Разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле)

Актуальность проблемы.

Многолетний опыт использования вакцинации как средства специфической профилактики особо опасных инфекций свидетельствует о сохранении ее весомой роли (Исупов И.В., Бугоркова С. А., Кутырев В. В., 2004). В практике проведения противоэпидемической работы в нашей стране широко применяют живые вакцины. Один из таких препаратов представляет собой вакцину из штамма ЕВ чумного микроба. Совершенствование специфической профилактики чумы является одной из актуальных задач обеспечения эпидемического благополучия. (А.И. Коротяев, С. А. Бабичев, 2002). Эпидемический потенциал чумной инфекции, оставаясь в настоящее время довольно напряженным, обусловлен существованием в нашей стране и на сопредельных территориях очагов чумы с постоянно протекающими в них эпизоотиями (Сулейманов Б.М., 1995; Онищенко Г. Г., Кутырев В. В., 2004). Исследования отечественных ученых показали, что наиболее эффективным препаратом противоэпидемического значения является вакцина чумная живая из штамма EV (Борисов Л.Б., 2002).

Наиболее важным вопросом, возникающим при приготовлении живых вакцин, является необходимость сохранения всех свойств микробов в течение длительного времени, то есть стабилизация качества препарата. Тактика совершенствования чумной вакцины осуществляется в направлении разработки и внедрения в производство дополнительных условий стабилизации числа живых микробных клеток в прививочной дозе коммерческой вакцины.

Одним из существенных и принципиально нерешенных вопросов остается значительное снижение количества живых микробных клеток в вакцинирующей дозе, особенно к концу срока годности препарата, что само по себе является свойством закономерным, поскольку, согласно большому литературному материалу и многолетнему опыту изучения свойств чумных вакцин, метод лиофильного высушивания не способен обеспечить полной и длительной стабилизации свойств биообъектов, в том числе и чумной вакцины.

Из факторов, влияющих на выживаемость микроорганизмов в процессе высушивания и дальнейшего хранения, наиболее важную роль играет состав защитной среды и окружающая температура. В настоящее время среды высушивания достаточно хорошо изучены, определен необходимый состав ингредиентов, включающий кристаллоидные, коллоидные вещества и антиокислители, но выбор их осуществляется в основном эмпирически, без достаточного учета современных знаний механизма защиты бактериальных клеток на различных этапах лиофилизации и хранения. Несмотря на то, что основные этапы производства коммерческого препарата строго регламентированы, некоторые количественные параметры вакцины колеблются в значительных пределах. Например, общее число микробных клеток в 1 мл вакцинной суспензии согласно регламентирующей документации составляет от 50 до 100 млрд.

Важным моментом биотехнологии производства чумной вакцины является оптимизация процентного содержания компонентов на единицу взвешенных в среде микробных клеток и отработка режимов лиофилизации, которые позволили бы достигать низкой потери массы при высушивании.

В контексте сказанного следует обратить внимание на разработку биотехнологии изготовления чумной вакцины со сниженным числом человеко-доз в ампуле. Указанная форма является удобной для проведения иммунизации сравнительно небольших по численности коллективов, когда ресуспендированный препарат не может длительно храниться и должен быть сразу же использован. Изменение параметров указанной вакцины касается не только густоты вакцинной суспензии, что отражается на количественном соотношении микробных клеток и стабилизатора, но и уменьшенного объема вакцины в ампуле.

Цель исследования: разработка биотехнологии вакцины чумной живой сухой со сниженным содержанием человеко-доз в производственной упаковке, соответствующей качественным требованиям регламента производства для чумной вакцины (№ 1542−04) и имеющей экономический эффект при одновременной иммунизации небольших групп людей.

Основные задачи исследования:

1. Экспериментально обосновать оптимальное количество человеко-доз в ампуле с коммерческим препаратом с минимальным показателем поврежденных микробных клеток в нем в процессе хранения.

2. Стабилизировать показатели жизнеспособности и термостабильности бактерий в препарате вакцины чумной живой сухой за счет более оптимального соотношения действующих компонентов стабилизатора на единицу взвешенных в нем живых микробных клеток.

3. Научно обосновать достижение в условиях регламентированного режима лиофилизации состояния более глубокого анабиоза микробных клеток, характеризующегося показателем потери в массе при высушивании, не превышающем 1,5%.

4. Определить в эксперименте качественные преимущества вакцины чумной живой сухой с концентрацией микробных клеток в суспензии МО10 — 4-Ю10, разлитой в объеме 1 мл в ампуле, перед коммерческим препаратом.

5. Разработать и внедрить в производство вакцины чумной живой сухой на этапе сведения и разлива методологию получения препарата с меньшим числом подкожных (внутрикожных) человеко-доз в ампуле (20−50), отвечающей качественным требованиям нормативной документации.

Научная новизна работы.

Экспериментально обосновано, что вакцина со сниженной концентрацией микробов в ампуле вследствие более сбалансированного соотношения микробных клеток и защитной среды, обладает новыми качественными характеристиками, превосходящими стандартные коммерческие образцы (жизнеспособность, термостабильность).

Показано, что в условиях регламентированного режима лиофилизации повышается эффективность стабилизации свойств микробных клеток у препарата с меньшей концентрацией вакцинной суспензии и снижением ее объема в ампуле. Критерием более глубокого анабиоза рекомендован показатель потери в массе при высушивании, не превышающий 1,5%. При индивидуализации режима высушивания для данного препарата длительность сушки сокращается с 28 до 18 часов.

Впервые оптимизировано количество человеко-доз в ампуле с коммерческим препаратом, обладающим преимуществом в области практического применения, заключающемся в удобстве при иммунизации небольших коллективов (от 20 до 50 человек). Препарат наиболее эффективен при использовании в регионах с жарким климатом и специфическими условиями вакцинации, например, в немногочисленных, расположенных на значительном расстоянии друг от друга точках: стойбищах скотоводов, охотников и т. д., а также в относительно ограниченных коллективах: лабораториях, работающих с возбудителем чумы, командах судов, осуществляющих заграничное плавание, и др.

Впервые отработана и внедрена в биотехнологию производства вакцины чумной живой сухой и соответственно в нормативную документацию концентрация микробных клеток в вакцинной суспензии (1−4) • Ю10 в объеме 1мл в ампуле.

Теоретическая и практическая значимость диссертации.

Разработана биотехнология вакцины чумной живой сухой со сниженным содержанием человеко-доз в производственной упаковке, соответствующей требованиям нормативной документации. Проведенные исследования позволили дополнительно стандартизировать коммерческий препарат вакцины чумной живой сухой, предназначенной для проведения иммунизации в немногочисленных коллективах (20−50 человек), и обосновать экономический эффект ее использования.

Методология приготовления вакцины с меньшим количеством человеко-доз оптимизирована также к глубинному методу получения биомассы чумных микробов EV, в том числе на иммобилизованных магнитоуправляемых носителях.

Разработаны условия стабилизации вакцины с густотой вакцинной суспензии (1−4) • 1010 м.к. в объеме 1 мл в ампуле с регламентированным режимом лиофилизации, предполагающим возможность сокращения общего времени отторжения влаги в среднем на 10 часов.

Живая чумная вакцина, полученная по новой схеме, прошла контроль в лаборатории препаратов против чумы и других особо опасных инфекций ГИСК им. JL А. Тарасевича, в соответствии с этим внесены изменения в нормативную документацию.

Практическая ценность работы подтверждена следующими документами:

Изменениями № 1 к регламенту производства № 1542−04 дополнительно предусмотрен выпуск вакцины с густотой вакцинной суспензии (1−4) • Ю10 м.к. в объеме 1 мл в ампуле.

Разработана и находится на утверждении в Фармакологическом Комитете РФ Фармакопейная статья предприятия (ФСП) «Вакцина чумная живая сухая».

Утверждены директором Ставропольского НИПЧИ «Методические рекомендации по глубинному культивированию вакцинного штамма чумного микроба с использованием магнитоуправляемых иммобилизованных систем», одобренные Ученым Советом института 29.03.2004 г. (Протокол № 3).

Диссертационная работа выполнена в рамках государственной темы НИР № ГР 01.2.402 924 «Стабилизация показателей живых микробных клеток в чумной вакцине за счет оптимизации некоторых количественных параметров на этапе приготовления коммерческого препарата».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Новые условия стабилизации числа живых чумных микробов в прививочной дозе вакцины ЕВ в условиях производства и хранения на этапах сведения, розлива и лиофилизации, что является приоритетом в вопросах совершенствования живых вакцинных препаратов против чумы.

2. Биотехнология производства вакцины чумной живой сухой, использующая более рациональное соотношение «микробная клетка-среда высушивания» при выпуске вакцины со сниженным числом доз в ампуле, обеспечивает повышение качества препарата, позволяет получить экономический эффект при вакцинации ограниченного контингента людей.

3. Разработанная схема лиофилизации живой чумной вакцины с параметрами (1−4) • Ю10 м.к. в объеме 1 мл обеспечивает глубокий анабиоз микроорганизмов с показателем потери в массе при высушивании, не превышающем 1,5%, при снижении времени лиофилизации до 18 часов.

4. Полученный по разработанной биотехнологии препарат соответствует требованиям, предъявляемым к вакцине чумной живой сухой, и предназначен для планового практического применения, дополняя арсенал профилактических препаратов против чумы, используемых для массовых иммунизаций в особых условиях. и.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на научных конференциях СтавНИПЧИ 2003, 2004, 2005 гг, научно-практической конференции «Актуальные проблемы эпиднадзора за природно-очаговыми и особо опасными инфекциями в регионе Северного Кавказа» (Ставрополь, 2005), на заседании Ставропольского регионального отделения общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 2005 г.- на VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005).

Публикации.

Основное содержание диссертации отражено в 9 опубликованных научных работах (депонирована — 1, в научных сборниках — 8).

Структура и объём работы.

Диссертация изложена на 117 страницах и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 221 источник, в том числе 178 работ отечественных и 43 — зарубежных авторов. Материалы исследований иллюстрированы 16 таблицами и 6 рисунками.

выводы.

1. Впервые разработана производственная биотехнология вакцины чумной живой сухой с содержанием 20−50 человеко-доз в ампуле, полностью соответствующей требованиям регламента производства для чумной вакцины (№ 1542−04).

2. Использование на этапе сведения вакцины, выращенной на плотных питательных средах в АКМ-Ш, добавляемого расчетного количества глютаминового или тиомочевинового стабилизатора обеспечивает получение вакцинной суспензии, содержащей 1−4 • Ю10 м.к./мл, и эффективно сохраняющей свои биологические свойства на последующих этапах производства вакцин и ее хранении.

3. Уменьшение, по сравнению с коммерческой чумной вакциной, объема бактериальной суспензии до 1 мл в ампуле способствует эффективному удалению из препарата влаги, конечная концентрация которой не превышает 1,5%, и снижению времени лиофилизации до 18 часов. При этом наступает стабилизация показателя жизнеспособности микроорганизмов, не изменяющегося при увеличении времени сушки препарата.

4. Биотехнология вакцины чумной живой сухой с уменьшенным количеством человеко-доз в ампуле обеспечивает снижение повреждаемости микробных клеток, определяемой электронной микроскопией, до 3,4+0,5% с сохранением их жизнеспособности до 33,4+1,3%, что превосходит аналогичные биологические показатели коммерческой вакцины (9,7+1,2% и 26,8+0,6% соответственно), содержащей в ампуле 2 мл клеточной суспензии с концентрацией 5−10- Ю10 м.к./мл.

5. Потеря в массе при высушивании вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в ампуле достигает 1,02+0,23, что соответствует требованиям регламента производства на вакцину чумную живую сухую (№ 1542−04), а ее термостабильность, определяемая при хранении препарата при 37 °C, в 1,5 раза лучше, чем у коммерческой вакцины (33,7 суток и 19,7 суток соответственно).

6. Иммуногенность вакцины чумной живой сухой с уменьшенным количеством человеко-доз в ампуле, определяемая по ED50 на морских свинках и белых мышах в соответствии с действующей Фармакопейной статьей на чумную вакцину, превышает, как минимум, пятикратно регламентированные пределы и соответствует 1360 м.к. для морских свинок и 7252 м.к. для белых мышей. Эта же вакцина почти в два раза по сравнению с коммерческой вакциной обеспечивает у животных увеличение напряженности иммунитета, определяемой в феномене «переживания», при одновременном подкожном введении с вирулентным штаммом чумного микроба.

7. Реактогенность вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в ампуле, выявляемая по показателям безвредности при подкожном введении морским свинкам 15 млрд живых м.к. в объеме 1 мл, и пирогенности на кроликах, которым внутривенно инъецировали 300 млн живых м.к., не превышает регламентированные Фармакопейной статьей на чумную вакцину № 42−3877−99 и X Государственной Фармакопеей показатели.

8. Установлен экономический эффект использования вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в ампуле по сравнению с коммерческой вакциной при одновременной иммунизации небольших групп людей.

9. Полученный по новой биотехнологии препарат соответствует требованиям, предъявляемым к вакцине чумной живой сухой, включен в действующую документацию (РП № 1542−04) и предназначен для планового практического применения, дополняя арсенал профилактических препаратов против чумы, используемых для массовых иммунизаций в особых условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Производство чумной вакцины представляет собой биотехнологический цикл, учитывающий и сохраняющий биологические свойства микробов вакцинного штамма ЕВ, являющихся исходным материалом для накопления биомассы. За многие годы производственного выпуска чумной вакцины хорошо отработана технология ее изготовления.

Совершенствование биотехнологии чумной вакцины развивается преимущественно в направлениях, способствующих наработкам большого количества бакмассы, внедрению эффективных методов аппаратного культивирования, оптимизации и конструированию новых питательных сред, в частности из непищевого сырья, дальнейшей стандартизации коммерческого препарата вакцины ЕВ.

Литературные данные свидетельствуют, что в настоящее время совершенствование технологии производства чумной вакцины развивается в направлении стандартизации живой чумной вакцины по единому числу человеко-доз (Ракитина Е.Л., 1988; Будыка ДА., 2002), и повышению термостабильности и стабилизации препарата в процессе длительного хранения (Будыка Д.А. с соавт., 2000; Будыка Д. А., 2002).

Но несмотря на то, что почти все этапы производственного цикла четко регламентированы, отмечается очень широкая вариабельность свойств вакцинного препарата, например, жизнеспособности коммерческих серий чумной вакцины — от 25 до 50% (Ракитина Е.Л., 1988) при оптической концентрации микробных клеток от 50 до 100 млрд/мл. Учитывая, что наиболее важным показателем, характеризующим качество препарата чумной вакцины, является число живых микробов в человеко-дозе, данному критерию уделяют особое внимание. Этот показатель используется, как один из основных, при отработке и совершенствовании различных этапов изготовления препарата.

Биотехнология вакцины чумной живой сухой должна быть призвана наиболее полно сохранить иммуногенные свойства в процессе производства коммерческого препарата, которые, прежде всего, обусловлены живыми клетками вакцинного штамма. Предпринятые исследования были посвящены созданию более оптимальных условий воздействия защитных компонентов стабилизатора на единицу взвешенных в нем микробных клеток за счет уменьшения общего количества микробных клеток в смываемой суспензии и, как следствие, в чумной вакцине (в 10 раз уменьшенной концентрацией по сравнению с регламентированной (50−100 млрд/мл) (Васильева А.А., 2004). Это достигается путем дополнительного внесения расчетного количества стабилизатора в вакцинную суспензию на этапе ее сведения, и возможностью достичь в регламентированных пределах состояния более глубокого анабиоза живых микробных клеток при лиофилизации за счет уменьшения объема вакцинной суспензии с 2 мл до 1 мл в ампуле на этапе разлива, предшествующему процессу замораживания-высушивания.

Из данных литературы известно, что уменьшение объема вакцинной суспензии в ампуле до 1 мл и снижение концентрации микробных клеток не ухудшало качественных показателей препарата, а некоторые из них (термостабильность, повреждаемость) были достоверно лучше по сравнению с контролем (коммерческая вакцина) (Бондаренко А.И., 1995; Будыка Д. А. с соавт., 2000). Бондаренко А. И. и Тинкер А. И. (1991) при помощи электронной микроскопии показали, что существует зависимость между числом поврежденных клеток в вакцине по мере увеличения общей концентрации микробов в суспензии и от ее объема (1 и 2 мл) в ампуле.

Предварительно отработали в эксперименте различные образцы вакцины со сниженным количеством микробных клеток в суспензии. Бактериальную массу для экспериментальных серий получали в процессе производства живой чумной вакцины. Экспериментальные серии (8 серий) готовили путем дополнительного разведения стабилизатором до концентрации 1,9−109 м.к./мл микробных клеток. Приготовленную вакцину разливали в ампулы по 1 мл. В качестве контрольных служили производственные серии с оптической концентрацией около 80 млрд/мл, разлитые по 2 мл. Всю вакцину лиофилизировали в аппарате LZ-45. Пайку ампул проводили под вакуумом.

Провели изучение жизнеспособности, повреждаемости микробных клеток в экспериментальных сериях чумной вакцины с объемом суспензии в ампуле 1 мл и концентрацией 1,9−109 м.к./мл в сравнении с традиционными коммерческими сериями вакцины чумной живой сухой, содержащими в ампуле 2 мл клеточной суспензии с концентрацией 7−1010 м.к./мл.

Показатель повреждаемости клеток, определяемый при электронной микроскопии, в исследуемых препаратах составил (3,4+0,5)% и был статистически достоверно ниже относительно контрольных образцов (9,7+1,2)% и ОСО (8,8±0,8)%.

Сравнительная характеристика жизнеспособности опытных (33,4+1,3)% и контрольных (26,8+0,6)% образцов чумной вакцины показала, что во все исследуемые сроки этот показатель был достоверно выше у вакцины со сниженной концентрацией микробных клеток. При этом жизнеспособность коммерческой вакцины отвечала требованиям документации лишь в течение одного года, в то время как опытные серии даже через три года хранения в большинстве своем превышали регламентированный показатель 25%, причем критерий достоверности различий жизнеспособности между опытными и контрольными сериями в этот срок исследования достиг наибольшей величины.

В дальнейшем, используя электронную микроскопию для оценки состояния микробных клеток, были изучены качественные характеристики экспериментальных серий чумной вакцины с различными показателями общей концентрации (от 50 до 100 млрд/мл) и объема суспензии в ампуле (1 и 2 мл). Одним из критериев оценки качества была повреждаемость микробов после лиофилизации.

Электронной микроскопией было показано, что существует зависимость между числом поврежденных клеток в вакцине по мере увеличения общей концентрации микробов в суспензии: 50, 75, 100 млрд/мл с одной стороны и довольно четкий параллелизм по этому показателю у суспензий с концентрацией 50 и 75 млрд/мл в зависимости от ее объема (1 и 2 мл) в ампуле.

На основании полученных данных сделано заключение о соответствии производственным стандартам (ОСО) по жизнеспособности микробных клеток и превосходству по показателю их повреждаемости в экспериментальных сериях вакцины чумной живой сухой.

Полученные результаты показали, что при одинаковых исходных условиях (культивирование, лиофилизация, хранение) вакцина с измененными тактико-техническими параметрами (концентрация микробных клеток в препарате 1−4хЮ10 м.к./мл) по основным показателям превосходит коммерческие образцы. Это послужило основанием для разработки биотехнологии и получения экспериментально-производственных серий вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в ампуле в условиях производственного цикла.

Были приготовлены 5 экспериментально-производственных серий препарата вакцины чумной живой сухой (для контроля в лаборатории препаратов против чумы и других особо опасных инфекций ГИСК им. JI.A. Тарасевича) с меньшим, по сравнению с регламентированным, количеством доз в ампуле, приготовленных в условиях производства вакцины в АКМ-Ш поверхностным методом выращивания с использованием всех регламентированных технологических этапов (действующая НД), и отличающихся тем, что на этапе сведения вакцинной суспензии концентрация микробных клеток доводится у части суспензии до параметров 1×1010- 4×1010 в 1 мл путем дополнительного внесения расчетного количества стабилизатора. Во время разлива вакцинной суспензии объем ее ограничивается 1 мл в ампуле.

Были изучены параметры жизнеспособности (39,7+1,8)%, термостабильности (8,9+0,7) сут и потери в массе при высушивании (1,02+0,23%) полученных экспериментально-производственных серий вакцины. Результаты показали соответствие по изучаемым параметрам экспериментально-производственных серий вакцины чумной живой сухой действующей НД.

Контроль иммуногенности в соответствии с действующей ФС на вакцину № 42−3877−99. Полученные данные (7254 м.к. для белых мышей и 1360 м.к. для морских свинок) означают, что ED50 экспериментальной вакцины была существенно ниже регламентированных показателей ФС (1-Ю4 ж.м.к. для морских свинок и 4−104 ж.м.к. для белых мышей), т. е. иммуногенность ее весьма высока и превышает, как минимум, пятикратно крайние пределы, регламентированные нормативной документацией.

Помимо общепринятой методики, провели сравнительное изучение на белых мышах эффективности экспериментально-производственной и коммерческой вакцин в феномене «переживания», выраженной в LD5o вирулентного штамма и характеризующей иммуногенность вакцинного препарата, использованного для введения в смеси с вирулентным.

Полученные данные отражают четко выраженную тенденцию повышения величины LD50 у животных, иммунизированных экспериментальным препаратом, т. е. напряженность иммунитета при введении данной вакцины увеличилась в два раза по сравнению с контролем (коммерческая вакцина), хотя и не обеспечила статистически достоверную разницу.

Представленные результаты (для серии l-LD5o=7943 м.к., для серии 7 (контрол^-ЬОзо^З 162 м.к.) свидетельствуют о том, что и в данной серии опытов защитные свойства разработанной вакцины чумной живой сухой оказались весьма высоки и даже превысили таковые у коммерческого препарата.

Таким образом, иммуиогениые свойства экспериментально-производственных образцов, приготовленных по технологии, модифицированной нами, соответствуют требованиям качества для препарата вакцины чумной живой сухой и проявляются высокими показателями.

Провели определение реактогенности по совокупным данным пирогенности и безвредности вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в производственной упаковке (ампуле).

При определении безвредности патологоанатомическая картина внутренних органов морских свинок была характерна для вакцинального процесса, при этом отсутствовали видимые деструктивные изменения в легких (кровоизлияния, очаги воспаления, гранулемы, абсцессы), в посевах крови и легких не зарегистрировано роста чумного микроба. В месте введения нами отмечалось развитие кровоизлияний и инфильтрата подкожной клетчатки.

Пирогенные свойства изучали по методике, описанной в X Государственной Фармакопее.

Полученные результаты свидетельствовали (суммарный подъем температуры у кроликов через 3 часы для вакцины, разлитой по 1 мл составил 3,8 градуса, для вакцины по 2 мл — 3,5 градуса, тиомочевиновая среда — 0,4 градуса, апирогенный 0,9% раствор хлорида натрия — 0,3 градуса), что чумная вакцина обоих образцов обладала выраженными пирогенными свойствами, что согласовалось с данными литературы (Тинкер А.И., Печникова И. В., 1978). В сравнении с производственными сериями, пирогенные свойства вакцины чумной живой сухой, приготовленной по новой технологии, не превышали показатели контрольного образца, а тиомочевиновая среда и разводящий раствор также не вызывали выраженной пирогенной реакции.

При сравнительном анализе результатов сушки около 100 серий чумной вакцины ЕВ в зависимости от ее параметрических особенностей густота и объем суспензии в ампуле), длительности замораживания, удаления свободной влаги, общего времени высушивания и др. можно сделать вывод, что в процессе лиофилизации происходит существенное снижение выживаемости микробов в коммерческом препарате (52,1+0,4%) до (34,5+1,2%) и в экспериментальных образцах (с 60,7% до 36,8%).

Фактическое количество микроорганизмов колебалось в гораздо более широком диапазоне (от 22,7−109 до 28,6−109 м.к./мл) и от (5,95−109 до 6,99−109 м.к./мл) соответственно, что объяснялось разницей в общей концентрации микробов в суспензии. Однако в препарате на человеко-дозу (300 млн живых м.к.) колебания в коммерческой вакцине составили около 20-ти человеко-доз, в то время как в экспериментальной вакцине они не превышали 3,5, обусловив высокую стандартность препарата от серии к серии.

Данные, представляющие жизнеспособность коммерческих и экспериментальных образцов (89 и 5 серий соответственно), лиофилизированных в регламентированном режиме, были практически идентичны, однако отмечена достоверная разница во времени удаления свободной влаги и общей длительности сушки. При этом, с пролонгированием процесса сушки для 1,0 мл вакцин до 26+0 часов (регламентированное время) существенно уменьшалась потеря в массе при высушивании таблетки, составив 1,02+0,23% вместо 2,65+0,07% у коммерческой вакцины, но жизнеспособность оставалась на прежнем уровне, не снижаясь.

Анализ лиофилизации указанных препаратов живой чумной вакцины показал, что замораживание-высушивание достаточно идентично влияло на сохранение основных свойств всех исследованных образцов непосредственно после высушивания. При этом отмечено известное укорочение времени удаления свободной влаги и общей длительности сушки в отношении экспериментальных образцов (15 часов и 20 часов) по сравнению с регламентированным процессом сушки коммерческой вакцины.

19 часов и 28 часов соответственно), однако жизнеспособность препарата при этом не изменялась. Что касается потери в массе при высушивании, то этот показатель коррелирует с выживаемостью микробов очень незначительно.

На основании полученных результатов, руководствуясь требованиями НД, можно сделать заключение об отсутствии разницы в реактогенности различных экспериментальных и коммерческих образцов вакцины чумной живой сухой.

Параллельно изучили возможность отработки технологии выпуска вакцины с меньшим количеством доз в ампуле при получении биомассы чумных микробных клеток ЕВ методом глубинного культивирования.

Результаты изучения жизнеспособности свидетельствовали, что при глубинном культивировании в электромагнитном поле с использованием иммобилизованного инокулята на магнитном носителе, показатель живых микробных клеток в вакцине достигал не менее (55,4+5,8)%, в то время как в контрольных образцах — не более (30+5)%. Что касается термостабильности, то экспериментальные образцы, полученные из иммобилизованного инокулята, обладали наибольшей устойчивостью к действию неблагоприятной температуры (37 °С) — 19,7 сутоку коммерческой вакцины, содержащей 8×1010 м.к. в объеме 2 мл из этой же биомассы термостабильность была наименьшей (16 сут). Однако все они вполне соответствовали требованиям НД, включая и иммуногенность.

Таким образом, анализ полученных данных показывает, что и в условиях глубинного культивирования при всех его описанных разновидностях при одинаковых исходных моментах биотехнологии вакцины (выращивание, высушивание, хранение) концентрация микробных клеток 1×1010 в объеме 1 мл не сказывается на качестве готового образца в условиях получения биомассы вакцинного штамма методом глубинного выращивании препарата, а по термостабильности даже превышает коммерческие.

Проведен сравнительный анализ стоимости и экономических потерь при подкожной иммунизации небольших коллективов, состоящих из 5, 10 и 20 человек, коммерческой вакциной серии 7−04 и экспериментально-производственной 1−5 серий. При применении экспериментально-производственных серий вакцины для подкожной иммунизации небольших коллективов (когда невозможно создать непрерывную цепочку прививаемых) очевидной становится экономическая и эргономическая выгоды, доказывающие преимущества использования вакцины чумной со сниженным количеством человеко-доз в ампуле для небольших коллективов. Снижение энергетических затрат в сравнении с коммерческим препаратом достигается на этапе лиофилизации, осуществляемой за 18 часов вместо 28 часов, однако, при производстве вакцины чумной живой сухой со сниженным количеством человеко-доз в ампуле увеличивается расход ампул и среды высушивания.

Вышеизложенное свидетельствует о соответствии вакцины чумной живой сухой с уменьшенным количеством человеко-доз в ампуле всем требованиям, предъявляемым к данному препарату, который может быть использован для планового практического применения, дополняя арсенал профилактических препаратов против чумы.