Молекулярно-генетический анализ факторов риска развития бокового амиотрофического склероза

Последнее десятилетие связано с появлением целого ряда новейших технологий и множеством фундаментальных открытий в области молекулярной генетики и молекулярной биологии, а также успешной реализацией Международной программы «Геном человека». Это способствовало значительному прогрессу в понимании природы многих наследственных заболеваний человека. В основном это относится к моногенным заболеваниям, имеющим простой менделевский характер наследования. В тоже время молекулярно-генетический анализ мультифакториальных болезней, или болезней с наследственной предрасположенностью, представляет собой гораздо более сложную задачу, в решении которой делаются лишь первые шаги. Это связано с большим количеством генов, вовлеченных в патогенез таких заболеваний и сложным механизмом формирования фенотипа, в основе которого лежит взаимодействие генетических факторов с факторами внешней среды (3,11).

Среди мультифакториальных заболеваний человека особое место занимают заболевания нервной системы. Актуальность изучения молекулярных основ мультифакториальных неврологических заболеваний связана с высокой частотой их встречаемости, тяжелым течением, сопровождающимся инвалидизацией и приводящим в большинстве случаев к фатальному исходу (10).

Одно из таких заболеваний — боковой амиотрофический склероз (БАС). Это нейродегенеративное заболевание, которое сопровождается избирательной гибелью мотонейронов головного и спинного мозга. Оно развивается практически на фоне полного здоровья, носит прогрессирующий характер и уже через несколько лет после начала приводит к тяжёлой инвалидизации и фатальному исходу. Распространённость БАС в мире составляет 3—7/100 тыс. человек. В большинстве случаев боковой амиотрофический склероз представляет собой спорадическое заболевание мультифакториальной этиологии. У 510% больных, однако может выявляться положительный семейный анамнез (97).

Ранее, при изучении факторов риска БАС, большое значение придавали образу жизни пациента, воздействию вирусных агентов, аутоиммунным процессам и др. Однако, наличие семейных форм БАС и клинической гетерогенности внутри одной родословной свидетельствуют о вовлеченности генетических факторов в развитие заболевания. В 1993 г. Rosen и коллектив исследователей показали, что, примерно четверть семейных случаев БАС связана с мутациями гена медь-цинк зависимой супероксиддисмутазы (SOD1) (123). При спорадической БАС мутации SOD1 встречаются у 5−7% больных. Однако для большинства случаев БАС, которые в основном представлены спорадическими формами, роль генетических факторов в развитии заболевания остается неизвестна. Предполагается наличие генетически обусловленного нейротоксического фактора, или, скорее, комбинации факторов, которые специфически воздействуют на мотонейроны.

Согласно данным литературы, существует несколько основных гипотез развития БАС. Это оксидантный стресс, эксайтотоксичность, нарушение процессов детоксикации, механизма аксонального транспорта и структуры цитоскелета мотонейронов, воздействие вирусов, иммунные нарушения и др (97).

В настоящее время одним из важнейших звеньев патогенеза заболевания считают оксидантный стресс (64). Это повреждающее действие, которое оказывают на клетки свободные радикалы вследствие увеличения их продукции, ослабления ферментативных механизмов антиоксидантной защиты либо сочетания этих факторов. В связи с этим, особый интерес представляют гены, продукты которых участвуют в сложном обмене активных форм кислорода в клетке. В первую очередь к ним относятся гены, кодирующие ферменты супероксиддисмутазы: медь-цинк зависимую супероксиддисмутазу, локализованную в цитоплазме и марганец зависимую супероксиддисмутазу, локализованную в митохондриях (68).

Детоксикация ксенобиотиков является одним из ключевых метаболических процессов в организме. Важная роль в процессах детоксикации принадлежит ферментам глутатионS- трансферазам Т1 и Ml (90).

При БАС страдает система аксонального транспорта и трофики мотонейронов, в связи с чем особый интерес представляют гены, кодирующие цитоскелетные белки, в частности белки нейрофиламентов (46).

На данном этапе изучения роли генетической составляющей в патогенезе бокового амиотрофического склероза одним из значимых методов является анализ генетических ассоциаций — исследование полиморфизма в генах кандидатах и его связи с заболеванием. Такие исследования дают возможность установить вовлеченность в патогенез заболевания конкретных генов-кандидатов и на основе этого в дальнейшем выявить группы лиц с риском развития БАС (3).

В связи с этим целью настоящей работы было: -Изучение молекулярно-генетических маркеров антиоксидантной системы, системы детоксикации и цитоскелетных белков мотонейрона при БАС и оценка возможностей использования этих маркеров в качестве критериев риска развития и прогноза течения заболевания.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Провести поиск мутаций в кодирующей области и участках экзонинтронных соединений гена медь-цинк зависимой супероксиддисмутазы у больных спорадическим БАС. Провести анализ гаплотипов по полиморфным маркерам, тесно сцепленных с геном SOD1.

2. Провести анализ А9У-полиморфизма сигнальной последовательности митохондриальной супероксиддисмутазы.

3. Исследовать делеционный полиморфизм генов системы детоксиации: глутатион-Э-трансферазы Т1 и глутатион-S-трансферазы Ml.

4. Провести анализ S/L-полиморфизма гена тяжёлой цепи нейрофиламентов.

5. Провести анализ ассоциации полиморфных вариантов изученных генов с основными клиническими характеристиками заболевания: возрастом и вариантом начала, типом прогрессирования.

Научная новизна.

Впервые в группе больных боковым амиотрофическим склерозом из России проведен комплексный молекулярно-генетический анализ ряда генов, предположительно вовлеченных в патогенез заболевания.

Показано, что развитие спорадической формы БАС в российской популяции может быть связано с миссенс мутациями в гене SOD1 — у одного больного выявлена миссенс мутация G12R в гетерозиготном состоянии и у двух больных выявлена миссенс мутация D90A в гомозиготном и гетерозиготном состоянии. с.

Впервые показано, что развитие бокового амиотрофического склероза может наблюдаться у носителя мутации D90A в гетерозиготном состоянии в составе «скандинавского гаплотипа» гена SOD1.

Изучение полиморфных вариантов генов марганец зависимой супероксиддисмутазы и глутатион-8-трансфераз типов Ml и Т1 не выявило ассоциации с развитием БАС у больных из России.

Впервые показано, что S/L полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов (NEFH) определяет риск развития бокового амиотрофического склероза в русской популяции. Относительный риск развития БАС у гомозигот по S аллелю составляет 4,2.

Обнаружено, что генотип SS гена NEFH у больных БАС также ассоциирован с более тяжелым клиническим течением заболевания, в связи с чем данный генотип может выступать в качестве прогностического фактора.

Практическая значимость Полученные данные позволяют оценить роль ряда генетических систем в развитии бокового амиотрофического склероза и являются основанием для разработки методов молекулярно-генетической идентификации лиц с повышенным риском развития данного заболевания. Результаты работы могут быть использованы в дальнейших молекулярно — генетических и клиниконеврологических исследованиях при БАС и других наследственных и мультифакториальных неврологических заболеваниях.

Положения, выносимые на защиту.

1. Мутации в гене SOD1 выявлены у 5,7% больных из России со спорадическим БАС.

2. Развитие бокового амиотрофического склероза может наблюдаться у гетерозиготного носителя мутации D90A в составе «скандинавского гаплотипа» гена SOD1.

3. Полиморфные варианты генов марганец зависимой супероксиддисмутазы (SOD2) и глутатион-8-трансфераз типов Ml и Т1 (GSTT1 и GSTM1) не ассоциированы с развитием бокового амиотрофического склероза у больных из России.

4. S/L полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов (NEFH) определяет риск развития бокового амиотрофического склероза в изученной популяции. Генотип SS гена NEFH у больных БАС ассоциирован с более тяжелым клиническим течением заболевания.

Обзор литературы.

Выводы.

1. У больных боковым амиотрофическим склерозом (БАС) проведен анализ мутаций в кодирующей области гена медь-цинк зависимой супероксиддисмутазы (SOD1). У трех больных (5,7%) выявлены две миссенс мутации: G12R (у одного больного) и D90A (у двух больныхв гомозиготном и гетерозиготном состоянии).

2. Впервые показано, что развитие бокового амиотрофического склероза может наблюдаться у гетерозиготного носителя мутации D90A в составе «скандинавского гаплотипа» гена SOD1.

3. В интроне 3 гена SOD1 описан новый однонуклеотидный полиморфный сайт — IVS3+35 А>С, не ассоциированный с развитием БАС. Аллель IVS3+35 С встречается с частотой 4,9% у больных и с частотой от 1,8% до 3,2% в случайных выборках из Курской, Архангельской областей и Якутии.

4. Изучение полиморфных вариантов генов марганец зависимой супероксиддисмутазы (SOD2) и глутатион-8-трансфераз типов Ml и Т1 (GSTT1 и GSTM1) показало отсутствие их ассоциации с развитием БАС у больных из России.

5. Впервые показано, что S/L полиморфизм гена тяжелой цепи нейрофиламентов (NEFH) определяет риск развития бокового амиотрофического склероза в русской популяции. Частота SS генотипа в группе больных составляет 33,3%, в контрольной выборке — 8% л =8,361, р=0,004). Относительный риск развития БАС у гомозигот по S аллелю составляет 4,2.

6. Обнаружено, что генотип SS гена NEFH у больных БАС также ассоциирован с более тяжелым клиническим течением заболевания. Динамика нарастания неврологического и функционального дефицита у SS гомозигот достигает 31,0±16,3 баллов/год по шкале Норриса, тогда как у LL гомозигот она составляет 18,8±12,4 баллов/год (р<0,05).

Заключение

.

В российской выборке больных боковым амиотрофическим склерозом проведен прямой поиск мутаций в гене SOD1, являющимся каузативным при БАС, проведен анализ полиморфизма в 4 генах, предположительно вовлеченных в патогенез заболевания.

У трех больных выявлены миссенс мутации гена SOD1: G12R (у одного больного) и D90A (у двух больных — в гомозиготном и гетерозиготном состоянии). Обе мутации D90A находятся в составе «скандинавского гаплотипа» гена, что подтверждает теорию общего основателя этой мутации из северной Швеции или Финляндии. Согласно теории, заболевание развивается только при наличии мутации D90A в гомозиготном состоянии. Таким образом, развитие БАС у больной, гетерозиготной по D90A может косвенным образом свидетельствовать о наличии дополнительного модифицирующего генетического или эпигенетического фактора, который сыграл ключевую роль в патогегезе заболевания у этой больной.

A9V полиморфизм сигнальной последовательности марганец-зависимой супероксиддисмутазы, как предполагают, влияет на эффективность переноса фермента из цитоплазмы в митохондриальный матрикс, определяя его компартментализацию. Вероятно, это может приводить к дефициту фермента в митохондрии и повышенной оксидантной нагрузке органеллы со множеством негативных последствий для клетки. Анализ данного полиморфизма в русской выборке больных не показал ассоциации с развитием заболевания.

Нарушение процессов детоксикации клетки рассматривается в качестве одного из возможных механизмов патогенеза БАС. Гены GSTT1 и GSTM1, относящиеся к системе детоксикации организма, наиболее интересны для исследования, так как оба характеризуются делеционным полиморфизмом — при наличии нулевого аллеля не происходит образования белкового продукта. Результаты анализа полиморфизма генов GSTT1 и GSTM1 у больных из России не показали ассоциации с развитием заболевания. Однако большая встречаемость комбинации генотипов GSTTl (0/0)/GSTMl (0/0) в группе пациентов может рассматриваться как фактор, усугубляющий действие других патогенетических факторов при БАС.

Аномальное скопление и агрегация нейрофиламентов в перикариуме и аксонах мотонейронов является характерной чертой патологии при БАСотмечены также нарушения аксонального транспорта и структуры цитоскелета мотонейронов. Нейрофиламенты представляют собой сополимер, состоящий из легкой, средней и тяжелой цепей. В гене тяжелых цепей нейрофиламентов описан S/L полиморфизм, который был проанализирован у больных БАС из России. S аллель соответствует 44 лизин-серин-пролиновым (KSP) повторам в С-концевом домене белка, L аллель — 45 повторам. При этом установлено, что SS генотип гена определяет риск развития бокового амиотрофического склероза в русской популяции. В дальнейшем, анализ этого полиморфизма может быть использован в качестве одного из маркеров для выявления лиц с повышенным риском развития БАС. Кроме того, было обнаружено, что у больных БАС с SS генотипом гена NEFH достоверно чаще наблюдается более тяжелое клиническое течение заболевания. Таким образом, SS генотип гена NEFH у больных БАС может выступать в качестве прогностического критерия характера течения заболевания.

Известно, что KSP повторы Сконцевого домена играют важную роль в процессах фосфорилирования/дефосфорилирования различных цепей нейрофиламентов и тем самым влияют на их взаимодействие между собой и с другими белками цитоскелета. Благодаря этому нейрофиламенты осуществляют свою структурную функцию и функцию аксонального транспорта. «Укороченный» Сконцевой домен может обладать сниженным аффинитетом к белкам цитоскелета и тем самым приводить к нарушению цитоархитектоники аксона и нейрона в целом.

Таким образом, полученные данные указывают на важную роль генетических факторов в развитии не только семейной, но и спорадической формы БАС, и обосновывают необходимость расширения и углубления генетических исследований при этом тяжелейшем неврологическом заболевании. Постоянно растущий массив данных о возможных генах-кандидатах БАС и характере мутаций в них расширяет наши представления о механизмах этиопатогенеза заболевания. Спектры мутаций и аллельных вариантов генов-кандидатов сильно различаются у разных этнических групп. В связи с этим, в каждом случае необходимо не только точно установить характер генных изменений, но и оценить их встречаемость в популяции. Лишь на базе этих знаний возможна разработка методов молекулярно-генетической идентификации лиц с повышенным риском развития этого заболевания, в частности, для российской популяции. Результаты данной работы являются хорошим для этого основанием.