Методы прямого переноса генов в клетку

В качестве реципиентов, в геном которых встраиваются чужеродные гены, используют клетки культуры, эмбриональные клетки млекопитающих, дрозофилы, пронуклеусы млекопитающих; у растений — протопласты, изолированные клетки и ткани, микроспоры, незрелые зиготические зародыши, проростки.

Для введения генетического материала в клетки разных организмов применяют ряд общих методов прямого переноса, таких, как трансформация, электропорация, микроинъекция и др.

Трансформация — метод введения рекомбинантной ДНК в клетку благодаря увеличению проницаемости ее клеточной оболочки (вероятно, за счет локального разрушения последней). Клетки обрабатывают ледяным раствором СаС1₂, а затем выдерживают при температуре 42 °C в течение 1,5 мин.

Трансдукция — процесс переноса (передачи) бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом. Общая трансдукция используется в генетике бактерий для картирования генома и конструирования штаммов.

Трансфекция — метод предполагает введение ДНК, адсорбированной на кристаллах фосфата кальция (кальциевый преципитат), в клетку путем фагоцитоза. Для трансфекции используют и ДЭАЭ-декстран — полимер, адсорбирующий ДНК. Эффект вхождения в клетки и время экспрессии высоки, но частота стабильной трансформации ниже, чем при использовании преципитата кальция. Частоту трансфекции увеличивает глицериновый шок (4 мин в 15%-м растворе глицерина в HEPES-буфере).

Электропорация — метод заключается в воздействии импульсов высокого напряжения электрического тока на клеточную мембрану, которое, скорее всего, вызывает временное образование большого количества пор, что обратимо увеличивает проницаемость мембран. Через образующиеся на короткое время поры чужеродная ДНК проникает в клетку. Это простой, эффективный и воспроизводимый метод. С его помощью были получены трансгенные растения кукурузы, риса и сахарного тростника.

Микроинъекции ДНК — метод позволяет с помощью тонких микроигл и микроманипулятора вводить в клетку или прямо в ядро векторную ДНК с включенным в нее трансгеном. С помощью микроинъекций осуществляется трансформация у дрозофилы и растений (ячмень, капуста). Метод, разработанный в начале 1970;х гг. А. Андерсоном и Г. Диакумакосом, дает небольшой выход трансформированных клеток. Его преимуществом является возможность вводить любую ДНК в любые клетки; кроме того, для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.

Упаковка в липосомы. Липосомы — сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами. Липосомы, содержащие внутри рекомбинантную ДНК, способны непосредственно сливаться с мембраной клетки или поглощаться клетками. В клетке происходит разрушение оболочки липосом и высвобождение ДНК. Это один из методов, позволяющих защитить трансформированный генетический материал от разрушения нуклеазами, присутствующими вне клеток. Метод применяется для введения нуклеиновых кислот в культивируемые животные клетки и растительные протопласты.

Биологическая баллистика — один из самых эффективных методов трансформации однодольных и хвойных растений (в которые не удается ввести чужеродную ДНК с помощью агробактерий), а также трансформации животных клеток. Метод базируется на напылении рекомбинантной ДНК на мельчайшие частицы золота или вольфрама (диаметр частиц 0,6−1,2 мкм), которыми бомбардируют клетки. Бомбардировку осуществляют с помощью генной пушки за счет перепада давления или под действием электрического разряда. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Часть клеток, которые находятся в чашке Петри в центре непосредственно под пушкой, гибнет, а часть, расположенная по периферии чашки, выживает и трансформируется. С помощью генной пушки были трансформированы однодольные растения, такие, как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. При этом были получены стабильные растения-трансформанты.