Сбор образцов. 
Экология микроорганизмов

Для определения численности и активности микробных популяций в различных экосистемах разработаны многочисленные методологические подходы. При изучении микроорганизмов в природных образцах (общее число, число сообществ, их метаболические активности) репрезентативные части образца анализируют и результаты проецируют на сообщество в целом или экосистему. Термин «репрезентативный» отражает тот факт, что проба показывает разнообразие и плотность организмов общего местообитания, из которого взята проба. Во многих местообитаниях распределение микрорганизмов не гомогенное, а скорее кластерное, поэтому любая взятая проба, несомненно, точечная по отношению к изучаемому местообитанию (пространству), может содержать и много, и мало микроорганизмов, что приведет к неверной экстраполяции результатов. В особенности это верно для микроорганизмов, которые живут в условиях микроокружения, о чем экспериментатор может во время отбора пробы и не догадываться.

Обработка сложных проб, приготовленных из собранных индивидуальных проб с использованием специальных смесителей, позволяет минимизировать ошибку. Уровень достоверности при экстраполяции данных соответствующих проб на всю эконишу необходимо подкреплять статистическим анализом. Важно помнить, что каждое измерение состоит из трех фаз: 1) сбор образцов; 2) подготовка проб; 3) собственно измерение. При интерпретации результатов должны быть критически рассмотрены все три стадии пробообработки.

Различнее подходы применяют при отборе проб из таких сложных и разнообразных местообитаний, как кишечник животных, поверхностный слой почвы, воды озер, глубоководные осадки морей. Невозможность вплотную приблизиться к месту отбора проб заставляет придумывать различного рода пробоотборники для дистанционного забора проб.

Методы отбора проб и их хранение не должны изменять количества клеток или их активности в большую или меньшую стороны. Исследователю важно быть уверенным, что отобранные образцы репрезентативны и не загрязнены посторонними микроорганизмами, поэтому способ отбора пробы должен гарантировать наличие в ней микроорганизмов лишь из нужного местообитания.

Пробы почвы отбирают обычно с соблюдением минимума асептики, так как количество микроорганизмов в поверхностных почвенных горизонтах во много раз больше, чем в воздухе или нестерильном (но чистом!) контейнере для образца. Для сбора образцов со значительной глубины отбирают керн, который высверливают вручную или с помощью специальных механизмов, и внутри керна находят нужные зоны, уже работая асептически в лаборатории.

Для отбора проб почвенных микроорганизмов, находящихся в относительно небольшом количестве, применяют «аттрактанты», или «наживки». В некоторых случаях в почву опускают чистые стекла или стекла со специфической агаризованной средой, на которой развиваются нужные микроорганизмы (стекла обрастания, по Холодному). Чистые стекла, не обладающие селективными свойствами, используют для подсчета прикрепившихся микроорганизмов в почвах или осадках. В этом случае стекло служит аналогом минеральных частиц почвы (кварц) и отражает микробное разнообразие неселективно.

Еще один вариант стекол обрастания — плоскопараллельные капилляры, впервые разработанные Перфильевым. Их называют также педоскопы — при погружении в почву, и пелоскопы — при погружении в донные осадки. Капилляры открыты с обоих концов, и микроорганизмы могут свободно перемещаться внутри них. Часто капилляры заливают средой (аттрактант), селективной для той или иной физиологической группы микроорганизмов. Преимущество плоских капилляров в том, что их содержимое можно рассматривать под микроскопом непосредственно, а плоская стенка сводит к минимуму искажение и преломление света при прохождении через капилляр. Применение капилляров Перфильева позволяет проводить прижизненные наблюдения за развитием почвенной или осадочной микробиоты, дает возможность вести непрерывные (с помощью автоматической кинокамеры, рассчитанной на определенное число снимков в час или день) исследования развития микробных популяций, не опасаясь подсыхания препарата, расширяет поле деятельности экспериментатора с внесением разного рода питательных веществ с одного конца капилляра, делая его проточным. Такие капилляры позволяют следить за развитием анаэробного сообщества без применения сложной техники анаэробного культивирования. Капилляры помогают наблюдать за прижизненным развитием экосистем в природных условиях, не нарушая их целостности, и дают возможность обнаруживать необычные морфологические формы пока нскультивируемых микроорганизмов.

Различные методы разработаны для отбора проб воды. Проблем с отбором водных образцов обычно бывает больше, чем с почвенными пробами, поскольку практически всегда пробы воды отбирают на значительном удалении от экспериментатора. При этом возникают большие проблемы в соблюдении стерильности, поскольку открытые водные пространства содержат немного микроорганизмов, и эти пробы легко загрязнить неестественной микробиотой самого прибора для отбора проб. Каждый из разработанных пробоотборников имеет свои преимущества и недостатки. Целью создания часто довольно сложных приспособлений является уверенность, что проба воды действительно отобрана из нужного места, например с глубины 100 м. Разработанные образцы водных пробоотборников включают вакуумированные бутыли, которые заполняются водой на определенной глубине с помощью грузика-мессенджера, разбивающего водозасасывающий капилляр. Другой вариант содержит стерильный пластиковый пакет, раскрывающийся с помощью пружины на определенной глубине после опускания груза с поверхности, одновременно приводящим в движение пружину и бритву, вскрывающую отверстие в пакете. Существует пробоотборник с укрепленными на разной глубине стерильными шприцами, в которые одновременно засасываются пробы воды. Такие приспособления применяют обычно для отбора проб из неглубоких стратифицированных озер. С глубоководными пробами необходимо предусматривать возможность декомпрессии организмов при подъеме на поверхность. Разработанные пробоотборники позволяют открывать и закрывать входные отверстия на глубине, препятствуя падению давления внутри пробы при подъеме.

Пробы осадков отбирают с поверхности скребками или ковшами, однако такие способы не позволяют уберечь пробы от загрязнения посторонней микрофлорой. С соблюдением асептики можно отбирать пробы-керны, которые затем в лаборатории в стерильных условиях делят в вертикальном направлении, что позволяет прослеживать динамику осадков по горизонтали. Наиболее точно отбирают пробы морских осадков с использованием миниатюрных двух-трехместных подводных лодок, которые погружаются на глубину до 3 км, и там с помощью манипуляторов и специальных сверл отбирают пробы осадков в точно локализованном участке (особенно это важно в местах подводных термальных источников или «черных курильщиков»). Использование миниподлодок позволяет не только отбирать пробы, но и обрабатывать их нужным образом на месте отбора (например, вводить радиоизотопы), оставляя на месте для инкубации с последующим подъемом на поверхность для анализов.

Отбор проб воздуха необходимо проводить с применением аппаратов, которые минимально травмируют живые клетки микроорганизмов, находящиеся обычно в мельчайших капельках аэрозолей. Пассивная седиментация, позволяющая подсчитать количество осевших (и образовавших колонии) клеток микроорганизмов на поверхности открытых чашек Петри с агаризованной средой, пригодна для подсчета количества спор грибов, но не для количественного учета находящихся в воздухе бактерий. Чаще всего пробы воздуха отбирают пропусканием его определенного объема через бактериальные фильтры, размер пор которых можно варьировать для дифференциации микроорганизмов воздуха по размеру. Некоторые приборы (аппарат Кротова) сконструированы таким образом, что они направляют поток засасываемого воздуха при отборе пробы на поверхность открытой чашки Петри с агаризованной средой, на которой, как считают, осаждаются все частицы, взвешенные в воздухе, включая микроорганизмы.

Пробы биологических образцов растений или животных включают сбор биологических жидкостей (растительный сок, кровь, моча, лимфа, мокрота), выделений (каловые массы) или проб с поверхности объекта, а также внутренних органов (биопсии). С поверхностей микроорганизмы смывают или счищают стерильным буферным раствором или физиологическим раствором (0,85%-й раствор NaCl в дистиллированной воде) стерильными ватными тампонами. В других случаях микроорганизмы сохраняют непосредственно в образцах тканей, что важно для наблюдения их топографического распределения в тканях или количественного учета. Иногда анализы образцов проводят непосредственно под микроскопом (сканирующая электронная микроскопия) для рассмотрения взаимодействия микробных сообществ или изучения ассоциаций между животными, растениями и микробиотой.