Актуальность проблемы.
Выделение и культивирование клеток мезенхимального происхождения из постнатальных органов и тканей1 человека является основой для получения клеточных материалов (КМ), используемых в регенеративной медицине для терапии патологий различного генеза:1 заболеваний опорно-двигательного аппарата [Bruder-94, Kassem-04], неврологических заболеваний [Скворцова-08,09, Dezawa-05], повреждений сердца [Miyahara-06, Tang-06, Zhang-07], сердечно-сосудистых заболеваний [Miranville-04, Nakagami-05], заболеваний печени [Урываева-09, Chien С.С.-06], заболеваний кожи. Кроме того, иммуномодулирующие свойства клеток мезенхимального происхождения могут быть использованы, например, при аутоиммунных заболеваниях [Aggarwal-05, Di Nicola-02] и для иммунокоррекции в трансплантологии [Beyth-05, Quirici-02].
В настоящее время, в Российской Федерации проводятся разработки по созданию нормативно-правовой базы для регулирования медицинского применения КМ, а также единых стандартов их производства. Создание соответствующих законов нуждается в экспериментальном и теоретическом анализе проблем стандартизации при производстве КМ и в обобщении опыта, накопленного отечественными специалистами в области клеточных технологий (КТ).
Принятию нормативных актов, регламентирующих медицинское применение КТ, должно предшествовать появление унифицированного понятийного аппарата, лабораторных регламентов получения первичных клеточных культур и обеспечения их биологической безопасности и единых подходов к документированию продуктов и технологических схем. Таким образом, исследования в области стандартизации производства и контроля качества КМ обладают несомненной научно-практической актуальностью.
Цель работы.
Разработка принципов стандартизации КМ из первичных клеточных культур мезенхимального происхождения на основе теоретического и экспериментального исследования всех этапов технологической цепочки их получения и контроля качества.
Задачи исследования:
1. Изучить закономерности изменения морфологии первичных клеточных культур мезенхимального происхождения в зависимости от типа биоптата и длительности пассирования in vitro как основы визуального контроля качества клеточной культуры.
2. Разработать принципы верификации мезенхимальной природы первичных клеточных культур, полученных из кожи, костного мозга, плаценты и пуповины человека по цитофенотипу, адгезивности к пластику и способности дифференцироваться по трём мезенхимальным направлениям (в кость, хрящ и жир).
3. Разработать метод оценки качества первичных клеточных культур по уровню метаболической активности с помощью МТТ-теста.
4. Проанализировать стабильность кариотипа клеток первичных культур мезенхимального происхождения в процессе пассирования.
5. Разработать лабораторный стандарт для различных этапов технологической схемы подготовки клеточных материалов на основе клеточных культур мезенхимального происхождения: получения, культивирования, криоконсервации, паспортизации и транспортировки.
Научная новизна работы.
Впервые были изучены особенности выделения мезенхимальных клеток из кожи, костного мозга, плаценты и пуповины человека с учетом" их использования для производства КМ. Были сопоставлены данные,' полученные при выделении клеток из различных участков биопсийного материала, а также изучены причины гетерогенности, связанные с его особенностями. Предложены новые подходы к визуальной оценке КМ.
Предложена модификация методики кариотипирования клеток в составе монослойных культур с низкой митотической активностью без их перевода в суспензию, что позволяет осуществлять рутинное кариотипирование культур клеток мезенхимального происхождения в процессе производстваКМ. Показано, что в рамках использованных технологических схем кариотип клеток остаётся неизменным на протяжении, по крайней мере, первых десяти пассажей в первичных культурах клеток мезенхимального происхождения из кожи, костного мозга, плаценты и пуповины человека.
Впервые установлено, что оптический сигнал в МТТ-методе прямо пропорционален количеству жизнеспособных клеток мезенхимального происхождения, что позволяет использовать этот метод для экспресс-анализа жизнеспособности клеточных культур. Показано, что уровень дегидрогеназной активности в первичной культуре клеток мезенхимального происхождения возрастает на протяжении первых У-УИ пассажей, после чего постепенно снижается.
Впервые изучена динамика жизнеспособности первичных клеточных культур в различных транспортировочных средах и условиях транспортировки. Получены данные выживания клеток первичных культур мезенхимального происхождения различных пассажей после долговременной криоконсервации в жидком азоте (- 196 °С). Предложены образцы паспортов.
КМ, документирующих результаты контроля их состава, качества и безопасности.
Практическая значимость работы.
Разработан и внедрён лабораторный стандарт производства КМ на основе первичных культур клеток мезенхимального происхождения из кожи, костного мозга, плаценты и пуповины человека, интегрирующий в единую технологическую схему все этапы получения и контроля качества клеточных культур: взятие биопсийного материала и выделение из него клеточной культурыпассирование клеток in vitroконтроль жизнеспособности клеточных культурконтроль качества клеточных культур (включая уровень дегидрогеназной активности и стабильность кариотипа на различных пассажах) — скрининг на наличие инфекционных агентовдолговременная криоконсервация клетокнаращивание необходимого количества клеток.
Внедрение в практику.
Разработанный лабораторный стандарт производства и контроля качества КМ успешно внедрён в лаборатории клеточных технологий и тканевой инженерии НИИ общей патологии и патофизиологии (ОПП) РАМН, в процессе выполнения исследований по ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2012 годы», ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009;2013 годы», совместному научному проекту кафедры неврологии с курсом нейрохирургии медико-биологического ф-та Российского государственного медицинского университета, кафедры биологии педиатрического ф-та Российского государственного медицинского университета и лаборатории клеточных технологий и тканевой инженерии НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН «Исследование эффектов трансплантации мезенхимальных клеток на окклюзионной модели ишемического инсульта у крыс».
С использованием разработанного лабораторного стандарта проведено изучение первичных культур мезенхимальных клеток из плаценты человека и подготовлена документация, на основании которого Федеральная" служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития выдала Разрешение ФС № 2010/383 от 26.10.2010 на применение новой-медицинской технологии «Получение, культивирование, хранение и транспортировка мезенхимальных клеток плаценты человека». Материалы диссертационной работы использовались в учебном процессе кафедры биологии РГМУ и ФГОУ «Всероссийский учебно-научно-методический Центр по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Апробация диссертационной работы.
Результаты исследования докладывались и обсуждались специалистами в ходе проведения Всероссийской научно-практической конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, Россия- 17−18 ноября 2005 г.) — V Международного Конгресса KiKosmetikExpo (Москва, Россия- 8−11 февраля 2006 г.) — Конференции РГМУ (Москва, Россия- 24—25 мая 2006 г.) — Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, Россия- 17−19 октября 2006 г.) — Британско-Российского совещания в сотрудничестве с Европейской' Комиссией «Стволовые клетки: законодательство, исследования и инновации. Международные перспективы сотрудничества» (Москва, Россия- 16—17 марта 2007 г.) — Конференции РГМУ «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, Россия- 30—31 мая 2007 г.) — 9-го международного семинара по магнитному резонансу (Ростов-на-Дону, Россия- 15—20 сентября 2008 г.) — 6-th World Stroke Congress (Vienna, Austria;
24−27 September 2008) — IV Всероссийского съезда трансплантологов (Москва, Россия- 9−10 ноября^ 2008 г.) — итоговой конференции по результатам I выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления.
Живые системы" ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007— ^ 2012 годы» (Москва, Россия- 8−10 декабря 2008 г.) — Second annual Stem Cells & Regenerative Medicine Europe Conference (Edinburgh, England- 23— 25 September 2009) — XVI съезда педиатров России (Москва, Россия- 1619 февраля 2009 г.) — Российской научно-практической конференции «Нарушения мозгового кровообращения: диагностика, профилактика, лечение» (Пятигорск, Россия- 20−21 мая 2010 г.) — Материалы IV Всероссийского Симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Санкт-Петербург, Россия- 21—22 апреля 2010 г.).
Научные публикации по теме диссертации.
Результаты диссертационной работы отражены в 37 научных публикациях: в 15 статьях (в том числе, опубликованных в рецензируемых научных изданиях из списка ВАК — 12) — в 22 тезисах научных конференций (15 — российских- 5 — международных, проводимых в России- 2 -международных, проводимых за рубежом).
Структура диссертационной работы.
Рукопись включает 213 с. машинописного текста, 91 рисунок, 20 таблиц и состоит из трёх основных частей: «Обзор литературы по теме диссертационной работы» (63 с., 18 рисунков, 1 таблица), «Материалы и методы исследований» (12 е., 5 рисунков), «Результаты и обсуждение» (104 е., 68 рисунков, 19 таблиц). Список использованной научной литературы включает 297 наименований.
Часть I. Обзор литературы по теме диссертационной работы. t.
Результаты исследования жизнесохраняющего потенциала для КМ в ФР с глюкозой и набором аминокислот представлены, в табл. 12—13 и рис. 84−85, соответственно. Из схемы эксперимента была исключена порция С, транспортируемая курьером.
ФР с глюкозой имеет незначительное преимущество по сравнению с ФР, а ФР с глюкозой и набором аминокислот уступает ФР по жизнесохраняющему потенциалу.
Тип КМ Жизнеспособность КМ, %.
Время, ч Порция, А (+ 4 °С) Порция В (+ 22 °С) Порция С (курьер).
1 2 3 4 5 М ± о 1 2 3 4 5 М±О 1 2 3 4 5 М±о.
ФБТ кожи человека 0 99.1 98.9 99.0 99.2 97.4 98.7±0.7 98 4 97 9 99.5 98.2 99.6 98.7±0.8 98.2 99.2 98.8 99.1 98.8 98.8±0.4.
2 88.8 96.1 89.2 89.6 91.4 91.0±3.0 78 6 88 1 86 5 81.4 78.9 82.7±4.4 81.9 84.3 76.2 80.5 81.9 81.0±3.0.
4 80.9 89.0 84.2 87.1 85.3 85.3±3.1 60 7 67 2 61 4 62.6 60.9 62.6±2.7 62.6 58.1 63.0 58.9 57.2 60. О±-2.7.
6 84.7 76.3 85.6 80.5 83.5 82.1±3.8 57 1 53 8 48 2 53 4 50.3 52.6±3.4 52.7 45.9 58.8 52 1 52.2 52.3±4.6.
8 70.9 61.2 68.6 62 3 62.0 65.0±4.4 44 5 36 3 45.7 47 2 45.8 43.9±4.4 41.2 40.1 44.2 48.3 44 6 43.7±3.2.
10 55.7 53.2 57.1 47.8 50.1 52.8±3.9 37 2 35.9 35 3 32 4 33 8 34.9±1.9 38.3 30.8 35.6 32.5 37.8 35.0±3.3.
12 52.3 41.7 46.6 49.1 44.9 46.9±4.0 180 15.7 13 2 12 1 183 15.5±2.8 17.2 11.3 15.3 168 12.4 14.6±2.6.
24 1.0 0.5 0.8 0.2 1.1 0.7±0.4 0 1 0 1 0 1 02 0.1 0.1 ±0.04 0.1 0.3 0.1 0.2 0.1 0.2±0.1.
МСК из пуповины человека 0 99.1 98.4 99.6 98.1 99.3 98.9±0.6 99 1 99 6 98 5 98 1 98 4 98.7±0.6 99.3 98.8 99.5 98.2 98.1 98.8±0.6.
2 91.2 92.6 97.0 98.5 92.4 94.9±2.7 90 7 85 6 91.2 90.9 89 1 89.5±2.3 87.2 92.1 94.4 93.2 88.4 91.1±3.1.
4 84.9 90.1 85.5 88.1 89 4 87.6±2.3 74 2 65 9 63 6 77.1 62 4 68.6±6.6 70 8 63.7 61.3 62.0 70.9 65.7±4.7.
6 78.7 85 9 85.1 85.6 79.9 83.0±3.5 68 2 57 4 59 1 57 8 58 3 60.2±4.5 59.2 61.2 59.8 63.5 62.9 61.3±1.9.
8 67.2 68.0 68.7 76.6 70.4 70.2±3.8 39 8 48 6 36 9 48 6 47.2 44.2±5.5 47.1 49.0 38.2 45.3 46.9 45.3±4.2.
10 55.0 59.2 48 9 57.2 50.3 54.1±4.4 41.2 29.9 42 9 31 6 33 7 35.9±5.8 31.7 22.6 32.3 30.4 32.6 29.9±4.2.
12 52.2 42.3 53.1 44.6 47.2 47.9±4.7 25 3 13.3 13.9 21 2 23 8 19.5±5.6 20.6 21.3 15.9 13.9 15.4 17.4±3.3.
24 0.9 1.3 10 1.2 0.6 1.0±0.3 0.2 0.1 02 02 0.4 0.2±0.1 0.2 0.2 0.4 02 0.4 03+0.1.
МСК из костного мозга человека 0 97.2 97.8 95.8 97.0 96.7 96.9±0.7 96 4 97.2 97 5 96.1 96 3 96.7±0.6 96.9 95.9 97.8 96.8 96.1 96.7±0.8.
2 89.6 92.5 94.7 90.0 89.3 91.2±2.3 76 2 83 8 86 1 77 8 76 6 80.1±4.5 79 3 86 6 77 1 85 7 84.9 82.7±4.2.
4 80.1 95.0 87.3 82.8 93.5 87.7±6.5 53 2 63 0 63 8 67 5 68.2 63.1±6.0 52.7 65.8 60.1 67.1 53 6 59.9±6.7.
6 89.7 79.8 78 2 84.2 90.2 84.4±5.5 42 7 50.4 43 1 56 8 55.9 49.8±-б.7 53.2 55.6 39.7 37.3 46.1 46.4±8.0.
8 65 2 76.4 78.5 71.2 69.3 72.1±5.4 27.8 28.3 39 1 39 4 47.1 36.3±8.2 44.7 31.4 34.3 39.8 45.6 39.2±6.3.
10 59.2 50.6 66.1 60.3 68.2 60.9±6.9 29.1 37.2 19.6 34 2 28 8 29.8±6.7 27.5 21.8 33.9 20.3 34.3 27.6±6.5.
12 43.6 40.7 48.6 52.1 55.9 48.2±6.2 21.3 10.3 16.5 112 20 6 16.0±5.1 17.2 14.3 13.2 16.8 15.9 15.5±1.7.
24 1.6 1.2 1.7 0.9 1.1 1Л±-03 0.1 0.4 0.2 0 1 0 1 0.2±0.1 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3 0.2±0.1.
Время, ч.
Время, н.
Порция, А (+4 °С) порция В (+ 22 'С) Порция С (курьер).
10 12 Время, ч.
Заключение
.
Клеточный материал (мезенхимальные клетки из костного мозга человека) может быть использован в медицинских целях. Срок годности препарата: 24 ч с момента выдачи при температуре хранения от + 2 °C до + 8 °C.
Дата и время выдачи препарата:
Ответственный исполнитель Расшифровка подписи.
Исполнитель Расшифровка подписи.
Дата Печать учреждения.
Формы паспортов клеточных материалов мезенхимального происхождения — ФБТ кожи, МСК из костного мозга, плаценты и пуповины — представлены на рис. 78−81.
Паспорта КМ содержат все четыре перечисленных выше информационных блока, заключение о возможности медицинского применения: Паспорт скрепляется подписью ответственного исполнителя и печатью организации.
На протяжении нескольких последних лет заинтересованные специалисты ставят проблему регламентации производственных стандартов в сфере медицинских клеточных технологий. Проведенная работа по стандартизации технологии производства КМ является предпосылкой для разработки нормативной базы, регламентирующей безопасное использование культур клеток в доклинических и клинических испытаниях.
Глава Ш. З. Оптимизация методов хранения и транспортировки клеточных материалов мезенхимального происхождения.
§ 111.3.1. Криоконсервация клеточных материалов.
Жизнеспособность различных пассажей культур мезенхимальных стволовых клеток после криоконсервации изучали в стандартной криоконсервационной среде: БВ8 («ОПэсо», США) с 10% ДМСО («ПанЭко», РФ) [Белоус-87, Дузу-80].
ФБТ кожи, МСК из пуповины и костного мозга человека получали по стандартной методике и пассировали в 75 см" пластиковых флаконах («Сгетег», США) (см. § II. 1.1). После выделения (0 пассаж) и после каждого пассажа (с 1-го по У1-ой) по 1 млн. жизнеспособных клеток в 1 мл криоконсервационной среды помещали в 1.8 мл криопробирки («Сгетег», США), замораживали в программном замораживателе МгБгс^ег.
Сгетег", США) и хранили в сосудах Дьюара с жидким азотом (- 196 °С) в течение 60 сут. Затем образцы размораживали на водяной бане (37 °С) и рассевали в 75 см" пластиковых флаконах («Сгетег», США). Через 12 ч клетки снимали с пластика смесью трипсина и версена (см. § 11.1.1) и проводили пятикратный подсчёт жизнеспособности клеток в камере Горяева с трипановым синим.
Выбор срока хранения образцов клеточных культур в условиях криоконсервации, 60 сут., связан с тем, что стандартная процедура мезотерапии повторяется с интервалом в 2 мес., т. е. именно через этот срок приходится размораживать клетки для приготовления КМ в практической деятельности. Поэтому проверка жизнеспособности клеток через 60 сут. криоконсервации имела не только теоретическое, но и очевидное практическое значение.
Непосредственно после выделения (0 пассаж) клетки обычно не закладывают на долговременное хранение, во-первых, вследствие их немногочисленности, во-вторых, — в силу недостаточной гомогенности клеточной культуры. Поздние пассажи, старше IV, также стараются не консервировать. Однако в данном разделе^ работы была поставлена цель установить основной тренд зависимости жизнеспособности от номера пассажа, поэтому и нулевой пассаж, и У-У1 пассажи были включены в эксперимент по криоконсервации.
Результаты представлены в табл. 7−8 и на рис. 82.
Зависимость жизнеспособности после размораживания от номера пассажа для всех исследованных клеточных культур имеет постепенно (с учётом статистических погрешностей — монотонно) убывающий характер. Для ФБТ кожи человека на первых шести пассажах снижение жизнеспособности наименьшее: примерно с 95% до 89%. Различия между пассажами достоверны для 0−1 и II—VI пассажейкроме того, достоверно отличаются от остальных наиболее поздние (V—VI) пассажи (табл. 8).
