружены мембранами, содержащими липиды. Количество эргостерола в пробе отражает содержание грибов, так как его практически не содержат ни растения, ни археи с бактериями. Определение содержания и состава метиловых эфиров жирных кислот фосфолипидов (МЭЖК) позволяет наряду с оценкой общей биомассы специфически количественно оценить содержание той или иной группы микроорганизмов в образце, взятом из природных ниш.

Физиологические подходы к определению биомассы основаны на измерении дыхания пробы после добавления субстрата или на измерении количества С0₂, выделившегося после разложения микробной биомассы после стерилизации пробы при добавлении хлороформа. Оба метода требуют постановки многочисленных контролей.