Методы исследований. 
Отбор эффективных штаммов клубеньковых бактерий Rhizobium trifolii для инокуляции семян клевера лугового

Стерилизация и проращивание семян клевера Отбирали нужное количество семян. Заливали концентрированной серной кислотой так, чтоб покрыть слой семян и выдерживали в течение 1 мин. Затем промывали семена водопроводной водой и несколько раз стерильной водой. В стерильные чашки Петри закладывали стерильные фильтры в асептических условиях и, стерилизуя пинцет обжиганием в спирте, выкладывали семена на фильтры, увлажняли стерильной водой. Пинцетом убирали воздух из-под фильтра, чтобы он плотно примыкал ко дну чашки Петри. Далее равномерно распределяли семена на фильтре, периодически стерилизовали пинцет обжиганием в спирте.

Чашки закрывали и ставили в термостат для проращивания семян при 27 °C в течение 3 суток, проростки ежедневно увлажняли.

Получение культуральной жидкости штаммов клубеньковых бактерий Биомассу штамма клубеньковых бактерий, полученную на скошенном бобовом агаре одной пробирки, смывали 10 мл стерильной питательной среды. Полученную суспензию переносили в коническую колбу с 50 мл жидкой бобовой среды. Посевы инкубировали в роторной качалке при 28 оС в течение 48 часов. По истечении срока культивирования делали высевы культуральной жидкости методом предельных разведений на чашки Петри с агаризованной бобовой средой методом Коха. Для подсчёта колониеобразующих единиц культуру на чашках оставляли для выращивания в термостате при 28 °C на 72 ч. Полученную культуральную жидкость использовали для инокуляции семян для изучения ростстимулирующего действия штаммов ризобий следующим образом: семена с/х культур обрабатывали культуральной жидкостью, инкубировали в термостате в течение 2 часов, затем смывали стерильной водой и раскладывали на стерильные фильтры в чашках Петри. Проращивали 3 суток. Затем проростки внедряли в среду Jensen в пробирках и выращивали в условиях светокультуры в течение трёх недель. Вели учет длины и веса 100 проростков.

Инокуляция проростков клевера клубеньковыми бактериями R. trifolii 9.

Проростки клевера внедряли в агаризованную среду Йенсена в пробирках. Проростки инокулировали 0,2 мл культуральной жидкости 3-суточной бактериальной культуры клубеньковых. За ростом и развитием клевера наблюдали в условиях светокультуры (освещенность 104 лк, t = 20−25 0C, длина светового дня — 12 ч) в течение одного месяца. Определяли симбиотические свойства выделенных изолятов: вирулентная и нодулирующая способность.

Выделение и отбор R.trifolii.

Выделение изолятов клубеньковых бактерий проводили из клубеньков, сформировавшихся на корнях клевера в условиях светокультуры в результате инокуляции семян почвенной суспензией. Отбор наиболее эффективных изолятов клубеньковых бактерий проводили по симбиотической активности (Доросинский, 1970).

Метод определения азотфиксирующей активности Rhizobium.

Для определения азотфиксирующей активности клубеньков отбирали растения, выращенные в условиях светокультуры в течение 45 суток, в период бутонизации — цветения, в пик предполагаемой активности клубеньковых бактерий. Растения извлекали из среды Jensen, корни с клубеньками обмывали водопроводной водой и просушивали фильтровальной бумагой. Затем помещали в пенициллиновые флаконы, закрывали стерильной резиновой пробкой, герметично зажимали флаконы стаперами. Через резиновую пробку вводили ацетилен в количестве 10% от объема склянки и инкубировали в течение часа при 27 єС. Затем процесс останавливали, путем введения во флакон 2 мл реактива Несслера. Через 2 минуты отбирали пробу газа из флакона шприцом. Содержание этилена в образцах определяется путем анализа экспериментальных проб в сравнении с эталоном — контроль показателей точности измерений содержания этилена — С2H4 на газовом хроматографе Хром-5. Использовали компьютерную установку и на основании программы L-net системы UniChrom и определяли содержание этилена С2H4 в нМ образцах проб (Кириченко, 2001).

Учет количества колониеобразующих единиц, выросших на плотной питательной среде (Кожемяков, 1982) и изучение динамики роста бактериальных культур проводили методом предельных разведений и посева на плотные питательные среды (по Коху, 1881) Для этого:

• 1) на чашки с агаризованной средой наносили 50 мкл соответствующего разведения исследуемой культуры,
• 2) стеклянным шпателем осуществляли равномерное распределение капли бактериальной суспензии по поверхности агара,
• 3) чашки Петри помещали в термостат с температурой 30 єС,
• 4) повторность опыта — 3-х кратное,
• 5) учет количества выросших колоний микроорганизмов производили через 4−5 суток.

Хранение клубеньковых бактерий на скошенном бобовом агаре осуществляли посев клубеньковых бактерий на скошенную агаризованную бобовую среду. Посевы инкубировали при 28 єС в течение 3 суток (быстрорастущие). Хранение культуры — 2−3 месяца в холодильнике при температуре 5 єС.

Изучение влияния инокуляции семян с/х культур медленно и быстрорастущими клубеньковыми бактериями на их рост и развитие Оценка влияния продуктов жизнедеятельности клубеньковых бактерий клевера на показатели роста и развития с/х культур (сухой вес и длина проростков) проводили по методам, изложенным в руководстве Ю. М. Возняковской (Возняковская, 1999): бактериальную суспензию штаммов клубеньковых бактерий R. Trifolii готовили следующим образом: биомассу микроорганизмов, полученную смывом с 1 косяка с бобовым агаром, ресуспендировали в 10 мл стерильной воды и наносили на исследуемые семена различных с/х культур: не бобовые — кресс-салат, горчица, рапс, пшеница, рожь, редис, огурец, бобовые — вика, люпин, горох, фасоль, клевер. Затем замоченные семена инкубировали при 28 єС в термостате. Через 6 часов семена отмывали от бактериальной суспензии водопроводной водой на воронке с фильтром. Затем раскладывали в чашки Петри на увлажненные фильтры. Проращивали в течение 3−5 суток. Учитывали сухой вес и длину проростков. Контролем служили семена с/х культур, замоченные в воде. Проростки внедряли в полужидкую среду Jensen. Количество семян, используемых для опыта: бобовых — 150 штук, не бобовых — 150 штук (Badnoch — Jones, 1998).

Статистическую обработку данных проводили по Рокицкому.

Скорость размножения бактерий оценивалась по рассчитанному периоду удвоения числа клеток (время генерации g), а также по показателю средней удельной скорости роста µср (Ждан-Пушкина, 1983). Расчет производили по формулам [1], [2]:

µср.=2,3(lgXn-lgX0)/(tn-t0), (1).

где X1 — титр в точке n;

Xo — исходный титр культуры;

µср. — средняя удельная скорость роста, час-1.

g =ln2/µ=0,693/µ, (2).

где g — время генерации, час;

Хранение клубеньковых бактерий.

Хранение клубеньковых бактерий клевера осуществляли на скошенной агаризованной бобовой среде в течение 3-х месяцев при температуре + 5 єС.