Методы идентификации индивидуальных биополимеров-ДНК, РНК

Все более широкое применение в восстановительной медицине находят методы клинической диагностики ДНК. Достижения в области молекулярной биологии углубили знания об экспрессии генов и причинах многих болезней, способствовали разработке новых подходов к диагностике и лечению таких болезней.

Установлено, что вариабельность (полиморфизм) генов широко распространена в популяции людей. Показана взаимосвязь между изменениями в структуре ДНК и многими болезнями. Идентификация генов, нарушение работы которых приводит к развитию наследственных заболеваний, создала предпосылки для подробного анализа генетических и биохимических основ патогенеза этих заболеваний и разработки наиболее эффективных методов лечения.

Методами молекулярной медицины получены вакцины для предотвращения гепатитов, инсулин человека — для лечения сахарного диабета, фактор VIII — для восстановления нормального свертывания крови и лечения гемофилии, а также многие другие препараты.

С помощью генной терапии оказалось возможным вводить в организм больного полноценно работающие гены для восстановления метаболических нарушений, вызванных мутантными генами. Этим способом осуществляется лечение детей с иммунодефицитом, вызванным дефектом структуры фермента аденозил дезам и назы. На стадии клинических испытаний находятся методы генокоррекции таких наследственных болезней, как семейная гиперхолестеринемия, гемофилия В и некоторые другие заболевания.

Для выявления дефектов в структуре ДНК она должна быть выделена из соответствующей биопробы (биологической жидкости, биоптата, культуры клеток) и «наработана» в количествах, достаточных для исследования. Для генотерапии необходимо выделение нормальных генов и введение их в дефектные клетки таким образом, чтобы они экспрессировались, позволяя восстановить здоровье пациента.

ДНК может быть выделена из любого вида тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл и мембран с помощью цен грифугирования, ферментативное разрушение белков протеиназами и экстрагирование ДНК из раствора с помощью фенола и хлороформа. Затем Д1IK осаждают, как правило, этанолом и после удаления надосадочной жидкости растворяют в буферном растворе.

Оценку качества экстрагированной ДНК проводят спектрально на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения, т. е. при длине волны 280 и 260 нм соответственно. Для чистых образцов ДНК соотношение оптических плотностей, полученных при 260 и 280 нм, должно быть порядка 2.

Молекула ДНК одной хромосомы среднего размера содержит 150 млн (150−10⁶) пар нуклеотидов и имеет длину около 4 см. Молекулярные нити такого размера чувствительны к механическим воздействиям при выделении из раствора и часто фрагментируются — расщепляются на фрагменты. В ходе выделения получают молекулы ДНК значительно меньше исходных, но все равно содержащие тысячи или десятки тысяч пар нуклеотидов. Такие молекулы неудобны для исследования, и их приходится дополнительно фрагментировать.

Для фрагментирования ДНК используют ферменты, расщепляющие ДНК, рестриктазы или рестрикционные эндонуклеазы, выделенные из бактериальных клеток. В бактериальных клетках (in vivo) эти ферменты определяют (узнают) и разрушают чужеродные ДНК, расщепляя их на небольшие фрагменты.

Рестриктазы распознают специфические последовательности из 4−6, реже 8−12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК (сайты рестрикции) и «разрезают» ее в местах локализации этих последовательностей. Количество рестрикционных фрагментов ДНК при использовании одной рестриктазы зависит от числа сайтов рестрикции, а размер фрагмента определяется положением этих сайтов по всей длине исходной молекулы ДНК.

Известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый из этих ферментов распознает свою специфическую последовательность. С помощью набора рестриктаз можно разрезать молекулу ДНК на фрагменты нужной длины.

Например, для изучения первичной структуры ДНК (метод секвенирования) удобны фрагменты, состоящие примерно из 300 пар нуклеотидов. Следовательно, молекулу ДНК одной хромосомы, содержащую 150−10⁶ пар нуклеотидов, нужно разрезать на 500 000 фрагментов и каждый из фрагментов изучать отдельно.

Полученные при рестрикции фрагменты ДНК могут быть исследованы методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Определяют ДНК в геле по ультрафиолетовым спектрам после обработки бромидом этидия, связывающимся с фрагментами молекулы и дающим специфическое розовое окрашивание.

При обработке геномной эукариотической ДНК, в частности ДНК человека, рестриктазами образуется много фрагментов различной длины. Идентификацию специфических последовательностей во фрагментах ДНК в геле проводят после разделения с помощью электрофореза путем гибридизации с мечеными ДНКзондами, которые представляют собой фрагменты однонитевой ДНК длиной свыше 100 нуклеотидных звеньев со строго определенной первичной структурой. Синтез ДНК-зондов осуществляется в автоматизированных машинах. Такие молекулы можно использовать для специфического связывания с исследуемыми участками фрагментов.

Высокочувствительным методом идентификации участков ДНК является метод блот-гибридизации по Саузерну. Суть метода заключается в том, что сплошной ряд полосок из фрагментов ДНК, полученный в результате их разделения по молекулярной массе в гелях, подвергается денатурации и переносится с геля на нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану. Перенос, или блоттинг, осуществляется за счет капиллярных сил, электрического поля или вакуума. Фиксированную на фильтре ДНК гибридизируют с ДНКили РНК-зондом. Затем методом радиоавтографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме.

Для установления первичной структуры ДНК (секвенирование ДНК) разработаны эффективные и экономичные методы. В одном из них из 4 нуклеозидтрифосфатов (dATO, бГТФ, (1СТФ, сПТФ) синтезируют набор олигонуклеотидов (например, октонуклеотидов), включающих все возможные варианты последовательностей. Эти октонуклеотиды иммобилизуют путем связывания с носителем. В результате создается олигонуклеотидная матрица. Секвенируемый фрагмент ДНК метят радиоактивной меткой по фосфатному остатку и добавляют в ячейки с разными матрицами. Изучаемый фрагмент ДНК связывается (гибридизируется) только с теми октонуклеотидами, последовательности которых комплементарны этому фрагменту. Таким образом определяется набор всех возможных октонуклеотидов, присутствующих в исследуемом фрагменте ДНК. Далее при помощи специальной компьютерной обработки упорядочивается расположение октомеров во фрагменте ДНК.

Все методы разделения смесей основаны на том, что разделяемые компоненты в результате каких-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга.

Наиболее производительные процедуры разделения основаны на различном распределении веществ между двумя фазами. Любая такая процедура приводит к разделению исходной смеси на две части (фракции), в одну из которых преимущественно или полностью переходит выделяемый компонент.

Ввиду исключительной сложности смесей, с которыми имеют дело биохимики, на первых этапах разделения в подавляющем большинстве случаев фракция, содержащая выделяемое вещество, содержит множество других компонентов, т. е. происходит лишь частичная очистка (обогащение смеси искомым компонентом).

Выделение индивидуальных биополимеров — ДНК, РНК, белков — является поэтому многоступенчатым процессом. На каждой ступени разделения должна получаться фракция, более богатая выделяемым веществом, чем на предыдущей ступени, и содержащая меньшее число побочных компонентов. Такой процесс часто называют фракционированием.

На каждой стадии разделения, включая начальную, биополимер находится либо в виде раствора, либо в виде осадка.

К методам разделения смесей относятся осаждение, фильтрование, экстракция, сорбция, гель-фильтрация, диализ, ультрафильтрация, хроматография, высаливание.

Как при выделении и очистке биополимеров, так и при проведении разнообразных исследований необходимо количественное определение содержания биополимера в полученной фракции, в выделенном или исследуемом образце. Биохимические исследования проводятся, как правило, с очень небольшим количеством материала и поэтому требуют высокочувствительных методов измерения. Наиболее широко распространенные методы основаны на измерении оптического поглощения (спектрофотометрия), радиоактивности (радиохимические методы) или свечения образцов (люминесцентные методы).

Особенно революционизирующее влияние на экспериментальные возможности биохимии оказало применение ферментов матричного биосинтеза, в первую очередь ДНК-полимераз. Аналитические возможности в биохимии нуклеиновых кислот неизмеримо возросли с появлением метода амплификации, т. е. размножения молекул ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов с помощью ДНК-полимеразы. Благодаря применению прямой и обратной транскрипции многие методы, разработанные для ДНК, перенесены на рибонуклеиновые кислоты.

Способность живых ор[анизмов и самих молекул ДНК к размножению позволила привлечь селекционные методы для решения биохимических задач. Возможность вырезания из ДНК определенных генов, получения их путем обратной транскрипции матричных РНК и разработка методов искусственного химикоферментативного синтеза генов позволили манипулировать генами, в том числе вставлять их в плазмиды или вирусы, а затем вносить их в микроорганизмы для последующего размножения.

С помощью микробиологических методов разработаны методы селекции тех популяций микроорганизмов (клонов), которые выросли из отдельных клеток, несущих желаемые признаки, например способных продуцировать определенные белки, не свойственные этим организмам. Гак родилась генная инженерия, которая не только открыла новые горизонты в биотехнологии, но и стала важнейшим инструментом биохимических исследований.

Селекция ДНК или РНК из искусственно созданной смеси огромного числа различных молекул нуклеиновых кислот с последующим размножением отобранных ДНК методом амплификации открыла путь к созданию нуклеиновых кислот с самыми разнообразными заданными свойствами.

Вопросы и задачи к гл. 9

1. Используя уравнения, записанные в словесной форме, и зная химическую структуру каждого промежуточного продукта, запишите последовательность химических превращений (метаболический путь), из которых состоит процесс расщепления глицеральдегид-3-фосфата до этанола.

Глицеральдегид-З-фосфат +Р + NAD —О-Фосфоглицероилфосфат+NADH+bf,.

Фосфоенол пиру ват + ADP —? Пируват + А ГР, Этанол + NAD «-* Ацетальдегид + NADH + Н⁺,.

З-Фосфоглицероилфосфат + ADP —? З-Фосфоглицерат + АТР,.

• 2-Фосфоглицерат «-> З-Фосфоглицерат,
• 2-Фосфоглицерат «-> Фосфоенолпируват + Н2О,

Пируват —* СО2 +Ацетальдегид.

Изобразите данный метаболический путь. Укажите, как связаны между собой отдельные части этого пути.

• 2. Напишите уравнения химического баланса для последовательности реакций, в ходе которых происходит расщепление D-глюкозы на две молекулы D-глицеральдегид-3-фосфата (первая стадия гликолиза).
• 3. Напишите уравнения химического баланса для последовательности реакций в процессе превращения гл и церальде гид-3-фосфата в лактат (вторая стадия гликолиза). Напишите также суммарное уравнение для второй стадии гликолиза и укажите суммарное изменение стандартной энергии Г иббса для этой стадии.
• 4. Скелетные мышцы почти полностью обеспечиваются энергией за счет распада глюкозо-1-фосфата (см. разд. 9.1), который образуется при расщеплении накопленного в мышцах гликогена. Скорость выработки энергии (в форме АТР) во время физической работы лимитируется скоростью распада гликогена с образованием глюкозо-1-фосфата. Скорость распада гликогена составляет 20−50 мкг/мин на 1 г мышечной ткани. Рассчитайте, как долго может бежать спортсмен, если известно, что в его мышцах содержится 1% гликогена.
• 5. Чем объясняется разогрев и повышение температуры тела при интенсивной работе?
• 6. Как зависит количество митохондрий в клетках от интенсивности нагрузок на организм?
• 7. Каким путем идет биосинтез белка после травм и ранений в регенерируемых тканях?
• 8. Из какого вещества активно синтезируется глюкоза в период восстановления после интенсивной мышечной работы?
• 9. В результате каких процессов катаболизма уменьшается мышечная масса при длительном голодании?
• 10. В чем заключается конечный эффект действия адреналина при интенсивной мышечной работе?
• 11. Каков механизм действия глюкагона при физических нагрузках?
• 12. Почему перед физической нагрузкой, например перед спортивными состязаниями. предпочтительнее съесть сладкую, а не жирную пищу?