Практикум. 
Микробиология: теория и практика

Вопросы и задания для самоконтроля.

• 1. Приведите примеры ненаследственной и наследственной изменчивости микроорганизмов.
• 2. Проанализируйте значение процессов рекомбинации генетического материала прокариот.
• 3. Как процесс диссоциации влияет на выживание и устойчивость микробной популяции?
• 4. Чем эндоспора отличается от вегетативной клетки? Что устойчивее в окружающей среде — эндоспора или циста?
• 5. Какие преимущества получают микроорганизмы, обладающие «коллективным поведением»?
• 6 Проанализируйте достоинства и недостатки применения ГЕМОМ в человеческой практике.

Лабораторная работа 1.

Процесс диссоциации у Pseudomonas aeruginosa К-2 и влияние на него условий культивирования.

Цель работы: научить студентов выявлять диссоциирующие культуры, анализировать влияние ряда факторов на диссоциацию бактериальной культуры, ознакомить с диссоциативными вариантами псевдомонад.

Бактерии рода Pseudomonas являются настоящими космополитами и встречаются на Земле повсеместно, так как обладают способностью к существованию в самых разнообразных условиях. Высокая скорость роста на простых средах, широкие возможности метаболизма и особенности организации генетического аппарата делают псевдомонад привлекательными и перспективными для биотехнологии объектами. Представители рода Pseudomonas используются для получения ряда индивидуальных химических веществ, в производстве препаратов для сельского хозяйства, полимеров, в биогидрометаллургии, в нефтедобыче для повышения отдачи пластов, а также при переработке и удалении отходов и веществ, загрязняющих окружающую среду, в том числе и углеводородов.

При рассеве псевдомонад на плотные среды, как правило, обнаруживаются R-, Sи М-диссоцианты, различающиеся, помимо морфологии колоний, ультратонким строением клеток, рядом физиолого-биохимических признаков, скоростью роста, устойчивостью к действию ряда химических и физических факторов.

В частности, диссоцианты Р. aeruginosa К-2 имеют различия:

• 1) в размерах и строении колоний — самые большие и прозрачные колонии образует М-диссоциант, клетки которого обладают мощной капсулой, а R-диссоциант растет в виде небольших плотных колоний, так как его клетки имеют тонкую капсулу;
• 2) потребностях в основных биогенных элементах (углероде, азоте и фосфоре) — R-клетки лучше растут на богатых средах, а М-клетки имеют селективные преимущества на средах с недостатком азота или фосфора;
• 3) путях использования глюкозы — у R-диссоцианта преобладает окислительный путь, а М-клетки наиболее активно осуществляют превращение сахара с образованием муравьиной кислоты, что приводит к резкому подкислению среды. S-диссоциант способен переключаться с одного из вышеуказанных способов использования глюкозы на другой.

Целью данной работы является изучение влияния состава питательных сред и условий культивирования на расщепление популяции Р. aeruginosa К-2 на диссоцианты.

Необходимые материалы: качалки на 30 °C и 37 °C, на 200 и 300 об/мин, pH-метр, спектрофотометр, стандарт мутности (10⁹ клеток/мл), счетчик колоний, микробиологическая петля; посуда (шт. в расчете на 1 студента) — чашки Петри — 55, пробирки узкие с ватными пробками — 40, пробирки широкие с ватными пробками — 10, стеклянные шпатели — 10, пипетки на 1 мл — 45, на 5 мл — 5, на 10 мл — 1, круглодонные колбы на 250 мл — 3; среды и растворы (в расчете на 1 студента) — БСА — 1 л, жидкая полноценная минеральная среда — в 3 широких пробирках по 10 мл и в 3 круглодониых колбах по 50 мл (удобно приготовить 0,2 л), жидкая «голодная, но фосфору» минеральная среда — в 3 широких пробирках по 10 мл (удобно приготовить 50 мл), 40%-й раствор глюкозы — 50 мл, физиологический раствор — 0,3 л, скошенный БСА в пробирках — 2 шт. (готовится заранее лаборантом); микроорганизм — S-диссоциант непатогенного штамма Р. aeruginosa К-2, выделенного из пластовых вод сибирского нефтяного месторождения Ван-Еган.

Занятие 1

Для работы готовят и стерилизуют необходимые среды и растворы. В качестве богатой среды применяют бульон-сусло-агар (БСА), pH = 7,0. Для приготовления среды к МПБ добавляют неохмеленное сусло (6°Б) и 1,5% агара. Среду стерилизуют при 0,5 ати. Минеральную среду готовят в двух модификациях. Полноценная среда имеет следующий состав (г/л): КС1 — 0,6; KN0₃ — 5,0; NaH₂P0₄ • 2Н₂0 — 0,5; MgS0₄ • 7Н₂0 — 0,2; pH = = 7,0; «голодная по фосфору» отличается только содержанием NaH₂P0₄ х х 2Н₂0 — 0,05. Среды готовят на водопроводной воде и стерилизуют при 1,0 ати. После стерилизации перед посевом в среды вносят 2,0% глюкозы в виде 40%-го раствора, простерилизованного при 0,5 ати. Для приготовления суспензий клеток и десятичных разведений готовят стерильный физиологический раствор (0,85% NaCl в дистиллированной воде) и стерилизуют его при 1,0 ати.

Общая схема эксперимента приведена на рис. 4.12.

Рис. 4.12. Схема эксперимента по диссоциации S-варианта Р. aeruginosa.

Для получения исходной 1-суточной культуры осуществляют посев петлей из выданных преподавателем пробирок с S-диссоциантом Р. aeruginosa К-2 на свежий скошенный БСА (выдаются лаборантом) и инкубируют засеянные пробирки при 30 °C в течение 24 ч.

Занятие 2.

Через сутки готовят суспензию выросших клеток с концентрацией 10⁹ клеток в мл по стандарту мутности. Для этого в стерильную узкую пробирку наливают пипеткой стерильный физраствор (~ 3 мл), куда осторожно переносят петлей выросшие бактерии, не захватывая БСА, энергично перемешивают и доводят плотность суспензии стерильным физраствором до нужной концентрации, сравнивая ее с соответствующим стандартом мутности. Общее количество получившейся суспензии должно быть не менее 7 мл.

Из части суспензии (0,5 мл) готовят десятичные разведения в стерильном физрастворе до 10~⁷, вносят по 0,1 мл в чашку с БСА из разведений 10^⁵—10~⁷ (в трех повторностях) и тщательно растирают стеклянными шпателями. Инкубируют засеянные чашки 2 сут. при ЗОХ, после чего до подсчета колоний хранят в холодильнике до 5 сут.

Из оставшейся суспензии производят посев в жидкие минеральные среды в широких пробирках (по 10 мл) и круглодонных колбах (по 50 мл), внося по 3% (по объему) посевного материала. Каждый вариант опыта ставят не менее чем в трех повторностях. Культуру инкубируют в колбах при 37Х на качалке при 300 об/мин в течение 1 сут., а в пробирках при ЗОХ на качалке при 200 об/мин на полноценной среде 2 сут., на «голодной по фосфору» — 3 сут.

Занятие 3.

По завершении инкубации в культуральной жидкости всех вариантов в усредненной пробе определяют оптическую плотность и pH. Результаты вносят в табл. 4.3. Готовят десятичные разведения усредненных проб в стерильном физрастворе до 10^-8 и вносят по 0,1 мл из трех последних разведений в чашки с БСА (в трех повторностях). Суспензию тщательно растирают по агару стеклянным шпателем. Засеянные чашки инкубируют при ЗОХ в течение 48 ч. Культуры в жидких средах до рассева и чашки с выросшей культурой до подсчета колоний можно хранить в холодильнике до 5 сут.

Таблица 4.3

Состав популяции Р. aeruginosa К-2 при разных условиях культивирования.

Занятие 4

Через 2 сут. на чашках подсчитывают общее число колоний и число колоний каждого морфотипа. Описывают имеющиеся типы колоний. Определяют долю диссоциантов в разных вариантах опыта. Результаты вносят в табл. 4.3. Делают выводы о влиянии состава среды, температуры и аэрации на гетерогенность популяции исходной культуры. Соотносят наблюдаемый сдвиг pH с увеличением доли определенного диссоцианта.

Чашки с колониями М-диссоцианта оставляют на хранение при комнатной температуре на 1 мес.

Занятие 5

Через месяц колонию с одной из чашек снимают петлей с агара, суспендируют в стерильном физрастворе, делают десятичные разведения до 10 ⁸ и рассевают обычным способом на чашки с БСА из четырех последних разведений (в двух повторностях). Инкубируют 2 сут. при 30 °C.

Занятие 6

По завершении инкубации подсчитывают общее число колоний и долю диссоциантов в популяции. Делают вывод о влиянии активности воды на расщепление культуры на диссоцианты.