Помощь в учёбе, очень быстро...
Работаем вместе до победы

Разработка и совершенствование биотехнологических приемов приготовления рабического антигена для производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина

Диссертация: Разработка и совершенствование биотехнологических приемов приготовления рабического антигена для производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

По результатам исследований разработаны и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации «Культивирование фиксированного вируса бешенства „Москва 3253“ на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета № 5 от 23.09.10), «Количественное определение фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» в вируссодержащем материале методом полимеразной цепной… Читать ещё >

Содержание

  • Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
    • 1. 1. Генетические особенности вируса бешенства и молекулярно-генетические методы количественной оценки содержания вирусов, применяемые в вирусологии
    • 1. 2. Биотехнологические аспекты культивирования фиксированного вируса бешенства in vivo и in vitro
    • 1. 3. Технологические приёмы инактивации, очистки и концентрирования вируса бешенства
  • ОСНОВНАЯ ЧАСТ
  • Глава 2. Материалы и методы
    • 2. 1. Материалы
      • 2. 1. 1. Вирусные и бактериальные штаммы
      • 2. 1. 2. Клеточная линия Vero
      • 2. 1. 3. Реактивы, растворы и питательные среды
      • 2. 1. 4. Экспериментальные животные
      • 2. 1. 5. Приборы и оборудование
      • 2. 1. 6. Вирусные антигены
    • 2. 2. Методы
      • 2. 2. 1. Культивирование клеток Vero и вируса бешенства штамма «Москва 3253»
      • 2. 2. 2. Инактивация вируса бешенства штамма «Москва 3253»
      • 2. 2. 3. Концентрирование вируса бешенства штамма «Москва 3253»
      • 2. 2. 4. Выделение РНК и реакция обратной транскрипции
      • 2. 2. 5. Полимеразная цепная реакция
      • 2. 2. 6. Клонирование ПЦР-продукта в вектор pGem-T
        • 2. 2. 6. 1. Очистка ампликонов
        • 2. 2. 6. 2. Клонирование в вектор pGem-T
        • 2. 2. 6. 3. Культивирование рекомбинантного штамма Е. coli TGI
        • 2. 2. 6. 4. Выделение плазмидной ДНК рекомбинантного штамма
  • Е. coli TGI pRVMoscow3253G-L
    • 2. 2. 7. Секвенирование фрагментов кДНК вируса бешенства штамма «Москва 3253»
    • 2. 2. 8. Определение количества ДНК
    • 2. 2. 9. Программы и базы данных для анализа нуклеотидных последовательностей
    • 2. 2. 10. Методы выделения антирабического гамма-глобулина и контроля его физико-химических и биологических свойств
    • 2. 2. 11. Статистическая обработка результатов исследований
  • Глава 3. Экспериментальное обоснование технологических параметров культивирования производственного штамма фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в культуре перевиваемой линии Vero
    • 3. 1. Адаптация virus fixe к перевиваемой линии Vero стационарным способом
    • 3. 2. Культивирование virus fixe в культуре клеток перевиваемой линии Vero суспензионным способом
    • 3. 3. Культивирование virus fixe в культуре клеток перевиваемой линии Vero псевдосуспензионным способом
  • Глава 4. Разработка способа количественного определения фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в рабическом антигене методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов
    • 4. 1. Разработка количественной ПЦР для определения содержания вируса бешенства «Москва 3253» в антигенном материале
      • 4. 1. 1. Подбор ДНК-мишени
      • 4. 1. 2. Подбор праймеров и зонда
      • 4. 1. 3. Конструирование рекомбинантного штамма
      • 4. 1. 4. Разработка и оптимизация условий количественной ПЦР с учётом результатов в режиме реального времени
    • 4. 2. Оптимизация количественной ПЦР с учётом результатов в режиме реального времени для определения содержания вируса
      • 4. 2. 1. Оптимизация выделения РНК
      • 4. 2. 2. Оптимизация условий реакции обратной транскрипции
    • 4. 3. Апробация разработанного метода при исследовании вируссодержащего материала
  • Глава 5. Совершенствование технологии инактивации, концентрирования и очистки культурального вируса бешенства
    • 5. 1. Инактивация вирусного урожая
    • 5. 2. Концентрирование и очистка вирусного урожая
  • Глава 6. Получение сывороток от продуцентов, иммунизированных культуральным антигеном, и выделение специфического иммуноглобулина
    • 6. 1. Получение кроличьих антирабических сывороток и исследование их основных физико-химических и биологических показателей
    • 6. 2. Получение антирабических сывороток из крови лошади и исследование их основных физико-химических и биологических показателей
    • 6. 3. Получение антирабического иммуноглобулина из сывороток крови продуцентов и изучение его биологических и физико-химических показателей

Разработка и совершенствование биотехнологических приемов приготовления рабического антигена для производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность темы

.

Вирус бешенства способен вызвать у человека и животных неизлечимое заболевание, которое, по оценке ВОЗ, входит в группу инфекционных болезней, наносящих значительный ущерб экономике и здравоохранению [184].

Из-за чрезвычайной опасности и абсолютной летальности вопросы профилактики бешенства после повреждения, нанесённого больным или подозрительным на бешенство животным, имеют исключительно важное значение. Существующая во всем мире единая тактика профилактики заболевания после контакта с возбудителем инфекции обеспечивается путем немедленной местной обработки раны с последующим введением антйрабической вакцины, а в случаях множественных укусов опасной локализации — в сочетании с антирабическим иммуноглобулином [43, 47, 66].

В Российской Федерации ежегодно за антирабической помощью обращаются 430 470 тысяч человек, больше половины из них получают специфическое антирабическое лечение [59].

Для постэкспозиционной профилактики бешенства у людей в Российской Федерации применяют концентрированную культуральную антирабическую вакцину (КОКАВ) в сочетании с антирабическим иммуноглобулином (АИГ). В России рекомендованы к применению и зарегистрированы в Государственном Реестре лекарственных средств (ГРЛС) гомологичный АИГ (Китай, Франция) и гетерологичный АИГ из сыворотки крови лошади, единственным производителем которого в Российской Федерации является Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

На сегодняшний день АИГ из сыворотки крови лошади можно считать приемлемой и безопасной альтернативой гомологичному иммуноглобулину, получаемому из иммунной сыворотки крови человека, так как использование современных методов очистки иммуноглобулиновых препаратов позволило значительно снизить частоту побочных эффектов, проявляющихся в результате применения АИГ животного происхождения — до 1−2% [1, 184, 186]. Однако даже при сравнительно небольшой доле возникновения побочных эффектов вопрос дальнейшего усовершенствования гетерологичного АИГ остается актуальным.

Среди научно-практических задач, способствующих повышению качества целевого продукта, актуальной является применение на этапе иммунизации продуцентов рабического антигена культурального происхождения.

В настоящее время для иммунизации продуцентов при получении лошадиной гипериммунной сыворотки используют органо-тканевой рабический антиген, представляющий собой инактивированную карболизированную 10% суспензию мозга кроликов, зараженных фиксированным вирусом бешенства. Органо-тканевой антиген характеризуется высокой иммуногенной активностью, однако содержащаяся в нём балластная мозговая ткань не исключает риска образования в сыворотке продуцентов антител-нейротоксинов, которые могут быть причиной побочных эффектов у получающих анти-рабическую помощь пациентов [65, 184]. Применение клеточных культур в качестве основной системы для репродукции фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» должно позволить получить более безопасный очищенный антиген.

Использование культурального рабического антигена на этапе получения гипериммунной сыворотки является альтернативой трудоемким процессам интрацеребраль-ного заражения животных, их вскрытия и приготовления вируссодержащей мозговой суспензии, что позволит сделать производство препарата не только более этичным, но и в большей степени соответствовать рекомендациям ВОЗ по исключению применения органо-тканевого антигена в производстве антирабических препаратов [187].

Не менее важным аспектом при поиске путей совершенствования технологии производства антирабического иммуноглобулина является разработка методических подходов для количественной оценки содержания вируса бешенства «Москва 3253» в материале для иммунизации продуцентов, полученном как из мозговой ткани животных, так и на клеточной культуре. На данный момент уровень содержания вируса сопоставляется с объемом вводимой продуцентам мозговой суспензии. Одним из перспективных подходов к решению данного вопроса является использование количественной полиме-разной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов (ПЦР-РВ).

Использование для ПЦР-РВ зонда, меченного флуоресцентными метками, и дополнительная амплификация количественно охарактеризованных проб позволит в полной мере дать оценку уровню содержания вируса бешенства в иммунизирующей дозе. Данный подход нашел успешное применение для определения концентрации РНК вируI са диареи крупного рогатого скота [124]- жёлтой геморрагической лихорадки, человеческого герпес вируса-6 и цитомегаловируса [148]- для количественной оценки антигена Е вируса клещевого энцефалита в культуре клеток [50]- для количественного определения вакцинных штаммов вирусов кори, эпидемического паротита и краснухи [2, 30, 31, 32]- для молекулярно-генетической идентификации вируса геморрагической болезни кроликов [12, 13, 14, 15]- для выявления генома вируса блютанга методом ПЦР в мониторинговых исследованиях и генотипирования серотипов вируса блютанга [18, 61, 62]: для идентификации генома вируса болезни Ибараки на основе ПЦР в режиме реального времени [3].

Применение количественной ПЦР позволит определять содержание вируса бешенства в антигене для иммунизации продуцентов, а также исследовать динамику накопления вируса при его культивировании реакторным способом на клетках перевиваемой линии Vero.

Высокая востребованность антирабического иммуноглобулина на Российском фармацевтическом рынке, обусловленная неблагоприятной эпизоотической и эпидемиологической ситуацией по бешенству, дают основания считать актуальными исследования по совершенствованию технологии производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина.

Цель работы — разработка биотехнологических приемов масштабированного выращивания культурального фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» и способа его количественной оценки.

Основные задачи исследования.

1. Экспериментально обосновать технологические параметры культивирования фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на культуре клеток перевиваемой линии Vero.

2. Разработать методические подходы для количественного определения вируса бешенства «Москва 3253» в вирусном материале с применением полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

3. Усовершенствовать технологические приемы по инактивации, очистке и концентрированию культурального вируса бешенства.

4. Оценить перспективы применения культурального рабического антигена для получения специфических сывороток.

5. Получить экспериментальные серии антирабического иммуноглобулина с применением культуральных технологий и исследовать его физико-химические и биологические параметры на соответствие требованиям нормативной документации.

Научная новизна работы.

Впервые фиксированный вирус бешенства штамма «Москва 3253» репродуцирован на клетках перевиваемой линии Vero. Экспериментально обоснованы технологические параметры культивирования вируса стационарным, суспензионным и псевдосуспензионным методами.

Впервые в отечественном производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина для иммунизации продуцентов предложено использование рабического антигена на основе культурального вируса бешенства штамма «Москва 3253» взамен ор-гано-тканевого антигена.

Впервые разработаны методические подходы для количественной оценки содержания вируса бешенства штамма «Москва 3253» в рабическом антигене с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Практическая ценность работы.

По результатам исследований разработаны и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации «Культивирование фиксированного вируса бешенства „Москва 3253“ на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета № 5 от 23.09.10), «Количественное определение фиксированного вируса бешенства штамма „Москва 3253“ в вируссодержащем материале методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов» (протокол заседания Ученого совета № 6 от 10.11.11), «Концентрирование инактивированной суспензии культурального фиксированного вируса бешенства „Москва 3253“ методом тангенциальной ультрафильтрации» (протокол заседания Ученого совета № 6 от 10.11.11), «Культивирование фиксированного вируса бешенства штамма „Москва 3253“ суспензионным методом на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета № 8 от 23.12.11), «Культивирование фиксированного вируса бешенства „Москва 3253“ псевдосуспензионным методом на перевиваемой клеточной линии Vero» (протокол заседания Ученого совета № 8 от 23.12.11).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанные биотехнологические приемы обеспечивают репродукцию фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» на перевиваемой клеточной линии Vero стационарным, суспензионным и псевдосуспензионным методами культивирования.

2. Экспериментально обоснованная методика проведения инактивации, очистки и концентрирования вирусного урожая при масштабированном культивировании вируса бешенства «Москва 3253» в условиях биореактора позволяет получить культуральный рабический антиген для иммунизации продуцентов, по антигенным свойствам не уступающий органо-тканевому.

3. Применение культурального рабического антигена для иммунизации продуцентов позволяет получать иммунные специфические сыворотки с уровнем защитных антител, соответствующим регламентированному значению.

4. Специфический иммуноглобулин, полученный с использованием культураль-ных технологий, по физико-химическим и биологическим характеристикам соответствует требованиям нормативной документации на антирабический иммуноглобулин из сыворотки крови лошади.

5. Разработанные методические подходы позволяют определять количество вируса бешенства «Москва 3253» в материале для иммунизации продуцентов с помощью по-лимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на ежегодных итоговых научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (2007, 2008, 2011, 2012, 2013 г. г.) — юбилейной научно-практической конференции, посвящённой 1 ООлетию Ростовского научно-исследовательского института микробиологии и паразитологии «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Ростов-на-Дону, 23−24 сентября 2009) — X съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 12−13 апреля 2012) — научно-практической конференции Роспотребнад-зора «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения» (Нижний Новгород, 11 апреля 2012) — Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Роспотребнадзора «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: материалы» (Пермь, 16−18 мая 2012) — VI Региональной научно-практической конференции «Перспективы использования в медицинской практике новых иммунобиологических препаратов, полученных на основе клеточных культур» (Екатеринбург, 30−31 мая 2012) — Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных» (Ставрополь, 23−24 мая 2012) — Международной интернет-конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, 17−19 апреля 2012) — Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (к 100-летию СГАУ имени Н.И. Вавилова) (Саратов, 28−29 января 2013).

Публикации.

Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных «Перечнем ведущих рецензируемых научных журналов и изданий» ВАК Российской Федерации.

Структура и объём диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 83 отечественных и 107 зарубежных источников. Общий объём работы составляет 118 страниц компьютерного текста, иллюстрированного 22 таблицами и 18 рисунками.

ВЫВОДЫ.

1. Экспериментально обоснованы технологические параметры культивирования производственного штамма фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в культуре перевиваемых клеток линии Vero стационарным, суспензионным и псевдосуспензионным способами.

2. Показано, что усовершенствованные технологические приемы по инактивации, концентрированию и очистке культурального вируса бешенства при масштабированном культивировании в условиях биореактора позволяют получить культуральный рабический антиген для иммунизации продуцентов, по антигенным свойствам не уступающий органо-тканевому.

3. Установлено, что антирабические сыворотки от продуцентов, иммунизированных культуральным антигеном, по результатам тестов in vivo и in vitro, обладают достаточно высокой специфической активностью и пригодны в качестве сырья для выделения антирабического иммуноглобулина.

4. Специфический иммуноглобулин, полученный с использованием культуральных технологий, по физико-химическим и биологическим характеристикам соответствует требованиям ФСП PN 2 639/01−250 210 на антирабический иммуноглобулин из сыворотки крови лошади жидкий, раствор для инъекций.

5. Разработанные методические подходы позволяют с помощью полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учётом результатов количественно оценивать содержание фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в вирусном материале.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади — высоковостребо-ванный препарат для постэкспозиционной профилактики бешенства, производство которого на территории Российской Федерации осуществляет РосНИПЧИ «Микроб».

В настоящее время для иммунизации продуцентов при получении лошадиной гипериммунной сыворотки используют органо-тканевой рабический антиген, который характеризуется высокой иммуногенной активностью, однако содержащаяся в нём балластная мозговая ткань не исключает риска образования в сыворотке продуцентов анти-тел-нейротоксинов, которые могут быть причиной побочных эффектов у получающих антирабическую помощь пациентов. Применение клеточных культур в качестве основной системы для репродукции фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» позволит получить более безопасный очищенный антиген. Другим важным аспектом при поиске путей совершенствования технологии производства антирабического иммуноглобулина и стандартизации производственного процесса является разработка метода количественной оценки содержания вируса бешенства «Москва 3253» в материале для иммунизации продуцентов, полученном как из мозговой ткани, так и на клеточной культуре. На данный момент уровень содержания вируса сопоставляется с объемом вводимой продуцентам мозговой суспензии. Одним из перспективных подходов к решению данного вопроса является использование ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

Целью данной работы явилась разработка биотехнологических приемов масштабированного выращивания культурального фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» и способа его количественной оценки.

В настоящем исследовании для адаптации фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» к клеткам перевиваемой линии Vero использовали стационарный метод культивирования, используя следующие подходы: прямое пассирование вируса на клеточной культуре, поочередное пассирование вируса бешенства на кроликах и клетках. Для выращивания клеток линии Vero использовали среду Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки или нормальной сыворотки КРС, а для репродукции вируса — среду 199 с добавлением 0,1% ЧСА и антибиотиков. В результате проведенных исследований к 35 пассажу был установлен титр инфекционности вируса бешенства в культуре клеток — (3,57±0,21) ^ЛД50.

С целью получения фиксированного вируса бешенства «Москва 3253», адаптированного к культуре клеток Vero с более стабильными свойствами, дальнейшую адаптацию вируса проводили чередующимися пассажами: мозг кролика — культура клеток. Было проведено 10 перемежающихся пассажей (кролик-клетки), после чего инфекционная активность вируса возросла до (4,34±0,32) lg ЛД50/мл. Далее проводили 15 прямых пассажей на клетках Vero, в течение которых инфекционная активность вируса не увеличилась. После дополнительных шести чередующихся пассажей (кролик-клетки) и 10 прямых пассажей на культуре клеток, вирус бешенства штамм «Москва 3253» приобрел стабильную способность накапливаться в монослое, вызывая его разрушение до 80−90 о/ /о.

Для улучшения адсорбции вируса на клеточной мембране использовали протами-на сульфат в дозе ОЛмг/мл за 10 минут до внесения вируса с последующей инкубацией при температуре (37±1) °С. Использование протамина сульфата привело к повышению специфической активности вируссодержащей жидкости на 0,1−0,5 ЛД50/мл.

При отработке параметров культивирования вируса бешенства стационарным способом выявили оптимальную дозу заражения клеток вирусом — 0,1 ЛД50/кл и оптимальный способ заражения — в клеточную суспензию.

Для масштабированного культивирования клеток и вируса в условиях биореактора были отработаны параметры культивирования суспензионным и псевосуспензионным методами.

При культивировании клеток Vero суспензионным способом посевную культуру клеток готовили из однослойной культуры, выращенной стационарным способом в культуральных флаконах с рабочей поверхностью 150 см². Полученную суспензию клеток в количестве 200 мл помещали в биореактор с 2 л ростовой среды. Конечная посевная концентрация клеток составляла 0,5−1,Ox 105 кл/мл. В качестве ростовой среды использовали среду Игла MEM с добавлением 10% фетальной или нормальной сыворотки КРС и антибиотиков (пенициллин и стрептомицин — 100 ЕД/мл каждого). Для предотвращения агрегации клеток в среду добавляли трипсин до конечной концентрации 2 мкг/мл. Культивирование клеток производили в течение 60 ч при следующих параметрах: скорость перемешивания 80−100 об/минтемпература (37 + 1) °СрН (7,0 ±0,2).

Было выявлено, что в сравнении с суспензионным, псевдосуспензионный метод позволяет получать более высокий урожай клеток, соответственно 2,1* 105 и 2,8×105 кл/мл, что свидетельствует о целесообразности его применения при масштабированном культивировании вируса бешенства на клетках Vero.

Заражение клеток вирусом при суспензионном выращивании производили путем инокуляции вируссодержащей жидкости непосредственно в биореактор. Количество посевного вируса зависело от титра его инфекционной активности. Заражающая доза составляла от 0,05 до 0,2 ЛД50/кл. Культивирование осуществляли в течение 96 ч при следующих параметрах: скорость перемешивания — 100 об/минтемпература — (33 + 1) °СрН — (7,2 + 0,2). Уровень рН поддерживали с помощью 1 моль/л раствора бикарбоната натрия и 0,2 моль/л ацетатного буферного раствора (рН 4,5).

В результате исследования эффективности ростовых добавок экспериментально подтверждена возможность замены ЧСА на компонент с более низкой стоимостьюнормальной сыворотки КРС. Использование последней не оказывало значимого влияния на урожай вируссодержащей жидкости. Титр инфекционности вируса при суспензионном способе культивировании на среде 199 с добавлением 1, 2, 5% нормальной сыворотки КРС составил соответственно (3,83±0,32) — (4,27±0,26) — (4,38±0,33) lg ЛД50/мл ьпри заражающей дозе 0,1 ЛД50/кл вируса, которая явилась оптимальной.

Для псевдосуспензионного культивирования вируса использовали микроносители Cytodex-З. Параметры выращивания были аналогичны параметрам при суспензионном культивировании: температура — (37 ± 1) °Сподача С02 — в первые 2 ч культивированиярН — (7,0 + 0,2). Уровень рН поддерживали с помощью 1 М раствора бикарбоната натрия. Доза заражения 0,1 ЛД50/кл явилась оптимальной. Культивирование вируса проводили в течение 96 ч, затем определяли титр инфекционной активности образцов.

Оптимальная доза заражения при псевдосуспензионном выращивании вируса на среде 199 с добавлением составила 0,1 ЛД50/кл. Титр инфекционной активности образцов при добавлении 0,1% ЧСА, 1, 2, 5% нормальной сыворотки КРС составил соответственно: (4,62±0,28) — (4,19±0,27) — (4,68±0,13) — (4,51±0,17) lg ЛД50/мл.

Установлено, что в сравнении с суспензионным, псевдосуспензионный метод культивирования позволял получать более высокий урожай вируса, что позволяет считать его применение более целесообразным.

Следующим этапом работы явилась разработка ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов для количественного определения фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в рабическом антигене, а также в вирусном материале на этапах культивирования. Разработка количественной ПЦР-РВ включала в себя несколько этапов: выбор ДНК-мишениподбор специфичных олигонуклеотидных прайме-ров и зонда формата TaqManконструирование рекомбинантного штамма Е. coli TGI, содержащего фрагменты генома вирусаоптимизацию количественной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времениоптимизацию методов выделения РНК вируса, получения кДНК в реакции обратной транскрипцииапробацию разработанной количественной ПЦР на антигенном материале.

Специфичные для штамма вируса «Москва 3253» олигонуклеотидные праймеры и зонд подбирали так, чтобы их последовательности отличались от таковых в геномах других штаммов вируса бешенства не менее чем на 7 нуклеотидов, количество вариабельных нуклеотидов в пределах последовательности зонда у других изолятов было не менее 3, последовательность 3″ -конца зонда имела значительные отличия от таковой у других штаммов вируса бешенства.

С учетом этих требований и на основании консенсусной последовательности выбранного участка G-L области с помощью программы Primer Premier-V5 и интернет-сайта www.genscript.com были подобраны олигонуклеотидные праймеры RV5 и RV6 и зонд формата TaqMan RV7 с флуоресцентными метками ROX и BHQ2, позволяющие учитывать результаты реакции в режиме реального времени. Показана высокая специфичность праймеров RV-5, RV-6 и зонда RV-7 по отношению к последовательности G-L области штамма вируса бешенства «Москва 3253». Для повышения эффективности гидролиза зонда RV7 за счет 5'-экзонуклеазной активности фермента Taq-полимеразы к его 5'-концу добавлено три нуклеотида «ААТ». некомплементарных последовательности локуса.

Для получения рекомбинантного штамма Е. coli TG 1. содержащего изученный ранее фрагмент G — L области вируса бешенства «Москва 3253» размером 881 п.н., использовали вектор pGEM-T. Полученный рекомбинантный штамм Е. coli.

TGl/pRVMoscow3253G-L депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий при РосНИПЧИ «Микроб», под номером КМ 229.

Осуществление количественной ПЦР невозможно без использования ПЦР-стандартов — проб с известной концентрацией ДНК. Для получения таких проб проводили выделение плазмидной ДНК методом мембранной фильтрации, определение.

— ю количества ГЭ плазмиды в растворе, и готовили её десятикратные разведения до 10 ,.

— 2 что соответствовало п х10 ГЭ/мл. Далее из подготовленных разведений ДНК определяли оптимальные для использования в качестве ПЦР-стандартов.

Оптимизацию количественной ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени осуществляли в два этапа. На первом — определяли оптимальные условия амплификации подобранных праймеров и зондов, на втором — проводили подбор ПЦР-стандартов. Установлено, что использовании разведений плазмиды pRV G-L.

Moscow 3253.

— 4 -5 -7 -9.

10, 10, 10, 10 позволяет осуществить количественную ПЦР с эффективностью реакции от 91 до 97%.

Так, на основании полученных ранее результатов были подобраны четыре ПЦР-стандарта: RV1, RV2, RV3. RV4, содержащие разведения плазмидной ДНК 10~4, 10~5,.

7 9 8.

10″, 10, соответственно. Содержание ГЭ плазмиды в ПЦР-стандартах составило: 10 ,.

7 5 3.

10, 10, 10, соответственно. При исследовании проб антигена органо-тканевого происхождения показано, что оптимальным является использование ПЦР-стандартов RV1, RV2, RV3- при исследовании проб антигена культурального происхождения оптимальным является использование ПЦР-стандартов RV2, RV3, RV4.

На следующем этапе работы проводили оптимизацию выделения РНК вируса и реакции обратной транскрипции. Для этого определяли эффективность количественной ПЦР при использовании для выделения РНК/ДНК набора, производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (набор 1) и набора «Рибо-Сорб» («ИнтерЛабСервис», Россия) (набор 2).

При выделении РНК с помощью указанных выше наборов установлено, что количество РНК, выделенной из исследуемых проб, было в среднем в 10 раз выше при использовании второго набора. В связи с этим, все последующие эксперименты проводили с набором для выделения ДНК/РНК «Рибо-Сорб».

Реакцию обратной транскрипции проводили при температуре 37 °C в трёх режимах — 30- 60 и 90 мин. Для этой цели использовали набор реагентов Реверта-L.

Концентрация кДНК вируса бешенства была выше при использовании второго режима, значительной разницы между вторым и третьим режимами не наблюдалось, поэтому реакцию обратной транскрипции РНК фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» в дальнейшем осуществляли при температуре 37 °C в течение 60 мин.

С использованием разработанной количественной ПЦР была определена концентрация фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» в исследуемых пробах антигена органо-тканевого и культурального происхождения.

Концентрация фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253» в исследуемых пробах мозговой суспензии кроликов составила п><108 копий/млв исследуемых пробах вируссодержащей жидкости при стационарном способе выращивания — от п х 103 до п х 105 копий/млв исследуемых пробах вируссодержащей жидкости при суспензионном способе выращивания — от пхЮ4 до пхЮ6 копий/млв исследуемых пробах вируссодержащей жидкости псевдосуспензионным способом выращивания — пх Ю4 до их Ю6 копий/мл и в культуральной вируссодержащей жидкости.

7 8 после концентрирования — пх 10 до пх 10 копий/мл.

Задачей следующего этапа работы была разработка технологических приемов по инактивации и концентрированию вирусного урожая, полученного при масштабированном выращивании.

В результате исследований установлено, что наряду с традиционно применяемым инактиватором фенолом возможна химическая инактивация вируса бешенства (3-пропиолактоном и теотропином. Для получения максимального эффекта инактивацию следует проводить при температуре 37 °C в течение 24 ч с добавлением 0,0125% Р-пропиолактона или 0,05% теотропина.

Для повышения иммуногенности полученного культурального рабического антигена были проведены исследования по концентрированию инактивированной культуральной жидкости в режиме тангенциальной фильтрации. Установлено, что оптимально использование ультрафильтрационных мембран с НОММ 300 кДа, при этом показано, что технологический процесс целесообразно проводить при величине давления 0,21 МПа. Внедрение данного технологического приема позволило достичь коэффициента кратности концентрирования фильтруемого материала по объему, равного 50, при увеличении концентрации вируса бешенства более чем в 100 раз.

В ходе дальнейших экспериментов был проведен сравнительный анализ концентрации вируса бешенства штамма «Москва 3253» в. рабическом антигене органо-тканевого и культурального происхождения методом ПЦР-РВ. Установлено, что после концентрирования вирусного урожая содержание вируса в культуральном антигене бы.

7 Я ло сопоставимо с таковым в органо-тканевом и составило от пх 10 до пх 10 копий/мл.

Следующий этап работы заключался в получении сывороток от продуцентов, иммунизированных культуральным антигеном, выделении из них специфического иммуноглобулина и изучении его биологических и физико-химических свойств.

В результате экспериментов были получены по три образца кроличьей и лошадиной антирабической сыворотки с титром специфических антител не ниже 1:500, что позволяло, использовать их в качестве сырья для получения антирабического иммуноглобулина. Фракцию гамма-глобулина осаждали риванол-спиртовым методом. Образцы ге-терологичного антирабического иммуноглобулина из сывороток крови кроликов и лошадей, полученные с применением культуральных технологий, по физико-химическим и биологическим характеристикам соответствовал требованиям ФСП РК 2 639/01250210 на коммерческий препарат гетерологичного антирабического иммуноглобулина. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения рабического антигена культурального происхождения в производстве антирабического иммуноглобулина на этапе иммунизации продуцентов.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Е.Г. Производство гетерологичного антирабического иммуноглобулина итоги первых пяти лет / Е. Г. Абрамова Е.Г., А. К. Никифоров, O.A. Лобови-кова и др. // Пробл. особо опасных инф. — 2010. — № 3. — С. 58−62.
  2. Е.В. Разработка тест-системы на основе ПЦР в режиме реального времени для идентификации генома вируса болезни Ибараки / Е. В. Аронова, И.М. Кала-беков, Г. С. Бурмакина и др. // Биотехнология. 2012. — № 6. — С. 70−75.
  3. И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И. П. Ашмарин, A.A. Воробьев. Л.: Медгиз, 1962. — 180 с.
  4. М.В. Способ получения гипериммунной антирабической сыворотки / М. В. Бабкин, Б. Т. Стегний, С. А. Ничик и др. // Патент № 19 403 UA, МПК А61К 39/205- 15.12.2006.
  5. Д.О. Иммунобиологические свойства штамма ERA G 333 вируса бешенства для изготовления оральной антирабической вакцины : дис.. канд. ветер. наук: 06.02.02 / Баньковский Денис Олегович. Щелково — 2010. — 20 с.
  6. П.И. Современные проблемы бешенства / И. П. Барышников, В. Н. Грязин, A.B. Зайковская. Москва: КолосС, 2007. — 81 с.
  7. Биотехнология: учебное пособие для вузов / под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. -М.: Высшая школа, 1988. 980 с.
  8. Биотехнология / Под ред. Е. С. Воронина. Спб.: ГИОРД — 2005. — 792 с.
  9. Г. С. Идентификация генома вируса геморрагической болезни кроликов методом ПЦР / Г. С. Бурмакина, A.C. Малоголовкин, A.B. Николаев и др. // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. 2012. — № 1. — С. 36−38.
  10. Г. С. Разработка средств молекулярно-генетической идентификации вируса геморрагической болезни кроликов : автореферат дис.. канд. биол. наук: 03.01.06 / Бурмакина Галина Сергеевна. Покров — 2012. — 27 с.
  11. С. Д. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов / С. Д. Варфоломеев, C.B. Калюжный. М.: Высшая школа, 1990.-217 с.
  12. У.Э. Биотехнология. Биотехнологические агенты, технология и аппаратура / У. Э. Виестур, И. А. Шмите, A.B. Жилевич. Рига: Зинатне, 1987. — 180 с.
  13. . Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир, 2002. — 589 с.
  14. Т.Ф. Технологические разработки инактивированной антираби-ческой вакцины / Т. Ф. Горшкова, В. В. Недосеков, В. И. Жестеров и др. // Материалы международной науч. практич. конф. — Покров, 2001. — С. 37−58.
  15. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XII издание. Часть 1. М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения. — 2008. — 704 с.
  16. М.Г. Усовершенствование технологии промышленного производства инактивированной культуральной вакцины против бешенства животных: автореферат дис.. канд. ветер, наук: 16.00.03 / Гочмурадов Мурад Газакович. -Владимир, 1999. 25 с.
  17. С.А. Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов : автореферат дис.. д-ра биол. наук: 03.00.23 / Гринь Светлана Анатольевна. Щелково, 2008. — 54 с.
  18. К.Н. Бешенство животных / К. Н. Груздев, В. В. Недосеков. М.: Аквариум, 2001. — 303 с.
  19. T.JI. Совершенствование риванол спиртового метода получения гамма-глобулина / Т. Л. Губенко, В. И. Смирнова // Украинский биохимический журнал. — 1963. — № 5. — С. 747−754.
  20. Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей / Ю. И. Дытнерский. М.: Химия, 1995. — 252 с.
  21. А. Н. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) / А. Н. Екимов, Г. А. Шипулин, Е. Г. Бочкарев и др. // Вестник последипломного образования. 2001. — № 3. — С. 7−10.
  22. В.М. Общая и частная вирусология / В. М. Жданов, С .Я. Гайдамо-вич. М.: Медицина, 1982. — 1016 с.
  23. Ю.И. Метод ПЦР-РВ для оценки титра вируса краснухи в вирус-содержащей жидкости / Ю. И. Забияка // Материалы XVII междунар. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». М., 2010. — С. 167.
  24. Ю.И. Экспресс-метод оценки титра вируса краснухи в вируссо--держащей жидкости с помощью ПЦР-РВ / Ю. И. Забияка, Е. Б. Файзулоев, Т. К. Борисова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010. — № 5. — С. 57−62.
  25. И.В. Совершенствование технологии получения инактивированных антирабических вакцин : автореф. дис.. канд. биол. наук: 03.01.06, 06.02.02 / Иванов Игорь Викторович. Щелково, 2011. — 22 с.
  26. С.П. Гипериммунные сыворотки / С. П. Карпов, С. М. Прегер, Г. Е. Синельников и др. Томск, 1976. — 380 с.
  27. Ю.М. Биотехнология иммунобиологических препаратов / Ю. М. Краснопольский, М. И. Борщевская // Харьков: Фармитэк, 2008. 312 с.
  28. С.Н. Усовершенствование технологий производства вакцин против бешенства животных : автореф. дис.. канд. биол. наук: 03.00.23 / Красуткин Сергей Николаевич. Щелково, 2003. — 33 с.
  29. C.B. Метод получения антирабической сыворотки /C.B. Кузнецова, Н. И. Передереев, П. П. Кузнецов и др. // Тр. ВГНКИ, 1975. T. XXII. — С. 36−41.
  30. А.Г. Вирулентность, антигенность вируса ящура, репродуцированного в культурах клеток и в организме животных при промышленном производствевакцин: автореф. дис.. канд. биол. наук: 03.01.06 / Кулагина Алевтина Георгиевна. -Щелково, 2010. -24 с.
  31. Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Жд. Сэмбрук. М.: Мир, 1984. — 479 с.
  32. Н.В. Медицинские иммунобиологические препараты, применяемые для специфической профилактики бешенства // Бюлл. «Вакцинация». Бешенство, № 1(37).- 2005.
  33. . Вирусология: методы / Б. Мейхи. М.: Мир, 1988. — 344 с.
  34. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. Справочник / В. Н. Сюрин, Р. В. Белоусова, Б. В. Соловьев и др. // М.: Агропромиздат, 1986. -351 с.
  35. Методы лабораторных исследований по бешенству. Третье издание / под ред. М. М. Каплан, Н. Копровски. Женева: ВОЗ, 1975. — 360 с.
  36. A.A., Кравченко А. Т. Профилактика и лечение бешенства: достижения и проблемы // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1989. — № 8. — С. 97 — 104.
  37. В.М. Инактивация культуральной антирабической вакцины УФ-лучами / В. М. Морогова, М. А. Селимов, Т. А. Аксенова и др. // Вопросы вирусологии. 1973. — № 4. — С. 422 — 425.
  38. О.В. Динамика репродукции вируса клещевого энцефалита в культурах клеток / О. В. Морозова, А. Е. Гришечкин, В. Н. Бахвалова и др. // Вопросы вирусологии. 2012. — № 2. — С. 40−43.
  39. МРТУ-42 № 481−72 от 18 января 1972 г. на сухую антирабическую вакцину типа Ферми.
  40. МУ 1.3.2569−2009 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I IV групп патогенности. Методические указания.» — М.: 2009. — 31 с.
  41. МУ 3.3.1.1099 2002 «Безопасность работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства. Методические указания». — М.: 2002. — 28 с.
  42. МУ РД 42−28−10−89 «Аттестация перевиваемых клеточных линий субстратов производства и контроля медицинских и иммунологических препаратов. Методические указания». — М.: 1989. — 33 с.
  43. Ф.Г. Репродукция фиксированного вируса бешенства в культуре перепелиных фибробластов, растущих в суспензии / Ф. Г. Нагиева, М. С. Бектемирова, К. Ш. Матевосян и др. // Вопросы вирусологии. 1980. -№ 4. — С. 429131.
  44. В.В. Способ получения гипериммунной антирабической сыворотки / В. В. Недосеков, И. А. Сливко, В. В. Куриннов и др. // Патент № 2 196 607 РФ, МПК А61К39/205, А61К39/42- 20.01.2003.
  45. В.В. Технология изготовления антирабического антигена / В. В. Недосеков // Материалы международной науч. практич. конф. — Покров, 2002. — С. 225−227.
  46. JI.H. Применение молекулярных методов исследования в генетике / Л. Н. Нефедова. М.: ИНФРА-М. — 2013. — 103 с.
  47. Г. Г. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2011 году / Г. Г. Онищенко // Государственный доклад. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. — 2012. — 316 с.
  48. Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование / Л. А. Остерман. М.: Мир. — 1981. — 120 с.
  49. A.B. Генотипирование серотипов вируса блютанга : автореф. дис.. канд. биол. наук: 03.02.02 / Панфёрова Агнеса Владимировна Покров, 2012. -27 с.
  50. Д.В. ПЦР «в реальном времени» / Д. В. Ребриков, Г. А. Саматов, Д. Ю. Трофимов и др. М.: БИОНОМ. Лаборатория знаний.-2009. — 215 с.
  51. М.А. Бешенство / М. А. Селимов // М.: Медицина, 1978. 336 с.
  52. М.А. Прошлое, настоящее и будущее специфической профилактики гидрофобии (к 100- летию первой пастеровской антирабической прививки) // Вопросы вирусологии. 1986. — № 3. — С. 370−374.
  53. М.А. Современные достижения в рабиологии / М. А. Селимов // Обзорная информация. М.: ВНИИМИ. — 1987. — Вып. 4. — С. 35-^10.
  54. В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В. А. Сергеев // М.: 2007. С. 507.
  55. Н.П. Способ получения высокоспецифичной гетерологичной антирабической сыворотки / Н. П. Ситник, Н. В. Загидуллин, А. Г. Исрафилов и др. // Патент № 2 322 503 РФ, МПК С12Р 21/00, А61К 39/42- 2008.
  56. И.А. Иммунологические свойства вакцинных штаммов ТС-80 и 71 БелНИИЭВ-ВГНКИ вируса бешенства : автореферат дис.. канд. ветер, наук: 16.00.03 / Сливко Игорь Александрович. Покров, 2003. — 24 с.
  57. В.В. Усовершенствование технологии изготовления инактивиро-ванной вакцины против блютанга : автореферат дис.. канд. ветер, наук: 16.00.03 / Сливко Вероника Владимировна. Покров, 2003. — 25 с.
  58. СП 1.3.2322−2008 «Безопасность работы с микроорганизмами III и IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Санитарно-эпидемиологические правила». М.: 2008. — 20 с.
  59. М.Г. Бешенство животных / М. Г. Таршис, H.A. Ковалёв. П. П. Кузнецов. Минск. — 1990. — 175 с.
  60. М. Новые методы иммуноанализа Под общей редакцией У. Коллинза. / М. Тертон, Д. Р. Бангхем, К. А. Колкотт и др. // М.: Мир, 1991. -280 с.
  61. Р.В. Усовершенствование методов идентификации вируса бешенства и выявления антирабических антител : автореф. дис.. канд. ветер, наук: 16.00.03, 03.00.07 / Тимиргалеев Руслан Владимирович. Казань, 2006. — 24 с.
  62. Требования к перевиваемым линиям клеток, используемых для производства биологических препаратов // Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов: серия техн. докладов ВОЗ № 745. Москва. -1998. — С. 85 -98.
  63. Н.И. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н. И. Троценко. Р. В. Белоусова, Э. А. Преображенская. М.: Колос. — 2000. — 272 с.
  64. Физико-химические, химические, физические и иммунохимические методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов. Фармакопейная статья — ФС 42−3874−99. М.: МЗ РФ — 2000. — 77 с.
  65. Р.Я. Культура животных клеток / Р. Я. Фрешни // Практическое руководство. М.: БИОНОМ. Лаборатория знаний. — 2010. — 714 с.
  66. A.B. Крупномасштабное культивирование вируса бешенства в культуре перевиваемых клеток / A.B. Фролова, P.C. Шафеева // Роль иммунобиологических препаратов в современной медицине: матер, науч.- практ. конф. Уфа. — 1995. -Т.1.- С. 191−194.
  67. Atanasiu P. Nouveau vaccine antirabique humain de culture cellulaire primaire / P. Atanasiu, H. Tsiang, A. Gamet // Ann. Microbiolology. 1974. — Vol. 125. — P. 419432.
  68. Baneijee A.K. Transcription and replication of rhabdoviruses / A. K. Baneijee // Molbiol Rev. 1987,-Vol. 51.-№ 2.- P. 229.
  69. Barrett P. Vero cell platform in vaccine production: moving towards cell culture-based viral vaccines / P. Barrett, W. Mundt, O. Kistner et al. // Expert. Rev. Vaccines. -2009.-Vol. 8.-P. 607−618.
  70. Bates J.A. Scorpion ARMS primers for SNP real-time PCR detection and quantification of Pyrenophora teres / J.A. Bates, E.J. Taylor // Molec. Plant Pathology. 2001. -Vol. 2.-275−280.
  71. Black E.M. A rapid RT PCR method to differentials six established genotypes of rabies and rabies-related viruses using TaqMan technology / E.M. Black, J.P. Lowings., J. Smith et al. // J. Viral. Methods. — 2002. — Vol. 105. — P. 25−35.
  72. Bolivar F. Plasmids of Escherichia coli as cloning vectors / F. Bolivar, K. Backman // Met. Enzymology. 1979. — Vol. 68. — P. 245−267.
  73. Bonnet G. Thermodynamic basis of the enhanced specificity of structured DNA probes / G. Bonnet, S. Tyagi, A. Libchaber et al. // Protoc. Natl. Acid Sci USA, 1999. Vol. 96.-P. 6171−6176.
  74. Boom R. Rapid and simple metod for purification of nucleic acids / Boom R., C.J. Sol, M.M. Salimans et al. // J. of Clinic. Microbiology. 1990. — Vol. 28. — P. 498−503.
  75. Borson N.D. Direct quantitation of RNA transcripts by competitive single-tube RT-PCR and capillaryelectrophoresis / N.D. Borson, M.A. Strausbauch, P.J. Wettstein et al. // Biotechniques. 1998. — Vol. 25. — P. 130−137.
  76. Bourhy H. Molecular diversity of the Lyssavirus genus / H. Bourhy, B. Kissi, N. Tordo//Virology. 1993.-Vol. 194.-P. 70−81.
  77. Brookes S. Rabies human diploid cell vaccine elicits cross-neutralising and cross-protecting immune responses against European and Australian bat lyssaviruses / S. Brookes, G. Parsons, N. Johnson et al. // Vaccine. 2005. — Vol. 23. — P. 4101^1109.
  78. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay / S.A. Bustin // J. Mol. Endocrinol. 2000. Vol. 25.-P. 169−193.
  79. Cohen G. Interactions of vesicular stomatitis virus structural proteins with HeLa plasma membranes / G. Cohen, P. Alkinson, D. Summers // Nature N. Biology. 1981. — Vol. 231.-P. 121−123.
  80. Consales C.A. The preparation of cultured rabies virus and the production of antiserum for human use / C.A. Consales, E.G. Valentini, A. Albas et al. // J. of Biolog. Standartization. 1988. -Vol. 16. — P. 27−32.
  81. Conzelmann K.K. Molecular cloning and complete nucleotide sequence of the attenuated rabies virus SAD B19 / K.K. Conzelmann, J.H. Cox, L.G. Schneider et al. // J. Virology. 1990. — Vol. 175 — № 2. — P. 485−499.
  82. Costa W. Immunogenicity and safety of a new Vero cell rabies vaccine produced using serum-free medium / W. Costa, R. Cunha, V. Bolzan et al. // Vaccine. 2007. — Vol. 25.-P. 8140−8145.
  83. Didenko V.V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and amplications / V.V. Didenko // Biotechniques. 2001. — Vol. 31. — P. 1106−1121.
  84. Dietzschold B. Patogenesis of rabies / B. Dietzschold, M. Schnell, H. Koporovski // Curr. Top Microbiol. Immunology. 2005. — Vol. 292. — P. 45−56.
  85. Ishiguro T. Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polimirase chain reaction in the presence of fluorescent intercalater / T. Ishiguro, J. Saitoh, H. Yawata et al. // Anal. Biochemistry 1995. — Vol. 229. — P. 207−213.
  86. Frazzati-Gallina N. Higher production of rabies virus in serum-free medium cell cultures on microcarriers / N. Frazzati-Gallina, R. Paoli, R. Mourao-Fuches et al. // J. of biotechnology. 2001. — Vol. 92. — P. 67−72.
  87. Fuenzalida E. Suckling mouse brain vaccine / E. Fuenzalida // In: Laboratory Techniquesin in Rabies. Third, ed. Ed. by M. M. Kaplan, H. Koprowski. Monogr, Ser. № 23. -WHO.-Geneva.- 1973.-P. 216−221.
  88. Gaudin Y. Folding of rabies virus glycoprotein: epitope acquisition and interaction with endoplasmic reticulumchaperonts / Y. Gaudin // J. Virology. 1997. — Vol. 71. — P. 3742−3750.
  89. Gaudin Y. Identification of amino acids controlling the low-pH-induced conformation change of rabies virus glycoprotein / Y. Gaudin, H. Raux, A. Flamand et al. // J. Virology. 1996. — Vol. 70. — P. 7371−378.
  90. Gaudin Y. Low-pH conformational changes of rabies virus glycoprotein and their role in membrane fusion / Y. Gaudin, R.W. Ruigrok, M. Knossow et al. // J. Virology. -1993.-P. 67.
  91. Gispen R. Suckling rabbit brain vaccine In: Laboratory Techniquesin in Rabies / R. Gispen // Third, ed. Ed. by M. M. Kaplan, H. Koprowski. Monogr, Ser. № 23. WHO. -Geneva. — 1973. — P. 221−228.
  92. Goel S.K. Antibody response to purified chick embryo cell vaccine in equines for production of equine rabies immune globulin / S.K. Goel, S. Sharma, U. Singh // Biologicals. -2003.-Vol. 31.-P. 233−236.
  93. Habel K. Criteria in selection of cells for virus vaccine production / K. Habel // In: Proc. Symp. on the Characterization and Uses of Human Diploid Cell Strain- Yugoslavia. 1973.-P. 277.
  94. Heaton P.R. Heminested PCR assay for detection of six genotypes of rabies and rabies-related viruses / P.R. Heaton, P. Johnsbone, L.M. McElhinney et al. // J. Clin. Microbiol. 1997. — Vol. 35. — P. 2762−2766.
  95. Higuchi R. Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reaction / R. Higuchi, C. Focrler, G. Dollinger et al. // Biotechnology. 1993. — Vol. 11. — P. 10 261 030.
  96. Higuchi R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences / R. Higuchi, G. Dollinger, P. S. Walsh et al. // J. Biotechnology. 1992. — Vol. 10. — P. 413 417.
  97. Hoskins J.M. Duck-embrio vaccine / J.M. Hoskins // In: Laboratory Techniques in Rabies. Third ed. Ed. by M.M. Kaplan, H. Koprowski. Monogr. Ser. № 23. WHO. — Geneva. — 1973. — P. 243.
  98. Jacob Y. Cytoplasmic Dynein LC 8 Interacts with Lyssavirus Phospoprotein / Y. Jacob, H. Badrane et al. // J. Virology. 2000. — Vol. 74. — P. 10 217−10 222.
  99. Jallet C. Chimeric Lyssavirus Glycoproteins with Increased Immunological Potential / C. Jallet, Y. Jacob, C. Bachloul et al. // J. Virology. 1999. — Vol. 73. — P. 225−233.
  100. Karlsen F. SYBR I DNA staining icreases the detection sensitivity of viruses by polymerase chain reaction / F. Karlsen, H.B. Steen, J.M. Nesland // J. Virol. Methods. 1995. -Vol. 55.-P. 153−156.
  101. Kelley J. The glycoprotein of vesicular stomatitis virus is the antigen that given rise to and reacts with neutralizing antibody / J. Kelley, S. Emerson, R. Wanger // J. Virology.- 1972.-Vol. 10.-P. 1231−1235.
  102. Kleppe E. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases / E. Kleppe, E. Ohtsuka, R. Kleppe et al. // J. Molec. Biology. 1971.-Vol. 56.-P. 341−361.
  103. Koch W.H. Technology platforms for pharmacogenomic diagnostic assays / W. H, Koch // Nat. Rev. Drug Discovery. 2004. — Vol. 3. — P. 749−761.
  104. Koprovski H. Vaccine for man prepared in humandiploid cells / H. Koprovski // In: Laboratory Techniques in Rabies. Third ed. Ed. by M.M. Kaplan, H. Koprowski. Monogr. Ser. № 23. WHO. — Geneva. — 1973. — P. 256−261.
  105. Kosinova E. Real-time PCR for quantitation of bovine viral diarrhea virus RNA using SYBR Green I fluorimetry / E. Kosinova, I. Psical, B. Robesova et al. // Veterinarian medicine. -2007. Vol. 52 (6). — P. 259−261.
  106. Larson J.K. Nucleotide and deduced amino acid sequences of the normal nonstructural phoshoprotein of ERA, PM, and COS II strains of rabies virus / J.K. Larson, W.H. Wunner//Nucleic. Acids. Res. — 1990. — Vol. 18. — P. 71−72.
  107. Lay M.J. Real-time fluorescence genotyping of factor V Leiden during rapid -cycle PCR / M.J. Lay, C.T. Wittwer // Clin. Chemistry. 1997. — Vol. 43. — P. 2262−2267.
  108. Lepine P. Fermi-type vaccine / P. Lepine // In: Laboratory Tehniques in Rabies Third ed. Ed. by M. M. Kaplan, H. Koprowski. Monogr. Ser. № 23. WHO. — Geneva. -1973.-P. 199−201.
  109. Liou J.T. An improved alkaline lysis metod for minipreparation of plasmid DNA / J.T. Liou, B.H. Shieh, S.W. Chen, C. Li // Prep. Biochem. Biotechnology. 1999. — Vol. 29.- P. 49−54.
  110. Lodmell D.L. Rabies virus antinucleoprotein antibody protects against rabies virus chalange in vivo in inhibits rabies virus replication in vitro / D.L. Lodmell, J.J. Esposico, L.C. Ewalt // J. Virology. 1993. — Vol. 67. — P. 6080−6086.
  111. Luekrajang T. Production of antirabies serum of equine origin / T. Luekrajang, T. Wangsar, P. Phanuphak // Laboratory techniques in rabies. 1996. — P. 401−403.
  112. Lyon E. Mutation detection using fluorescent hybridization probes and melting curve analysis / E. Lyon // Expert Rev. Mol. Diagn. 2001. — Vol. 1. — P. 92−101.
  113. Marras S.A. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes / S.A. Marras, F.R. Kramer, S. Tyagi // Nucleic Acids Res. 2002. — Vol. 30. — P. 122.
  114. Meslin F. X. General considerations in the production and use of brain tissue and purified chicken embryo rabies vaccines for human use / F. X. Meslin, M. M. Kaplan, H. Koprowski: WHO. — Geneva. — 1996. — P. 221−233.
  115. Meslin F.X. Laboratory techniques in rabies / edited by F.X. Meslin, M.M. Kaplan, H. Koprowski: 4 th ed. WHO. — Geneva. — 1996. — 469 p.
  116. Mhalda M.M. Using Molecular Beacons to Detect Single Nucleotide Polymorphisms with Real-Time PCR / M.M. Mhalda, L. Malmberg // Methods. — 2001. — Vol. 25. — P. 463−471.
  117. Morrison T.B. Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification / T.B. Morrison, J.J. Weis, C.T. Wittwer // Biotechniques. 1998. — Vol. 24. — 954−962.
  118. Muller R.H. Application of ion exchange re sine to the purification of certain viruses / R.H. Muller // Proc. Soc. Exp. Biol. Medicine. 1980. — Vol. 73. — P. 239−241.
  119. Murphy F. A. The emergence of new virus diseases: an overview / F. A Murphy, N. Nathanson // Seminars in Virology. 1994. — Vol. 5. — P. 87−102.
  120. Nikiel J. Attempts to obtain rabies virus haemagglutinins and evalution of their immunogenic properties / J. Nikiel // Bull. Veter. Inst, in Pulawy. 1974. — Vol. 18. — P. 7986.
  121. Ogura M. Use of fluorescent dye YOYO-1 to quantify oligonucleotides immobilized on plastic plates / M. Ogura, C. Keller, K. Koo et al. // Biotechniques. 1994. — Vol. 16.-P. 1032−1034.
  122. Ozkan O. Production of heterolog anti-rabies immune sera. / O. Ozkan, O. Aylan, C. Ates et al. // Etlik Veteriner Mikrobiyoloji Dergisi. 2004. — Vol. 15. — P. 49−54.
  123. Peirson S.N. Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis / S.N. Peirson, J.N. Butler, R.G. Foster // Nucleic Acids Res. 2003, — Vol. 31- P. 73.
  124. Perez O. Production methods for rabies vaccine / O. Perez, C. Paolazzi // J. of indust. microbiology & biotechnology. 1997. — Vol. 18. — 340−347.
  125. Ririe K.M. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction / K.M. Ririe, R.P. Rasmussen, C.T. Wittwer // Anal. Biochemistry. 1997.-Vol. 245.-P. 154−160.
  126. Sagara J. Identification of heat shock protein 70 in the rabies virion / J. Sagara, A. Kawai // J. Virology. 1992. — Vol. 190. — P. 845−848.
  127. Sato G. Genetic and phylogenetic analysis of glycoprotein of rabies virus isolated from several species in Brazil / G. Sato, T. Itou, Y. Shoji et al. // J. Vet. Med. Sci. 2004. -Vol. 66.-P. 747−753.
  128. Sato G. Rapid discrimination of rabies viruses isolated from various host species in Brazil by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction / G. Sato, H. Tanabe, Y. Shoji et al. // J. Clin. Virology. 2005. — Vol. 33. — № 4. — P. 267−273.
  129. Sawai Y. The purification of rabies virus using ion-exchange resins / Y. Sawai, H. Yanaka, M.A. Makino et al. // J. Bacteriology. 1974. — Vol. 9. — P. 509−512.
  130. Schnider L.G. Bat lyssavirus in Europe / L.G. Schnider, J.H. Cox // Curr. Top. Microbiol. Immunology. 1994. — Vol. 187. — № 2. — P. 207−218.
  131. Schneider L.G. Purification of rabies virus from tissue culture / L.G. Schneider, M. Horzinek, M. J. Schnell // Infectious rabies viruses from cloned cDNA // EMBO J. 1994. -Vol. 13.-№ 18.-P. 4195^4203.
  132. Schutten M. Development of real-time quantitative RT-PCR for the detection of HIV-2 RNA in plasma / M. Schutten, B. van den Hoogen, M.E. van der Ende et al. // J. Virol. Methods. 2000. — Vol. 88. — P. 81−87.
  133. Seligman E.B. Semple type vaccine / E.B. Seligman // In: Laboratory Techniquesin in Rabies. Third, ed. Ed. by M. M. Kaplan, H. Koprowski. Monogr, Ser. № 23. -WHO. Geneva. — 1973. — P. 192−199.
  134. Selimov M.A., Aksyonova T.A. Tissue culture antirabic vaccine for human use / M.A. Selimov, T.A. Aksyonova // In: Intern. Sympos. Ser. on Rabies Talloires. 1965- Sympos. Ser. Immunobiol. Standard. — 1966. — Vol. 1. — P. 377−381.
  135. Socol F. Biochemical and biophysical studies on the nucleocapsid and on the RNA of rabies virus / F. Socol, H.D. Schumberger, P.J. Wictor et al. // J. Virology. 1979. -Vol. 38.-P. 651−665.
  136. Socol F. Biochemical of viral vaccines / F. Socol // In «Resent Advances in Microbiology X international Congress for Microbiology»: Ed. by A. Perez-Miravete and D. Pelaez.-Mexico. 1981.-P. 551−562.
  137. Socol F. Purification of rabies virus grown in tissue culture / F. Socol, H.D. Schumberger, P.J. Wictor et al. // J. Virology. 1978. — Vol. 2. — P. 836.
  138. Socol F. Structural phosphoprotains associated with ten rhabdoviruses / F. Socol, H.F. Clark, T.J. Wiktor et al. // J. Gen. Virology. 1974. — Vol. 24. — P. 433−471.
  139. Solinas A. Duplex Scorpion-primers in SNP amalysis and FRET applications / A. ' Solinas, L.J. Brown, C. McKeen et al. // Nucleic Acids Res. 2001. — Vol. 29. — P. 96.
  140. Tagawa A. Studies on purification of rabies virus. Application of methanol precipitation and two other methods / A. Tagawa, W. Ozawa, A. Kondo // Yokohama Med. Bull. 1973.-Vol. 4.-P. 78−86.
  141. Thelwell N. Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection / N. Thelwell, S. Millington, A. Solinas et al. // Nucleic Acids Res. 2000. — Vol. 28. -P. 3752−3761.
  142. Tichopad A. Improving quantitative real-time RT-PCR reproducibility by boosting primer linked amplification efficiency / A. Tichopad, A. Dzidic, M.W. Pfaffl // Biotechnol. Lett. — 2002. — Vol. 24. — P. 2053−2056.
  143. Tichopad A. Standardized determination of real-time PCR effency from a single reaction set-up / A. Tichopad, M. Dilger, G. Schwarz et al. // Nucleic Acids Res. 2003. -Vol. 31.- 122 p.
  144. Trabelsi K. Optimization of virus yield as a strategy to improve rabies vaccine production by Vero cells in a bioreactor / K. Trabelsi, S. Rourou, H. Loukil et al. // J. Biotechnology. 2006. — Vol. 121. — P. 261−271.
  145. Tordo N. The rabies virus genome: an overview / N. Tordo, A. Kouknetroff // J. Vet. Res. 1993. — Vol. 60. — P. 263−269.
  146. Tordo N. Walking along the rabies genome: is the large G-L intergenic region a remnant gene? / N. Tordo, O. Poch, A. Ermine et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. -Vol. 83.-P. 3914−3918.
  147. Tuffereau C. Interaction of lyssaviruses with the low-affinity nerve-growth factor receptor p75NTR / C. Tuffereau, E. Desmezieres, J. Benejean et al. // Gen. Virology. -2001.-Vol. 82.-№ 12.-P. 2861−2867.
  148. Tyagi S. Molecular beacons: probes that fluorense upon hybridization / S. Tyagi, F.R. Kramer // Nat. Biotechnology. 1996. — Vol. 14. — P. 303−308.
  149. Tyagi S. Multicolor molecular beacons for allele discrimination / S. Tyagi, D.P. Bratu, F.R. Kramer // Nat. Biotechnology. 1998. — Vol. 16. — P. 49−53.
  150. Yang J. Phoshorylation of Rabies Virus Nucleoprotein Regulates Viral by Transcription and Replication by Modulating Leader RNA Encapsidation / J. Yang, H. Koprowski, B. Dietzschold et al. // J. Virology. 1999. — Vol. 73. — P. 1661−1664.
  151. VanGuilder H.D. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis / H.D. VanGuilder, K.E. Vrana, W.M. Freeman // Biotechniques. 2008. — Vol. — 44. -P. 619−626.
  152. Wacharapluesadee S. Development of a TaqMan real-time RT-PCR assay for the detection of rabies virus / S. Wacharapluesadee, J. Sutipauya, S. Damrougwatanapokin et el. // J. Virol. Methods. 2008. — Vol. 151. — № 2. — P. 317−320.
  153. Wagner R.R. Protein composition of the structural components of vesicular stomatitis virus / R.R. Wagner, T.C. Schaitman, R.M. Snyder et al. // J. Virology. 1979. — Vol. 3. -P. 611−618.
  154. Wagner R.R. Rabdoviridae and their replication / R.R. Wagner // Comprehensive virology. New York. — 1975. — P. 1−94.
  155. WHO Expert Consultation on Rabies: first report. WHO technical report series 931. Geneva. — 2004. — 121 p.
  156. Wictor T.J. Antigenic properties of rabies virus components / T.J. Wictor, E. Gyorgy, H.D. Schlumberger et al. // J. Immunology. 1973. — Vol. 110. — P. 269−276.
  157. Wilde H. Adverse effects of^equine rabies immune globulin / H. Wilde, P. Chomchey, S. Prakongsri et al. // Vaccine. 1989. — Vol. 7. — P. 10−11.
  158. Wilde H. Posexposure treatment of rabies infection: can it be done without immunoglobulin? / H. Wilde, P. Khawplod, T. Hemachudha et al. // Clinic. Infectious Deseases. 2002. — Vol. 34. — P. 47780.
  159. Willams J.F. Optimization strategies for the polymerase chain reaction / J.F. Willams // Biotechniques. 1989. — Vol. 7. — P. 762−776.
  160. Whitcombe D. Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence / D. Whitcombe, J. Theaker, S.P. Guy et al. // Nat. Biotechnology. 1999. — Vol. 17.-P. 804−807.
  161. Wunner W.H. The molecular biology of rabies viruses / W.H. Wunner, J.K. Larson, B. Dietzschold et al. // Rev. Infect. Dis. 1988. — Vol. 10. — P. 1149−1158.
Заполнить форму текущей работой

Пора сдавать?