Разработка технологии иммобилизованной ?-фруктофуранозидазы, исследование ее физико-химических свойств и практическое применение

Актуальность работы. Одной из актуальных задач современной биотехнологии является разработка высокоэффективных препаратов иммобилизованных ферментов. Иммобилизованные ферментные препараты имеют ряд преимуществ перед свободными (нативными) ферментами: более высокую стабильность, возможность создания непрерывных и полунепрерывных автоматизированных процессов, способность к длительному функционированию полиферментных систем без экзогенных кофакторов и многократное их применение.

Среди гидролитических ферментов Р-фруктофуранозидаза (2,1-p-D-фруктофуранозид-фруктогидролаза, инвертаза, К.Ф. 3.2.1.26) занимает важное место ввиду возможности ее использования в реакциях гидролиза сахарозы с целью получения инвертного сиропа, широко используемого в пищевой промышленности. Однако ферментативный процесс получения инвертных сиропов имеет ряд недостатков: нестабильность активности фермента, его высокая стоимость, однократность использования. Эти недостатки можно устранить с помощью иммобилизации Р-фруктофуранозидазы.

На сегодняшний день изучаются различные методы иммобилизации p-фруктофуранозидазы, такие как физическая сорбция на гидрофобных адсорбентах, включение в гидрофобные гели, ковалентная иммобилизация на нейлоне и др. Предлагаемые способы иммобилизации, как отечественных, так и зарубежных исследователей, чаще всего основаны на ковалентном присоединении фермента к носителю с использованием дополнительных агентов (глутаровый альдегид, ангидрид и др.), что усложняет процесс, а также имеют достаточно высокую стоимость носителя. При этом свойства иммобилизованного препарата и кинетические характеристики реакции гидролиза сахарозы недостаточно изучены. Большинство работ по выбору наиболее перспективных носителей для иммобилизации p-фруктофуранозидазы принадлежат зарубежным исследователям: Huang Chen-ta и Lee Wen-Chien (1994), Basha S.Y., Palanivelu P. (2000), Belcarz A., Ginalska G. (2002) и другим ученым. В России известные способы получения инвертного сиропа с применением иммобиллизованного фермента инвертазы немногочисленны, предусматривают применение дорогостоящих носителей для иммобилизации, не могут быть рекомендованы к применению в промышленных масштабах из-за малого выхода конечного продукта. Все выше изложенное свидетельствует об актуальности исследований в данном направлении.

Перспективным способом получения инвертного сиропа является гидролиз сахарозы иммобилизованной Р-фруктофуранозидазой КЫууеготусеъ тагхгапш У-303, каталитическая активность которой в 2−3 раза превышает активность р-фруктофуранозидаз известных и описанных в литературе продуцентов.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежского государственного университета инженерных технологий по проблеме «Научные основы и практическое • применение биокаталитических технологий в биоконверсии природных полимеров» и в рамках научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники».

Цель и задачи исследования

Целью диссертационной работы явилось получение иммобилизованного ферментного препарата Р-фруктофуранозидазы КЫууеготусеБ тагхшгш У-303 с максимальным сохранением активности и стабильности фермента и разработка биотехнологии инвертного сиропа с его применением.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

— получение высокоочищенного ферментного препарата р-фрукто-фуранозидазы КЫууеготусей татгхапи$ У-303;

— выбор и обоснование применения эффективного носителя для иммобилизации Р-фруктофуранозидазы;

— оптимизация условий иммобилизации р-фруктофуранозидазы;

— сравнительная характеристика физико-химических свойств свободной и иммобилизованной р-фруктофуранозидазы, кинетических и термодинамических параметров кислотной и термической инактивации фермента;

— изучение кинетических характеристик реакции гидролиза сахарозы иммобилизованным ферментом;

— разработка биотехнологии инвертного сиропа с применением иммобилизованной Р-фруктофуранозидазы.

Научная новизна. Впервые получен иммобилизованный ферментный препарат Р-фруктофуранозидазы К1, тагхгапт У-303 на волокнистом ионооб-меннике марки ФИБАН А-6 и исследованы физико-химические и каталитические свойства иммобилизованного фермента. Выявлены закономерности процесса термической и кислотной инактивации фермента. Изучены кинетические характеристики ферментативного гидролиза сахарозы иммобилизованным ферментным препаратом, установлено увеличение кратности использования фермента в реакции гидролиза сахарозы и сохранение высокой каталитической активности при длительном его хранении.

Научная новизна технических решений подтверждена патентом РФ «Способ получения иммобилизованной Р-фруктофуранозидазы» № 2 327 738 от 27.06.2008 г.

Практическая значимость работы. Получен высокостабильный биокатализатор путем адсорбционной иммобилизации Р-фруктофуранозидазы на волокнистом ионообменнике марки ФИБАН А-6, отличающийся многократностью использования в нескольких реакционных циклах и стабильностью при длительном хранении. Разработана биотехнология инвертного сиропа с применением иммобилизованной инвертазы, позволяющая удешевить стоимость целевого продукта.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на научных конференциях Воронежского государственного университета инженерных технологий (2004,2005,2012 гг.) 1 [ '.

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 6 работ, в том числе 3 — в изданиях, рекомендованных ВАК, получен патент РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка используемой литературы и представлена на 135 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал включает 21 рисунок и 15 таблиц. Библиография включает 202 наименования, в том числе 117 зарубежных авторов.

Заключение

.

Таким образом был получен препарат Р-фруктофуранозидазы, установлены оптимальные условия автолиза дрожжей К1. тагхгапш У-303 с целью выделения фермента из дрожжевых клеток: температура 40 °C, продолжительность -60 часов.

Осаждение органическими растворителями лучше вести при величине рН 5,0−5,5, а из исследуемых осадителей (органические растворители и танин) наиболее эффективен этиловый спирт при концентрации его в смеси 67%.

Получена высокоочищенная Р-фруктофуранозидаза с удельной активностью 2700 ед на 1 мг белка и степенью очистки 143 раза. Молекулярная масса, определенная методами электрофореза и гель-фильтрации, составляет 130 и 260 кДа соответственно, что позволило предположить о наличии двух субъединиц в структуре фермента.

Определен аминокислотный состав Р-фруктофуранозидазы, при этом отмечено высокое содержание глютаминовой и аспарагиновой кислот.

Осуществлена иммобилизация высокоочищенного ферментного препарата р-фруктофуранозидазы К1. тагхгапш У-303 адсорбционным способом на волокнистом ионообменнике марки ФИБАН А-6 (Беларусь) и установлены оптимальные условия данного процесса: температура (22±3) °С, рН 4,0, масса носителя 1,0 г, удельная емкость волокнистого носителя 0,7 мг белка/г носителя, длительность процесса иммобилизации — 40 мин. Установлено, что полученный ферментный препарат сохраняет до 70% активности от активности свободного фермента.

Исследованы каталитические свойства иммобилизованного фермента. Изучено влияние рН и температуры на активность иммобилизованной р-фруктофуранозидазы. Показано, что максимальную активность как свободный, так и иммобилизованный фермент проявляют при рН 4,0. Температурный оптимум Р-фруктофуранозидазы, иммобилизованной на волокнистом носителе, смещается в область более высоких температур и составляет 70 °C, что на 20 °C больше, чем у свободного фермента.

Исследована термоинактивация иммобилизованного фермента. Показано, что остаточная активность иммобилизованного фермента при 70 °C после 60 мин инкубации составила 66% от исходной, тогда как свободный фермент при 60 °C сохраняет 48% активности. Нагревание (3-фруктофуранозидазы при 80 °C в течение 45 мин приводит к неполной инактивации иммобилизованного фермента: он сохраняет 2% каталитической активности, что свидетельствует об увеличении термостабильности за счет связывания с носителем. Наблюдаемое объясняется тем, что при взаимодействии тепловой энергии на иммобилизованную (3-фруктофуранозидазу при температурах от 60 °C до 70 °C разрушение гидрофобных взаимодействий и других слабых связей не имеют места, а также увеличением жесткости третичной структуры фермента.

Анализ полученных результатов при вычисление констант кислотной и термической инактивации свободной и иммобилизованной фруктофуранозидазы свидетельствует о более высокой термоустойчивости иммобилизованного фермента по сравнению со свободным: константы скорости инактивации для иммобилизованного препарата р-фруктофуранозидазы при любой температуре будут ниже, чем для свободного фермента.

Изучение кинетико-термодинамических аспектов процесса гидролиза сахарозы иммобилизованной Р-фруктофуранозидазой показало, что при адсорбции наблюдается увеличение Кт и уменьшение Утах, которые составляют 3,3−10″ 4 моль/л и 35±0,9 мкмоль-мг/мин соответственно.

Очевидно ионообменное волокно ФИБАН А-6 достаточно прочно связывается с Р-фруктофуранозидазой, обеспечивая более высокую термои сохранение рН-стабильности белка, при этом незначительно меняется конформа-ция субъединиц белка, т. к. иммобилизованный фермент проявляет достаточно высокую каталитическую способность после взаимодействия с матрицей волокна.

Разработан биокатализатор гидролиза сахарозы на основе (3-фруктофуранозидазы, иммобилизованной на волокнистом ионообменнике марки ФИБАН А-6 со следующими характеристиками: удельная емкость 0,7 ед белка/г носителя, начальная удельная активность 1890 ед/ мг белка, скоо рость подачи раствора сахарозы 3 см /мин сверху вниз.

Установлено, что данный бикатализатор сохраняет до 80% каталитической активности при длительном хранении в холодильной камере (4−6 мес.) и до 70% при многократном использовании (3−4 раза).

4.2 Получение инвертного сиропа.

В последнее время особое место в решении вопроса по повышению качества пищевых продуктов занимает замена сахарных сиропов, используемых при производстве различной продукции, инвертными, которые обладают хорошей влагоудерживающей способностью, низкой кристаллизацией, а высокое осмотическое давление этих сиропов предотвращает возможность микробного инфицирования пищевых продуктов.

С целью получения инвертного сиропа проводили ферментативный гидролиз сахарозы иммобилизованной на волокнистом ионообменнике ФИБАН А-6 (З-фруктофуранозидазой.

Получение инвертного сиропа осуществляли непрерывно путем пропускания раствора сахарозы через колонку, содержащую слой волокнистого ионо-обменника ФИБАН А-6 с иммобилизованным ферментным препаратом р-фруктофуранозидазы. Расход ферментного препарата обеспечивает его активность в количестве 6−8 ед на грамм сахарозы. Раствор пропускали со скоростью 3 мл/мин.

В ходе исследований было изучено влияние температуры на изменение константы скорости гидролиза (Кг) сахарных сиропов различной концентрации (табл. 4.2).