«Изучение биологических свойств нового препарата антигипоксического действия» «Конфумин» «в эксперименте»

Актуальность проблемы.

Одним из важнейших направлений современной медицины является совершенствование комплексного лечения шока и кровопотери, а также гипоксических состояний различного генеза. По данным ВОЗ, летальность при этих состояниях нередко превышает 30% (42,81,82). Увеличение числа чрезвычайных и экстремальных ситуаций в нашей стране и за рубежом, возрастающий травматизм в очагах массового поражения определяют необходимость использования инфузионно — трансфузионной терапии (ИТТ), направленной на коррекцию целого комплекса патологически* изменений, возникающих в организме при шоке и кровопотере (178,234,236).

Важнейшим фактором патогенеза различных критических состояний организма (шок, кровопотеря, инфаркт миокарда, инсульты и др.) является гипоксия, которая приводит к выраженным расстройствам функционирования энергетических систем клетки (124,125,133,138). Они проявляются в развитии дефицита субстратов окисления, обусловленного гипогликемией и блоком гликолизанарушениями функции митохондрий, в том числе, разобщением окисления и фосфорилирования и деструктивными изменениями в митохондриальных мембранах.

Эти нарушения нередко играют ведущую роль в развитии необратимых изменений при экстремальных состояниях. Между тем использование кристаллоидных и коллоидных кровезаменителей, несмотря на улучшение кровообращения, и кислородного режима организма, не обеспечивает восстановление клеточной энергетики, в частности, не приводит к нормализации окислительного метаболизма и восстановлению структуры и функции митохондрий.

В условиях значительного и длительного кислородного голодания для предотвращения развития необратимой стадии шока или для ликвидации наступающих необратимых изменений в организме необходимо применение комплексных полифункциональных гемокорректоров, которые, наряду со способностью восстанавливать системную гемодинамику и микроциркуляцию, улучшать реологические свойства крови, могли бы существенно корригировать энергетический обмен на уровне клетки. Это обуславливает необходимость разработки оригинальных комплексных инфузионных сред на кристаллоидной и коллоидной основе с включением антигипоксантов биоэнергетического действия (89,136).

Исследования по изысканию эффективных антигипоксантов биоэнергетической направленности показали перспективность включения в состав инфузионных сред соединений из числа субстратов цикла Кребсафумарата и сукцината. В результате были созданы кристаллоидные кровезаменители, содержащие фумарат (мафусол) либо сукцинат (реамберин), а также до настоящего времени единственный применяемый в клинической практике коллоидный кровезаменитель полифункционального действия, содержащий фумарат натрия — полиоксифумарин.

Все указанные препараты в настоящее время успешно используются в медицинской практике (139,188,190). Однако применение этих растворов при патологии, развивающейся на фоне нормоволемии (инфаркт, инсульт, черепно-мозговая травма и др.) в оптимальных дозах затруднено из-за больших объемов инфузируемой жидкости. Создание препарата, содержащего концентрированный раствор антигипоксанта из числа субстратов цикла Кребса, позволило бы вводить антигипоксант в терапевтических дозах, но в малом объеме.

С учетом вышеизложенного в РосНИИ гематологии и трансфузиологии был создан новый инфузионный раствор, представляющий собой концентрированный раствор антигипоксанта из числа субстратов цикла Кребса — фумарата натрия. Новый лекарственный препарат получил название «Конфумин».

Целью настоящего исследования явилось изучение лечебной эффективности препарата «Конфумин» при инфузионной терапии геморрагического шока и оценка кардиопротекторного действия препарата при ишемии миокарда в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние препарата «Конфумин» на системную гемодинамику, кислородный режим организма, кислотно-основное состояние и окислительный метаболизм при инфузионной терапии геморрагического шока в опытах на кроликах и собаках.

2. Провести оценку антиаритмического действия препарата «Конфумин» при экспериментальной ишемии миокарда в опытах на крысах.

3. Оценить влияние препарата «Конфумин» на метаболизм ишемизированного миокарда в опытах на крысах.

Научная новизна исследования.

В результате проведенных исследований была впервые определена возможность повышения эффективности лечения геморрагического шока при использовании в программах инфузионно-трансфузионной терапии нового инфузионного раствора — конфумина. Доказано влияние фумарата натрияосновного фармакологического компонента конфумина на восстановление биоэнергетической функции митохондрий миокарда при геморрагическом шоке. Устранение энергетического дефицита миокарда способствовало нормализации системной гемодинамики, кислородного режима и кислотно-основного состояния организма животных. На модели ишемии миокарда у крыс выявлено кардиопротекторное действие конфумина.

Практическая ценность.

Проведенные исследования лечебной эффективности конфумина в эксперименте являются необходимым этапом программы создания инфузионного антигипоксанта — конфумина. В Комитете по Этике была получена Рекомендация на проведение клинических испытаний конфумина (протокол № 76 от 25.04.06г). Получено заключение Института госконтроля лекарственных средств (НЦ «ЭСМП») по результатам фармацевтического анализа образцов конфумина, наработанного для клинического изучения (№−3742/06БХ 02.08.06 г.). Протокол клинических исследований конфумина направлен на утверждение ФГУ НЦ «ЭСМП» (вх. №-РХ-43 148 от 25.10.06г) для получения Разрешения на клинические испытания препарата.

Основные положения диссертации выносимые на защиту:

1. Препарат «Конфумин» при экспериментальном геморрагическом шоке улучшает показатели системной гемодинамики, кислородного режима организма, кислотно-основного состояния крови и окислительного метаболизма в митохондриях печени.

2. Конфумин восстанавливает функцию сердца при геморрагическом шоке.

3. Препарат «Конфумин» повышает лечебную эффективность кровезаменителей (волекам, полиглюкин, реополиглюкин) при геморрагическом шоке в эксперименте.

4. Конфумин обладает антиаритмическим действием и нормализует энергетический метаболизм ишемизированного миокарда.

Объем н структура работы.

Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, трех глав с изложением результатов собственных исследований, заключения и выводов, списка литературы. Библиография включает 293 источника. Диссертация иллюстрирована 41 таблицей, 10 рисунками.

выводы.

1. Применение препарата «Конфумин» на фоне инфузионной терапии геморрагического шока у кроликов и собак с использованием гемодинамических кровезаменителей способствует эффективному восстановлению окислительного метаболизма в тканях печени и сердца.

2. Нормализация процессов митохондриального окисления в тканях при введении конфумина существенно улучшает кислотно-основное состояния организма при лечении геморрагического шока.

3. Поддержание энергетического обмена в кардиомноцитах повышает эффективность работы сердца в постинфузионном периоде геморрагического шока.

4. На модели ишемии миокарда у крыс показано, что конфумин обладает выраженным антиаритмическим действием. Препарат снижает общую длительность нарушений ритма, суммарную длительность желудочковой тахикардии и частоту возникновения фибрилляции желудочков.

5.

Введение

конфумина ишемизированным крысам по превентивно-купирующей схеме оказывает кардиопротекторное действие: увеличивается латентный период до возникновения аритмий, снижается длительность желудочковой тахикардии и суммарная длительность фибрилляции желудочков.

6. Конфумин способствует коррекции энергетических процессов в мышце сердца крыс при экспериментальной ишемии, что приводит к повышению содержания пирувата и креатинфосфата и уменьшению уровня лактатного ацидоза в кардиомиоцитах.

7. Препарат «Конфумин», разработанный в ФГУ РосНИИГТ, обладает выраженным антигипоксическим действием. Полученные результаты обосновывают целесообразность применения его как антипшоксический компонент в схемах инфузионной терапии геморрагического шока, а также как самостоятельное лекарственное средство при ишемии миокарда.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В патогенезе экстремальных состояний ведущую роль отводят постгипокснческим нарушениям в клеточных системах выработки энергии. Энергетический дисбаланс в клетках организма нередко определяет необратимость патологического процесса и недостаточную эффективность терапии заболеваний, обусловленных или осложненных гипоксической, циркуляторной или тканевой гипоксией (шок, кровопотеря, инфаркт миокарда, инсульт, тяжелые интоксикации и др.). В связи с этим актуальным является разработка препаратов антигипоксического действия, способных в условиях тяжелой гипоксии восстановить энергетический потенциал клетки и предотвратить развитие необратимых изменений в организме.

В Российском НИИ гематологии и трансфузиологии в течение ряда лет проводится работа по изысканию антигипоксантов биоэнергетической направленности. Исследования по изучению эффективных антигипоксантов биоэнергетической направленности из числа субстратов цикла Кребса показали, что одним из наиболее эффективных и перспективных соединений может считаться фумарат натрия.

Фумарат натрия, являясь промежуточным субстратом цикла трикарбоновых кислот, содержится во всех клетках организма с аэробным типом дыхания, т. е. является естественным соединением для человеческого организма, участвует в биохимических реакциях трикарбоновых кислот, цикла мочевины и пуриновых оснований. Фумарат натрия — вещество, которое способствует ликвидации ацидемии путем химической нейтрализации кислых продуктов метаболизма в кровеносном русле. Однако преимущество фумарата натрия перед другими интермедиатами цикла Кребса заключается еще и в том, что он метаболизируется в условиях кислородной недостаточности (вплоть до аноксии), причем утилизация его сопровождается генерацией энергии.

На основе фумарата натрия создан кристаллоидный кровезаменитель «Мафусол», который уже зарекомендовал себя как эффективное средство борьбы с гипоксией при гиповолемических состояниях (травматический и ожоговый шок, кровопотеря, интоксикации). Особый интерес для клинической медицины представляет разработка новой лекарственной формы концентрированного раствора фумарата натрия для инъекций. Подобная лекарственная форма препарата позволит расширить диапазон применения антигипоксанта.

Такое лекарственное средство было разработано в лаборатории препаратов крови РосНИИ гематологии и трансфузиологии и ему было присвоено название «Конфумин». Препарат представляет собой 15% раствор фумарата натрия для внутривенного введения. Концентрация фумарата натрия в препарате в 10 раз выше, чем в мафусоле. Это позволит применять его как антигипоксический компонент в схемах инфузионно — трансфузионной терапии при гиповолемии различного генеза, так и в условиях нормоволемии при патологических состояниях, где противопоказано введение больших объемов жидкости.

Настоящая работа посвящена изучению в эксперименте лечебной эффективности нового лечебного препарата антигипоксического действия- «Конфумин» при инфузионной терапии геморрагического шока, влиянию его на энергетический обмен митохондрий печени и миокарда, изучение антиаритмического действия препарата при ишемии миокарда.

Было изучено влияние конфумина, применяемого совместно с кровезаменителями, на параметры системной гемодинамики, кислородного режима, кислотно-основного состояния и окислительного метаболизма в митохондриях печени и сердца при геморрагическом шоке у животных. В качестве инфузионных средств были использованы коллоидные кровезаменители, широко применяемые в практическом здравоохранении и имеющие различную коллоидную основу. Так, полиглюкин и реополиглюкин относятся к препаратам декстранового ряда, а волекам к оксиэтилкрахмалам. Конфумин вводили на фоне инфузионной терапии геморрагического шока внутривенно в дозе 1,2 мл на кг массы тела животного. Ни у одного животного при лечении геморрагического шока каких-либо побочных эффектов на введение конфумина отмечено не было, что свидетельствует о совместимости препарата со всеми применяемыми кровезаменителями, независимо от их коллоидной основы.

Тяжесть геморрагического шока у кроликов и собак, эффективность его лечения оценивалась по показателям системной гемодинамики, окислительного метаболизма, кислородного режима и кислотно-основного состояния организма. Все показатели регистрировали до кровопотери, через 1 час гипотензии (перед лечением), а также через 1 час после введения инфузионных растворов.

Эффективность тканевого дыхания изучали на изолированных митохондриях печени (кролики) и сердца (собаки). С этой целью митохондрии выделяли по общепринятому методу Hogebum и Schneider.

Для определения интенсивности дыхания и оценки функционального состояния митохондрий использовали полярографический метод, основанный на реакции восстановления кислорода на катоде при наложении разности потенциала (0,6 в).

Показатели КОС в артериальной и смешанной венозной крови определяли на приборе АВ-2 фирмы «Radiometer». Поскольку все показатели КОС тесно коррелируют друг с другом, при анализе буферных систем мы ориентировались на рН крови, стандартный бикарбонат (ЯВ), сдвиг буферных оснований (ВЕ) и напряжение СО2 в крови.

О прочности сопряжения дыхания и фосфорилирования, а также о состоянии энергетической регуляции митохондрий информируют показатели дыхательных контролей по Ларди (ДКЛ) и Чансу (ДКЧ). Активность энергетической функции отражают скорость фосфорилирования (АДФЛ) и коэффициент фосфорилирования (АДФ/О), равный молярному отношению АДФ к количеству поглощенного при фосфорилировании этой порции АДФ кислорода. Регистрация скорости поглощения Ог при добавлении в полярографическую ячейку разобщителя дыхания — динитрофенола (ДНФ) позволяет косвенно судить об эффективности транспорта электронов по внутренней мембране митохондрий (основная дыхательная цепь). Содержание эндогенных субстратов в митохондриях оценивали по скорости фосфорилирующего дыхания органелл после введения 200 мкМ АДФ в инкубационную смесь, не содержащую экзогенных субстратов окисления.

Инфузионные коллоидные среды (реополиглюкин, полиглюкин и волекам), совместно с конфумином, приобретали способность поддерживать процессы окислительного метаболизма в клетках в условиях гипоксии. Кроме того, применение конфумина в сочетании с различными кровезаменителями при лечении геморрагического шока у кроликов значительно повышало лечебный эффект кровезаменителей. Это связанно, главным образом, с достоверным улучшением показателей системной гемодинамики, коррекцией кислотно-основного состояния организма и восстановлением процессов энергообразования в клетке. При системном транспорте кислорода, не превышающем 50% исходного, активность процессов энергообразования в клетках печени под действием антигипоксанта сохранялась такой же, как у интактных животных. Нормализация процессов биологического окисления в тканях сопровождалась снижением ацидотического сдвига в крови у животных, перенесших геморрагический шок, т. е. новый препарат способен корригировать кислотно-основное состояние крови. Было отмечено кардиотоническое действие конфумина: при его использовании наблюдалось наиболее полное восстановление ударного и минутного объема сердца, показателей отражающих сократительную способность миокарда.

Проведенные экспериментальные исследования на модели геморрагического шока у собак показали, что в результате развивающейся циркуляторной гипоксии после массивной кровопотери, в поздних ее стадиях, возникает ишемия миокарда. Повреждение клеточной энергопродуцирующей системы рассматривается в настоящее время как основная причина, ведущая к развитию терминальной фазы шока. Восстановление системного кровообращения после инфузии кровезаменителей при массивной кровопотере и геморрагическом шоке тесно связано с нормализацией работы сердечной деятельности в послеинфузионный период. Из-за ишемии миокарда на поздних стадиях шока, несмотря на проведенную инфузионную терапию, может возникнуть снижение сократительной способности миокарда и развитие вторичной гипоксии. Поэтому изучение нарушений энергетического обмена митохондрий миокарда, возникающих в результате развития гипоксии, а также влияния фумарата натрия на процессы восстановления энергетики сердца стали одной из задач исследования.

Инфузия кровезаменителей способствует улучшению системной гемодинамики. Восстанавливается и даже превосходит исходные величины сердечный выброс. Вследствие этого возрастает потребление кислорода тканями. К настоящему времени экспериментально доказан и уже практически не дискутируется тот факт, что основной причиной и реоксигенационных, и реперфузионных повреждений органов является поступление в них кислорода. Эти данные еще раз подчеркивают необходимость применения в схемах инфузионной терапии шока и кровопотери препаратов антигипоксического действия.

Использование конфумина приводило к существенной активации процессов в клетке протекающих с обязательным участием кислорода. Митохондрии миокарда животных, которым вводили конфумин, отличались высокими дыхательными контролями как по Ларди, так и по Чансу. Достоверно выше, чем в опытах без добавления антигипоксанта, была скорость фосфорилирования и коэффициент АТФ/О. Практически все показатели окислительного метаболизма достигали исходного уровня, а в отдельных опытах превышали последний.

При использовании антигипоксанта — конфумина улучшались кислородный режим организма и КОС. До исходного повышалось напряжение кислорода в смешанной венозной крови и насыщение ее кислородом, вдвое снижалось ВЕ, содержание БВ в крови значительно возрастало.

Как уже указывалось, механизм действия фумарата связывают с возможностью его инверсивного восстановления в сукцинат, окисление которого является одним из главных источников образования энергии в клетке при гипоксии. Восстановление процессов биологического окисления в клетке должно приводить к снижению образования недоокисленных продуктов. Именно с этим следует связывать наблюдаемую при использовании конфумина коррекцию КОС.

Выявлено положительное влияние конфумина не только на состояние энергетического метаболизма митохондрий сердца при геморрагическом шоке, но и на показатель сократимости левого желудочка сердца — изоволюметрический индекс возрастал практически в 3 раза по сравнению с контролем. Таким образом, конфумин обладает кардиотоническими и кардиопротекторными свойствами.

Для подтверждения данных о кардиопротекторном действии концентрированного раствора фумарата натрия была освоена модель ишемии миокарда у крыс. Ишемию миокарда моделировали путем перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии (НВЛКА) по методу Н.8е1 у.е. (23) под наркозом в условиях искусственного дыхания.

В опытах мониторинг ЭКГ использовали для оценки антиаритмического действия конфумина. Основными показателями ранних постокклюзионных аритмий служили характеристики нарушения сердечного ритма: количество желудочковых экстрасистол (ЭС), продолжительность желудочковой тахикардии (ЖТ) и фибрилляции желудочков (ФЖ). Общую продолжительность ЖТ и ФЖ определяли как сумму всех периодов нарушения ритма за 30 минут наблюдения и выражали в секундах. Оценивали также длительность латентного периода до первого эпизода нарушения ритма и общую продолжительность аритмии. Контрольным животным вводили ЫаС1 0,9%. Опытным животным производили инфузию растворов фумарата натрия в различных дозах. Кроме того, был исследован антиаритмический эффект фумарата натрия в дозе 90 мг/кг препарата при введении его по превентивно-купирующей схеме. В этом случае инфузию начинали за 10 мин до окклюзии, на фоне инфузии производили перевязку НВЛКА и продолжали введение препарата до окончания периода аритмий.

Для изучения энергетического обмена в ишемизированном миокарде определяли содержание лактата, пирувата и 1феатинфосфата. Общее количество выполненных биохимических анализов -90. Содержание лактата и пирувата определяли методом Marbach Е.Р., Weil М. Н. Содержание креатинфосфата по методу Caraway W.

Инфузия фумарата натрия в остром периоде ишемии миокарда у крыс сопровождалась дозозависимым влиянием на ранние постокклюзионные аритмии.

Доза конфумина по фумарату натрия 175 мг/ кг существенно не повлияла на течение постокклюзионных аритмий. Терапевтические эффекты конфумина выявляются в диапазоне доз 90−120 мг/кг из расчета фумарата натрия. Наиболее выраженный и стабильный антиаритмический эффект наблюдался при использовании фумарата натрия в дозе 120 мг/ кг и особенно, 90 мг/ кг.

Введение

конфумина в дозе 90 мг/ кг по привентивно-купирующей схеме усиливало его антиаритмический эффект. Антиаритмический эффект конфумина в дозе 45 мг/ кг проявлялся не у всех животных. Характер его действия, видимо определяется индивидуальными особенностями метаболизма и устойчивости к гипоксии.

Проведенное исследование энергетического обмена у крыс показало, что применение конфумина в виде инфузии со скоростью 3 мл в час оказывает кардиопротекторный эффект при острой ишемии миокарда. На фоне действия конфумина в тканях сердца уменьшаются проявления лактатного ацидоза, увеличивается содержание пирувата и креатинфосфата.

Таким образом, полученные результаты исследования показали, что препарат «Конфумин» можно будет использовать в медицинской практике как антигипоксический компонент в схемах инфузионно-трансфузионной терапии при гиповолемических состояниях, но и как самостоятельное лекарственное средство при гпиоксии в условиях нормоволемии (ишемия, инфаркт миокарда).

Результаты данной диссертационной работы вошли в материалы по доклическому изучению препарата, которые были представлены в Фармакологический Комитет РосМинздрава, и внастоящее время получена рекомендация на его клиническое изучение.