Синтез олигонуклеотидов с гидрофобными заместителями и их применение для детекции повреждений в ДНК

В настоящее время область электрохимических исследований ДНК находится в стадии интенсивного развития, вызванного интересом к созданию электрохимических датчиков для определения нуклеотидной последовательности и детекции точечных повреждений в ДНК-дуплексах [1−3]. Совершенствующиеся методы диагностики, предупреждения и лечения многих типов заболеваний требуют создания новых эффективных и недорогих устройств для определения последовательности ДНК и РНК. Быстрые, точные и, в то же время, доступные методы детекции дефектов в структуре ДНК, кроме того, необходимы при проведении экологических исследований. Основным преимуществом электрохимических устройств детекции является их доступностьбыстрый отклик, небольшие размеры, простота использования и низкие затраты энергии в процессе работы.

Классические амперометрия и полярография — основные электрохимические методы анализа, существовавшие в начале 80х годов XX века, со временем перестали удовлетворять требованиям, выдвигаемым к методам анализа ДНК. Олигои полинуклеотиды заданной последовательности, синтезируемые химическими методами, а такжеметодами генетической инженерии в плазмидах и вирусах, были дороги и требовали чувствительных методов анализа. С этой точки зрения биохимические и молекулярно-биологические методы анализа имели преимущество, поскольку позволяли иметь дело с меньшими количествами веществ.

Необходимостью уменьшения предела обнаружения ДНК на порядки вызвано появление уникальных методов электрохимического анализа, связанных с изучением поведения фрагментов ДНК на электродных поверхностях. В частности, группой под руководством Палечека было обнаружено, что ДНК способна легко адсорбироваться на поверхности ртутных и углеродных электродов при их погружении в раствор олигонуклеотидов на несколько минут [4−7]. Эти исследования положили начало работы с ДНК-модифицированными электродами, которые в течение следующего десятилетия стали доминировать в качестве основы биосенсоров, используемых для качественного и количественного определения ДНК [3, 8].

Электрохимическим биосенсором в традиционном понимании считается устройство, позволяющее регистрировать биохимический процесс посредством его перевода на язык электрических сигналов. Как правило, основой биосенсоров являются различные электроды, содержащие иммобилизованные молекулы-зонды, способные взаимодействовать с молекулами-мишенями, образуя ковалентно-связанные или супрамолекулярные комплексы.

Сигналы, используемые для регистрации процесса узнавания или химической реакции на поверхности биосенсора, имеют электрическую природу и чаще всего представляют собой пики окисления-восстановления электроактивных веществ, участвующих в процессе.

Сенсоры, используемые для детекции ДНК-гибридизации [9], в большинстве случаев основаны на способности ДНК, иммобилизованной на поверхности электрода, гибридизоваться с комплементарной последовательностью из раствора. Чувствительные сенсоры, созданные на основе иммобилизованных фрагментов ПНК, проявляющих высокую селективность к полностью комплеметарным фрагментам ДНК, [10,11], позволили детектировать однобуквенные замены в составе достаточно протяженных последовательностей. В настоящее время, с использованием высокочувствительных электрохимических методов анализа, точечные мутации детектируют, например, используя разницу в температурах плавления дефектных и совершенных дуплексов [12,13] без использования дорогостоящих ПНК. Следует отметить, что практически все работы по сенсорам, регистрирующим ДНК-гибридизацию, основаны на экспериментах с достаточно короткими модельными последовательностями.

Наряду с разработкой сенсоров для детекции гибридизации имеются также работы по созданию сенсоров для детекции повреждений в составе ДНК [14]. Работы в этом направлении ведутся в основном с целью обнаружения повреждений в природных последовательностях ДНК, а также с целью детекции электроактивных веществ, способных связываться с ДНК-сенсором.

ДНК-сенсоры [15] для детекции гибридизации, однобуквенных несоответствий и повреждений в структуре нуклеиновых кислот можно разделить на два основных типа по природе регистрируемого электрохимического сигнала: это либо сигнал окисления-восстановления самой ДНК, либо сигналы дополнительно вводимых в реакционную среду электроактивных маркеров. В первом типе задействованы процессы окисления или восстановления пуриновых [16] и, в меньшей степени, пиримидиновых оснований ДНК.

Общей закономерностью здесь является достаточно высокие значения потенциалов как окисления, так и восстановления оснований, а также необратимость процесса и низкая чувствительность к изменениям структуры ДНК [3,8,9].

В этой связи, причиной создания сенсоров второго типа явились попытки улучшения данных показателей за счет применения электрохимических индикаторов (маркеров). Такие соединения позволяют использовать способность ДНК к комплексообразованию и химической модификации с целью получения отклика сенсора за счет протекания обратимых процессов, обладающих более высокой чувствительностью к изменениям в структуре ДНК, при невысоких значениях потенциала. Следует отметить, что интерес к исследованиям взаимодействий ДНК с интеркаляторами и другими нековалентно связывающимися с ДНК соединениями вызван, в том числе, разработкой ДНК-биосенсоров и поиском подходящих для этой цели электроактивных маркеров [2,3].

Ковалентная модификация ДНК с целью введения электроактивных молекул также получила достаточно широкое развитие, начиная с работ, в которых изучались аддукты ДНК с комплексами тетраоксида осмия [17−20], впоследствии получившими распространение в качестве ковалентно присоединяемых электроактивных маркеров [21,22].

Существует достаточно много подробных и интересных обзоров, посвященных ДНК-биосенсорам (геносенсорам) [23−28], методам детекции гибридизации ДНК [29] и поведению ДНК на поверхностях электродов [30,31].

Целью данного обзора является обобщение и классификация методов, используемых на данный момент для иммобилизации и детекции ДНК. Классификация осуществлена, прежде всего, по материалу электродов (рассмотрены графитовые и золотые электроды), а также по способу иммобилизации и природе возникновения электрохимического сигнала. Круг вопросов, рассмотренных в данном обзоре, не включает работы по созданию ДНК-белковых биосенсоров, представляющие тему для отдельного литературного исследования, и ограничивается лишь электрохимическими свойствами ДНК и низкомолекулярных электроактивных индикаторов, используемых при ее детекции.

2.5. Выводы.

1. Показана возможность использования олигонуклеотидов с гидрофобными заместителями для детекции гибридизации и наличия повреждений в ДНК.

2. Впервые синтезированы олигонуклеотиды, содержащие остатки олеиламина в М-положении цитидина, а также 12-тритилмеркаптододеканола-1 и 12-меркаптододеканола на 5'-концах. Концевые гидрофобные заместители оказывают незначительное влияние на термическую стабильность ДНК-дуплексов.

3. Впервые осуществлена детекция гибридизации олигонуклеотидов, содержащих остатки олеиламина, на поверхности липосом диолеилфосфатидилхолина.

4. Присутствие однои двухцепочечных олигонуклеотидов с остатками олеиламина вызывает сдвиг изотерм сжатия липидных монослоев на поверхности раздела вода-воздух, благодаря чему впервые зафиксирована гибридизация олигонуклеотидов с остатками олеиламина на поверхности фосфолипидного монослоя.

5. Впервые показано, что олигонуклеотиды с остатками 12-меркаптододеканола-1, иммобилизованные на золотом электроде, могут применяться для детекции АП-сайтов и дезаминированных оснований в ДНК-дуплексах. На их основе создан прототип биосенсора для детекции повреждений в ДНК по сигналам электрохимических индикаторов метиленового синего и ферроцианида калия.

1.8.

Заключение

.

В течение последних десятилетий наблюдался значительный прогресс в создании и применении электрохимических ДНК-сенсоров. По сравнению с традиционными методами исследования ДНК использование биосенсоров представляется зачастую более эффективным вследствие более быстрой, простой и недорогой детекции ДНК-гибридизации и наличия ДНК.

Большая распространенность углеродных биосенсоров к настоящему моменту определяется доступностью материала электродов (прежде всего, благодаря широкому применению трафаретных электродов), а также широкому интервалу потенциалов, в котором возможно проводить измерения. Недостатками углеродных поверхностей при использовании в биосенсорах является необходимость достаточно сложных методов иммобилизации для получения сенсоров с хорошей эффективностью гибридизации. В виду сложной и неоднородной структуры поверхности углеродных электродов необходима дальнейшая разработка методов иммобилизации, которые позволяли бы создавать максимально однотипные биосенсоры с точки зрения однородности поверхностного слоя. Интересными разработками в данной области можно назвать использование многостенных углеродных нанотрубок, которые наряду с удобством иммобилизации позволяют добиться большей эффективности полученного при гибридизации электрохимического отклика.

Достойную альтернативу углеродным представляют золотые электроды, на которых хорошо изучено образование самоорганизующихся монослоев серосодержащих молекул. Данный метод иммобилизации позволяет создавать более однородные по структуре поверхности и, соответственно, более воспроизводимые биосенсоры. Эффективность гибридизации также может быть повышена благодаря упорядоченной структуре монослоев. Поэтому золотые электроды, особенно недорогие трафаретные и полученные методом фотолитографии, представляются на данный момент более удобными. Среди методов детекции ДНК на поверхности электродов преобладает использование электрохимических индикаторов. Однако существенным недостатком большинства из используемых на данный момент электроактивных низкомолекулярных соединений является их способность связываться не только с двухцепочечными, но и с одноцепочечными фрагментами ДНК на поверхности электрода, прежде всего благодаря электростатическим взаимодействиям с фосфатными группами остова ДНК. Решения этой проблемы существуют, однако основаны на более сложных подходах, например, при использовании индикаторов, способных эффективно связываться как с двухцепочечным участком ДНК на электроде, так и негибридизованной одноцепочечной частью целевой ДНК. Проблемой является также достаточно высокий фоновый сигнал индикатора, возникающий благодаря его способности к прямой диффузии к поверхности электрода. В этой связи часто необходимым является дополнительное экранирование поверхности, как, например, в случае создания слоев алкантиолов на ДНК-модифицированном золотом электроде, или использование инверсионных методик, характеризующихся достаточно высокой дороговизной оборудования и анализа. Кроме того, к безусловным недостаткам можно отнести невысокую стабильность, а также токсичность большинства используемых индикаторов.

Однако использование индикаторов позволяет существенно расширить возможности детекции мисматчей, например в случае использования индикатора метиленового синего. Использование магнитных частиц позволяет в существенной степени решить проблему неспецифической адсорбции, однако, строго говоря, данный метод нарушает концепцию биосенсора, поскольку оказываются разделенными стадии узнавания и получения электрохимического отклика.

Таким образом, работы по созданию эффективных ДНК-биосенсоров (геносенсоров) еще далеки от завершения. Приоритетными направлениями на данный момент являются детекция однобуквенных замен и увеличение отношения сигнал/шум. В табл. 1.5 приведены основные преимущества и недостатки используемых в настоящее время методов электрохимической детекции ДНК, а также указана приблизительная чувствительность рассмотренных методов.