Факторы патогености Klebsiella pneumoniae и их роль в патогенезе острой кишечной инфекции у детей первого года жизни

Содержание

• т~ л ?"чпiг-ч ттт /трг I тг ггм т
• Глава 1. иьс5ик лшЕгацпг’м
  • 1. 1. Клебсиеллез и факторы патогенности клебсиелл
  • 1. 2. Механизмы антибактериальной защиты детей первого года жизни
• ЛГ1Г"ГПГ>ГЧ ТТ ТТ ТГ~> Т ПГМТ^Г! i Т 11 Я (—1 ииьиТвЕмныь киСЛидивлНиЯ
• Глава 2. Материалы и методы
  • 2. 1. Объекты и объем исследования
  • 2. 2. Микробиологические методы
  • 2. 3. Определение факторов и признаков патогенности
  • 2. 4. Биологические методы исследования
  • 2. 5. Методы изучения фимбрий
  • 2. 6. Биохимические исследования
  • 2. 7. Молекулярно-биологические методы
  • 2. 8. Иммунологические методы
  • 2. 9. Фагоцитарные реакции
  • 2. 10. Получение антигенов, антител и диагностических препаратов
  • 2. 11. Получение конъюгатов
• ГЛАВА 3. Биологические свойства штаммов К. pneumoniae, выделенных от детей первого года жизни
  • 3. 1. Роль клебсиелл в этиологии ОКИ у детей раннего возраста
  • 3. 2. Характеристика биохимических свойств штаммов. S
  • 3. 3. Капсулы и капсульные антигены штаммов
  • 3. 4. Состав высших жирных кислот липидов
  • 3. 5. Чувствительность к антибактериальным препаратам
• — б
  • 3. 6. Плазмидный спектр штаммов
• ГЛАВА 4. Факторы и признаки патогенности К. pneumoniae
  • 4. 1. Адгезивные свойства, поверхностные структуры и факторы адгезии
  • 4. 2. Ферменты патогенности
  • 4. 3. Факторы патогенности с функцией поражения
  • 4. 5. Признаки патогенности
  • 4. 6. Массивность выделения
  • 4. 7. Вирулентность
  • 4. 8. Взаимосвязь факторов и признаков патогенности
• ГЛАВА 5. Взаимосвязь патогенных свойств штаммов и клинических проявлений при остром кишечном клебсиеллезе,
  • 5. 1. Клинические формы кишечного клебсиеллеза
    • 5. 1. 1. Кишечный клебсиеллез при спорадической заболеваемости
    • 5. 1. 2. Клебсиеллез при вспышке острой кишечной инфекции
  • 5. 2. Биолого-патогенетические свойства клебсиелл
  • 5. 3. Дисбиотические показатели кишечника
• ГЛАВА 6. Бактериальные антигены и иммуно-биохимические показатели при кишечной клебсиеллезной инфекции
  • 6. 1. Бактериальные антигены
  • 6. 2. Факторы неспецифической защиты
  • 6. 3. Локальная иммунная защита
  • 6. 4. Гуморальный иммунитет
• ГЛАВА 7. Экспериментальное изучение механизмов патогенеза острого кишечного клебсиеллеза
  • 7. 1. Экспериментальная модель для изучения механизмов патогенеза ОКИ у детей раннего возраста
  • 7. 2. Влияние биологических свойств штаммов и их факторов патогенности на динамику клинических проявлений и исход инфекции
  • 7. 3. Динамика перекисного окисления липидов при острой кишечной клебсиеллезной инфекции
• ГЛАВА 8. Роль фимбрий I и III типов, липополисахарида и термолабильного энтеротоксина К. pneumoniae в патогенезе инфекции
  • 8. 1. Механизм взаимодействия фимбрий и фимбриальных адгезинов I и III типов с клетками макроорганизма
  • 8. 2. Роль липополисахарида в активации свободнорадикаль-ного окисления
• ГЛАВА 9. Экспериментальное обоснование разработки диагностических препаратов на основе факторов патогенности К. pneumoniae
  • 9. 1. Разработка технологии получения антигенов
    • 9. 1. 1. Получение и характеристика ФА-I, ФА-Ш
    • 9. 1. 2. Разработка технологии получения ТЛЭТ
    • 9. 1. 3. Разработка технологии получения ЛПС
  • 9. 2. Диагностические иммуноферментные тест-системы для тестирования факторов патогенности и антител к ним
  • 9. 3. Принципы разработки набора питательных сред для дифференциации патогенных и непатогенных энтеробак-терий, в том числе и К. pneumoniae. 308 r- I? Г ТТТЛТ Т г-" Т t* ЯТ~ л <*~v
• АШШЧЬНИЬ. ?
• ПТ ТГГ> ТГ" т ^
• ШЬЮДЫ. JOU
• ГГП> t T/rnt *Т 1ГЧ/ЧТ ft 1Г-* !-T—VT гл" !TT i t Jt it / /> i /-V
  • I. ltmi^kUMIL ?-'ИП.ОМЬНДАЦШ. O4U rirriirmti rrt imrvrs i mt тм ^ Л
• UllHUUft ЛИ 1 t/pA i У Hbl. ?
• УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ОКИ — острые кишечные инфекции
• УПЗ — условно-патогенные энтеробактерии
• УПМ — условно-патогенные микроорганизмы
• ЛИС — липополисахарид
• ТЛЗТ — термолабильный энтеротоксин
• ТСЭТ — термостабильный энтеротоксин
• ТЛ — термолабильность
• ТС — термостабильность
• СОД — супероксиддисмутаза
• ГП — глутатионпероксидаза
• ГТ — глутатионтрансфераза
• ДНКаза — дезоксирибонуклеаза
• ФА-I — фимбриальные адгезины I типа
• ФА-III — фимбриальные адгезины III типа
• АДГ — адгезивность
• ЗНТ — энтеротоксигенность
• К-Р — тест конго-рот
• ФФ — фосфатаза
• ГЕМ — гемолитическая активность
• KT — каталазная активность
• СРО — свободнорадикальное окисление
• АФК — активные формы кислорода
• АОА — антиокислительная активность
• ДОС — антиоксидантная система
• ДОЗ — антиоксидантная защита
• ФАФ — функциональная активность фагоцитов
• — о
• ПОЛ — перекисное окисление липидов
• ОРЭ — осмотическая резистентность эритроцитов
• МдА — малоновый диальдегид
• СЛХЛ — спонтанная люминолзависимая хемилюминесценция
• ЗЛХЛ — зимозанактивированная хемилюминесценция
• РДДГ — реакция двойной диффузии в геле
• ИФА — иммуноферментный анализ
• ЛВК — лизат бактериальных клеток
• Н1 — надосадочная жидкость
• ЖТБ — желче-тиосульфатный бульон
• ЖЭКА — железо-эритритно-кровяной агар
• П!А — полужидкий агар
• КА — кровяной агар
• ЦПХ-агар — плотная среда для синегнойной палочки
• Кг — плотная среда для клебсиелл
• П? — плотная среда для протеев
• ВСА — висмут-сульфитный агар
• MPC — модифицированный агар для лактобацилл
• МИС — молочно-ингибиторная среда
• МПА — мясопептонный агар
• ЛДс0 — доза, вызывающая гибель 50% животных
• КД — килодальтон
• ЦИК — циркулирующие иммунные комплексы f?
• — (

Актуальность проблемы. В последние годы заметно возросло социально-медицинское значение условно-патогенных микроорганизмов (УПМ) и обусловленных ими острых кишечных инфекций (ОКИ), т.к. значительный удельный вес этих инфекций приходится на детей раннего возраста, особенно новорожденных. В этиологической структуре этих заболеваний доминируют условно-патогенные энтеробактерии (УПЗ) — pp. Proteus, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter и другие (32, 72, 137, 148, 172), среди которых одно из ведущих мест занимает К. pneumoniae, на долю которой приходится от 11,2 до 54,2% (20,

Ч Л * Л Л ГЧ Л 4 f- Л Л Л ЛИЛ О О ЛЛЛ ЛЛ J ^

1, и'(С, ld/, Iu8, ?lo, ¿М, ?80, ШеС, oOij.

Клебсиеллезы отличаются тяжелым течением, нередко с развитием генерализованных форм (145, 181, 373), не только у детей, но и у взрослых (273).

Вместе с тем диагностика кишечных форм клебсиеллезной инфекции значительно сложнее, чем при другой локализации, т.к. факт выделения К. pneumoniae не может служить основанием для микробиологического диагноза, необходимо еще доказательство их этиологической значимости в каждом конкретном случае.

В этой связи исследователями используются различные подходы: метод количественного исследования фекалий, серотипирование выделенных культур, исследование парных сывороток с аутоштаммами и другие методы. В последние годы особую значимость приобретает методический подход, основанный на определении патогенных свойств предполагаемого возбудителя (9,17, 36, 38, 216, 381,426,491,493). Исследованиями ряда авторов показано, что большинство штаммов К.

— О pneumoniae, выделенных от больных ОКИ и другими заболеваниями, обладают одновременно двумя и более факторами патогенности (9, 17, 38, 39, 214), а также высокой степенью устойчивости к антибактериальным препаратам (176, 179, 340, 383), в ряде случаев связанной с наличием R-плазмид (8, 17, 23).

Среди многообразия факторов патогенности выделяют адгезив-ность, энтеротоксигенность и факторы, связанные с мембраноповреж-дающим действием.

Адгезия, обеспечивающая начало инфекционного процесса при кишечных инфекциях, по мнению большинства исследователей связана с фимбриями (360, 362). Вместе с тем все еще остается неясным, какие структуры у К. pneumoniae участвуют в адгезивном процессе при ОКИ, т.к. исследованиями D.C.uid et.ai. (433), R. Podscnun et.ai. (439, 440) показано, что у штаммов, выделенных от больных урогенитальной локализации, преобладают фимбрии I типа. Отсутствуют сведения о структуре и биологических свойствах фимбриапьных адгезинов, а также их роли в патогенезе инфекции. До конца невыясненным остается вопрос о биологической активности липополисаха-рида, его роли как фактора патогенности. Противоречивы данные, касающиеся энтеротоксинов. Ряд авторов полагают, что патогенность К. pneumoniae в большей степени связана со способностью к продукции термолабильного энтеротоксина (9, 16, 17, 36, 321, 373, 398). Другие исследователи считают, что реализация патогенных свойств зависит от интенсивности продукции термостабильного энтеротоксина (330, 408). Представляют интерес и данные о новых для клебсиелл факторах патогенности — ферментах антиоксидантной защиты — супе-роксиддисмутазы, каталазы и пероксидаз, выполняющих функцию защиты от фагоцитоза (389, 427, 462).

Несмотря на имеющийся значительный фактический материал, касающийся факторов патогенности, отсутствуют критерии оценки патогенное&trade- К, pneumoniae, подкрепленные данными о их роли в патогенезе кишечной инфекции, т. к. не разработан методический подход к изучению явления патогенное&trade- К. pneumoniae, основанный на механизмах взаимодействия микро- и макроорганизма, и, как следствие, не разработаны диагностические препараты, направленные на тестирование факторов патогенное&trade- и выявление антител к ним.

Цель работы: Обосновать патогенетическую роль ведущих факторов патогенности и на их основе разработать критерии оценки этиологической значимости К. pneumoniae при острых кишечных инфекциях у детей первого года жизни.

Задачи исследования:

— изучить роль К. pneumoniae в этиологии острых кишечных инфекций у детей первого года жизни-

— разработать критерии оценки этиологической значимости К. pneumoniae при острых кишечных инфекциях-

— установить взаимосвязь совокупности факторов патогенности штаммов и отдельных клинических проявлений острого кишечного клеб-сиеллеза-

— выявить неспецифические клеточные и гуморальные факторы, участвующие в защите от инфекции у детей первого года жизни-

— экспериментально доказать роль процессов свободно-радикального окисления в патогенезе клебсиеллезной инфекции-

— установить роль ведущих факторов патогенности К. pneumoniae: фимбрий I и III типов, липогюлисахарида и термолабильного энте-ротоксина в патогенезе острой кишечной инфекции-

— экспериментально обосновать и разработать комплекс диагностаческих препаратов, основанный на тестировании факторов патоген-ности К. pneumoniae и выявлении антител к ним.

Научная новизна. Выявлен комплекс факторов и признаков пато-генности К. pneumoniae и на его основе разработаны критерии оценки для обоснования этиологической значимости штаммов при острых кишечных инфекциях у детей раннего возраста.

Впервые доказано, что штаммы К. pneumoniae способны к продукции ряда факторов патогенности с различной частотой и интенсивностью. Создана коллекция, включающая референс-штаммы и штаммы-продуценты факторов и признаков патогенности, подтвержденная 9 патентами и авторскими свидетельствами, 11 справками о депонировании в Государственной коллекции (Патент РФ N3788965, 1 777 607- t ГЧ ntr A i lltr Л J ЛЛЛ Г Ы г- J ЛЛЛЛ Ш Г A I Л * Г-i «- MA J ГУ. Л Г! Л ЛП

Л. С. 1MDU4 JUdeS, NDU4? UOD, WOU4 <3UDO, 11Э0<1 11ЬУ, 1]У4 UI dJ^!, П1У4

ЛЛГ"!Л И|Л i, А л Г. M Л ucs N9^ иЗо/иь

Впервые установлено наличие прямой корреляционной зависимости между степенью адгезии, типом фимбрий и типом энтеротоксиген-ности. Выявлено отсутствие корреляции между массивностью выделения и вирулентностью штаммов. Впервые установлено наличие избирательной гемолитической активности штаммов в отношении 11(A) и IV (АВ) групп крови человека, преобладание больных с этими же группами крови.

Впервые по данным электронной микроскопии дана характеристика поверхностных структур штаммов фекального происхождения, позволившая выявить типы фимбрий. Впервые экспериментально доказано участие фимбрий I и III типов в адгезивном процессе (Патент

ЛТ J МММ ЛАП I rt ШГЛ i АЛЛ Л ^

N 1(((*0J (, А. и.

Установлено участие фимбриальных адгезинов в регуляции диа-рейного синдрома, опосредованно, через стимуляцию продукции термолабильного энтеротоксина.

Впервые выявлено и экспериментально доказано, что комплекс факторов патогенности штаммов определяет клинические формы и проявления инфекции. Выраженность отдельных симптомов заболевания зависит от интенсивности продукции определяющих их факторов патогенности (Патент N1707615).

Установлено, что острая кишечная инфекция у детей первого года жизни характеризуется поражением всех отделов желудочно-кишечного тракта, с преимущественным вовлечением в патологический процесс толстого и тонкого кишечника. Острый период сопровождается антигенемией, обусловленной наиболее часто липополисахаридом и фимбриальным адгезином III типа в крови, термолабильным энтеро-токсином и липополисахаридом в копрофильтрате.

Впервые экспериментально доказано, что исход инфекции зависит от исходного уровня сбалансированности системы А03-П0Л и имеет решающее значение на первых этапах инфекции. Дефицит активных форм кислорода приводит к развитию генерализованных форм инфекции, а высокий уровень — к избытку высокотоксичных продуктов пе-рекисного окисления липидов, приводящих к быстрым летальным исходам.

Впервые экспериментально обоснован и разработан комплекс диагностических препаратов, иммуноферментных тест-систем и питательных сред для тестирования факторов патогенности К. pneumoniae и антител к ним (Патент N1814769, N1742322- А.С. N93−52 668- Заявка на патент N94030871, пр. от 05. u8.94 г.).

Теоретическая значимость работы.

Комплексный подход к изучению факторов патогенности К. pneumoniae позволил доказать, что патогенность является не видовым признаком, а лабильной характеристикой штамма, выполняющего множественную патогенетическую функцию. Факторы. патогенности находятся во взаимодействии друг с другом.

У штаммов клебсиелл фекального происхождения впервые охарактеризованы типы фимбрий, продуцируемые ими адгезины, доказано их участие в адгезивном процессе, что позволяет рассматривать возможность развития направления по созданию антиадгезивных препаратов для лечения и профилактики клебсиеллезов.

Вскрыт ранее неизвестный один из механизмов регуляции диа-рейного синдрома. Фимбриальные адгезины I и III типов стимулируют продукцию термолабильного энтеротоксина, активирующего образование аденилатциклазы, которая, через усиление синтеза циклического аденозинмонофосфата, нарушает транспорт ионов и воды через мембраны клеток.

Установлено, что у детей первого года жизни, имеющих несовершенную защитно-адаптационную систему, основными механизмами защиты от инфекции являются локальная иммунная защита и неспецифические факторы — фагоцитоз и процессы свободнорадикального окисления. Доказано, что тяжесть течения и исход инфекции зависит от исходного состояния сбалансированности системы А03-П0Л и имеет решающее значение на первых этапах инфекции.

Практическая значимость работы. На основании результатов исследования разработаны и внедрены в работу практических лабораторий методы лабораторной диагностики острых кишечных инфекций у детей раннего возраста:

— Диагностика, прогнозирование течения и лечение острых кишечных инфекций условно-патогенной и смешанной этиологии (Методические рекомендации. Утв. МЗ РСФСР 23.11.90 г.).

— Определение адгезивных свойств грамотрицательных бактерий (Информационно-методическое письмо. Утв. КГСЗН РФ 20. 01.93г.).

— Определение факторов патогенности условно-патогенных энтеробак-терий и оценка их этиологической значимости при острых кишечных инфекциях у детей раннего возраста (Методические рекомендации.

— 7 Т /" ТЛ Г"? Г РЧД АЛ t Ч

Утв. М UJH 1ЛУ ?0. 11. У4Г.) .

На основании результатов исследования разработан комплекс диагностических препаратов, иммуноферментных тест-систем и питательных сред для тестирования факторов патогенности К. pneumoniae и антител к ним:

— Проект ВФС и ЗПР на тест-систему иммуноферментную для выявления антител к липополисахариду К. pneumoniae (Разрешение на проведение Государственных испытаний. Протокол ГФК Fi! от 05. 04. 95 г.).

— Проект ВФС и ЗПР на тест-систему иммуноферментную для обнаружения термолабильного энтеротоксина энтеробактерий (На рассмотреnxrf «t 1 < л /~ч /-«ч ^ 4 Ч нии в Гш,. 1мги от иу. 1

— Проект ВФС и ЗПР на тест-систему иммуноферментную для выявления антител к термолабильному энтеротоксину энтеробактерий (Утвержден на Ученом Совете РНИИМП, пр. N10 от 28.12.95 г. Рекомендовано к рассмотрению в ГФК РФ.

— Проект ВФС и ЗПР на питательную среду для определения термолабильного энтеротоксина энтеробактерий (На рассмотрении в ГФК, N3 от 06.01.95 г.).

— Проект ВФС и ЗПР на питательную среду для тестирования ДНК-азы энтеробактерий (на рассмотрении в ГФК).

Данные, полученные в результате настоящих исследований, используются в учебном процессе: на ФУВ при Ростовском государственном медицинском университете, на циклах «Бактериология» и «Иммунология»: при чтении лекций по спецкурсу «Инфекционная иммунология» и «Тропические болезни с основами иммунодиагностики» для студентов 4 и 5 курсов биолого-почвенного фан-ультета Ростовского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. Патогенность клебсиелл является не видовым признаком, а лабильной характеристикой штамма, выполняющего множественную патогенетическую функцию. Клебсиеллы способны к продукции ряда факторов патогенности, с различной частотой и интенсивностью, каждый из которых выполняет определенные функции и находится во взаимодействии друг с другом (Патент N1788965, 1 777 607- А. С. N5043033, г Л" i /S rs Г~ ТПГ~/-Л Л Л «1Л i /-V Л Л Л О И Т /"Л 4 !*1Л i

N5u4due>o, Nou4iidy, Nya ша32/, 1МУ4 ucsuзаявка на патент 30 870).

2. В патогенезе острой кишечной клебсиеллезной инфекции определенную роль играют термолабильный энтеротоксин, фимбриальные адгезины I и III типов и липополисахарид.

— Фимбрии I и III типа К. pneumoniae являются ответственными за адгезию. Их участие в адгезивном процессе реализуется через секретируемые адгезины, обеспечивающие связывание микроорганизма с клетками макроорганизма (Патент N1777607, А.С. N5043066).

— Фимбриальные адгезины принимают участие в регуляции диа-рейного синдрома. Механизм регуляции опосредованный: адгезины стимулируют продукцию термолабильного энтеротоксина, активирующего образование аденилатциклазы, которая через усиление синтеза циклического аденозинмонофосфата нарушает работу (Na±К+) насоса.

— Липополисахарид является структурным фактором патогеннос-ти, активирующим процессы СРО, путем стимуляции образования АФК и подавлением активности ферментов антиоксидантной системы.

3. Совокупность определенных факторов патогенности определяет клинические формы и проявления инфекции. Выраженность отдельных симптомов заболевания зависит от интенсивности продукции определяющих их факторов патогенности (Патент N1707615).

4. Факторы патогенности К. pneumoniae индуцируют образование иммуноглобулинов и антител, секреторных и сывороточных.

5. У детей первого года жизни основными механизмами, участвующими в защите от инфекции, являются локальная иммунная защита и неспецифические факторы: фагоцитоз и процессы СРО. Процессы СРО в динамике заболевания характеризуются фазностью, антибатными и компенсаторными изменениями показателей, отражающих сбалансированность системы АОЗ-ПОЛ. Тяжесть течения и исход инфекции зависят от исходного состояния сбалансированности системы АОЗ-ПОЛ и имеют решающее значение на первых этапах инфекции.

Процессы СРО являются одним из пусковых механизмов в сложной системе взаимодействия микро- и макроорганизма.

6. Факторы патогенности К. pneumoniae могут быть использованы при разработке препаратов для диагностики острых кишечных инфекций и направленного поиска средств лечения и профилактики ШатенгZ «im* n I Ii J МАЛ * Г-7 i ЛЛЛЛ л млолл л г / Т*7 Л Г4*. А Г*- М/"4,^ Л? ГО, л, лО

ТЫ РФ: NlM’l OI14 ! Uo, 1 (^¿¿б, 1 18о0УОЭ, linwr, A.b. Гму^-UD^Ö-OÖ-, 5 043 066- Заявка на патент N94 30 871, пр. от 05.08.94 г.).

7. В этиологической структуре острых кишечных инфекций детей первого года жизни доминируют условно-патогенные энтеробактерии, среди которых ведущими являются К.pneumoniae. Не все штаммы К. pneumoniae, выделенные из фекалий, являются истинными этиологическими агентами острых кишечных инфекций.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: — VI Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991) — л л — '10

— Всероссийских конференциях и симпозиумах по проблемам: «Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний» (Звенигород, 1990) — «Химия белка» (Тбилиси, 1990) — «Бактериальные токсины» (Юрмала, 1989) — «Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии» (Махачкала, 1990, 1992, 1994) —

— Пленумах: Всероссийского научного общества гастроэнтерологов (Ростов-на-Дону, 1991, 1995) — Проблемной комиссии научного Совета по микробиологии АМН СССР по программе «Плазмида» (Нальчик, 1990) и «Генетика и молекулярная биология бактерий» (Моек

J л л д ва, lyyij-

— Всесоюзных семинарах: «Клинико-лабораторные проблемы современной химиотерапии и профилактики инфекций» (1990) — Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций» (1990) — по современным методам диагностики соматических и инфекционных заболеваний (Ростов-на-Дону, 1991, Уфа, 1992) —

— Международных симпозиумах, конференциях и конгрессах: «Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование» (Рига, 1989) — Лабораторные животные в медико-биологических и биотехнологических исследованиях" (Москва, 1992) — Itii International Congress of immunoreabiIitation (Sochi, 1994) — 7th International congress of Bacteriology ana Applied Microbiology Division (Prague, iyy4j-

— Заседании Ростовского отделения микробиологического общества Л Л Л, А иЭуол

По материалам диссертации опубликовано 69 работ, из них в центральной печати — 38, центральной периодической — 11, за рубежом — 4- получено 5 патентов и 8 положительных решений на выдачу патентов, 2 рацпредложения отраслевого значения, 12 справок на я r*j

-IIштаммы, депонированные в Государственной коллекции- издано 3 методических документа- подготовлена НТД (ВФС и ЭПР) на 5 диагностических препаратов.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 398 страницах машинописного текста, включая иллюстрации из 65-ти таблиц и 76-ти рисунков, списка литературы. Состоит из введения, обзора литературы, описания используемых материалов и методов, 7 глав собственных исследований, заключения и выводов, указателя литературы, включающего 493 работы, из них 185 зарубежных авторов.