Повышение эффективности лазерной флуоресцентной диагностики объектов микробной природы
Установлено, что учет спектров оптической экстинкции диагностируемого объекта в спектральном диапазоне флуоресцентного отклика приводит к повышению специфичности дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики. Процедура ЛФД-АГК позволила выявить наличие статистически устойчивых закономерностей в структуре флуоресцентных спектров проб, отличающих субстраты пациентов с видами легочных… Читать ещё >
Содержание
- Актуальность
- Цель и задачи работы
- Защищаемые положения
- Глава 1. Введение во флуоресцентную диагностику
- 1. 1. Природа флуоресценции
- 1. 2. Методы регистрации флуоресценции и принципы соответствующей целевой аппаратуры
- 1. 3. Методы диагностики на основе регистрации флуоресценции природных флуорофоров для биологи и медицины
- 1. 4. Методы диагностики на основе экзогенной флуоресценции
- 1. 5. Методы обработки результатов ЛФД
- 1. 6. Диагностика объектов микробной природы, состояние проблемы и возможные пути ее решения на основе ЛФД
- Глава 2. Экспериментально-теоретическое исследование. Материалы и методы
- 2. 1. Проблемная база для выполнения работы
- 2. 2. Аппаратура спектральной лазерной флуоресцентной диагностики
- 2. 3. Особенности флуоресценции биологических субстратов с микроорганизмами
- 2. 4. Модель распознавания спектральных флуоресцентных данных и метод ее математического решения
- 2. 5. Практическое и теоретическое планирование эксперимента по накоплению базы данных эталонных образцов для решения задачи распознавания
- 2. 6. Восстановление корректных спектров с учетом характеристик оптической экстинкции вещества
- Глава 3. Наработка базы данных и исследование спектральных характеристик различных микобактерий для дифференциальной флуоресцентной диагностики
- 3. 1. Измерения и обработка спектров флуоресценции
- 3. 2. Индивидуальные особенности микробов
- 3. 3. Разработка модели с учетом корректировки спектральных данных с помощью спектров экстинкции исследуемых веществ
- Глава 4. Применение детергента для повышения чувствительности дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики микроорганизмов
- 4. 1. Механизм увеличения интенсивности флуоресценции под действием детергента
- 4. 2. Измерение флуоресценции микроорганизмов под влиянием различных детергентов и определение динамики
- 4. 3. Анализ специфичности флуоресценции микобактерий при их обработке с использованием мирамистина
- Глава 5. Диагностика заболеваний туберкулеза по измерению флуоресценции плазмы крови
- 5. 1. Схема распознавания и классификации болезни
- 5. 2. Сбор и организация данных лазерно-флуоресцентной диагностики
- 5. 3. Экспериментальная установка и процедура тестирования
- 5. 4. Результаты исследования
- Выводы работы 99 Научная новизна и практическая значимость
- Список литературы
Актуальность
Возникновение флуоресцентного анализа и диагностики с применением лазеров привело к созданию эффективных методов дистанционного и бесконтактного исследования различных субстратов органического происхождения с достижением большой чувствительности метода. Качество диагностики в этом случае во многом обусловлено временной и пространственной когерентностью возбуждающего излучения. Лазерно-индуцированная флуоресценция (ЛИФ) успешно применяется при определении участков загрязнения нефтепродуктами, в том числе аварийного состояния нефтепроводов (технология LDI). В таможенных службах используются приборы ЛИФ для определения наличия наркотиков (NarTest (c)). В медицине ЛИФ применяется в качестве диагностического средства при фото динамической терапии онкологических заболеваний. Основная задача, решение которой позволит увеличить возможности этих и подобных методов, заключается в разделении компонентных вкладов во флуоресцентный сигнал от многокомпонентной смеси сложных многоатомных молекул.
В связи с прогрессом в лазерных методах лечения заболеваний, связанных с микробной флорой, что привело к существенному сокращению сроков лечения, возникла острая необходимость в экспрессных методах диагностики заболеваний. Это необходимо по двум причинам. Первая — лекарственная терапия сильнодействующими препаратами в избыточных дозах приводит к ухудшению состояния жизненноважных органов. Поэтому необходимо, вовремя определить момент прекращения лекарственной терапии. Вторая — в процессе лечения очень важно отслеживать динамику лечения для его коррекции. Существующие методы диагностики, основанные на микробиологическом анализе, требуют длительного времени для установления диагноза (например, диагностика туберкулеза занимает от 3-х до 6-ти недель.)
Развитие новых методов диагностики на основе исследования характеристик конверсии (рассеяние, флуоресценция, рамановский и нелинейный эффекты и т. п.) лазерного излучения в биологическом веществе имеет проблемный и приоритетный характер в целях диагностики для медицины, и кроме нее также для биологии, промышленности и т. д., поскольку эти методы являются прямой базой новой экспресс — диагностики, которая лишена ряда недостатков остальных способов и имеет неоспоримые преимущества. Из них лазерная флуоресцентная диагностика может сочетать в себе приемлемые для задач диагностики чувствительность и специфичность. Однако сейчас наиболее часто флуоресцентный метод применяется с использованием специфических флуоресцирующих веществ, которые связываются с иммунными телами, специфическими к своему типу микроорганизмов [1,2]. Это связано с тем, что сама по себе эндогенная флуоресценция трудно поддается специфическому анализу. Но все-таки были разработаны методы диагностики для некоторых чистых культур [3].
Несмотря на это методы определения видов микроорганизмов в смесях не разработаны. Такие методы были бы полезны не только в медицинской диагностике, но и, например, в фармакологии для определения чувствительности возбудителя к антимикробным препаратам. Так же это было бы востребовано в пищевой технологии, экологии, промышленности, в космических и биосферных исследованиях.
Разработка экспресс-методов индикации и идентификации микроорганизмов является приоритетным направлением в медицинской диагностике. По оценкам ВОЗ, болезни микробной природы продолжают оставаться серьезной проблемой здравоохранения многих стран. Острые диарейные заболевания являются причиной более чем 30% смертных случаев среди детей до 5 лет. Острые респираторные заболевания (первичная пневмония) являются причиной смерти 2.2 млн. человек в год [4]. Существующие методы недостаточно быстро позволяют проводить диагноз. Бактериологическое исследование клинического материала от больного, одной из целей которого является выделение и идентификация бактерий, существенно зависит от качества работы на лабораторном и долабораторном этапах. Также здесь необходимо наличие аэробной и анаэробной микробиологической техники исследования материала, которая остается не всегда доступной лабораториям практического здравоохранения. Эти методы трудоемки и требуют слишком много времени. [5]
Выше сказанное обосновывает необходимость разработки новых экспресс-методов диагностики и мониторинга заболеваний микробной природы. Целесообразным для решения указанной проблемы является, например использование метода ЛФД. ЛФД обладает рядом потенциальных преимуществ, благодаря которым возможно эффективное решение данной проблемы. Особенно важны здесь преимущества в скорости диагностики и потенциальной неинвазивности.
Однако при применении ЛФД есть несколько проблем, среди которых особенно важна проблема скрытой специфичности. Спектры флуоресценции биологических объектов, в частности микробосодержащих жидкостей, не имеют характерных деталей, посредством которых можно было бы идентифицировать их. Специфические особенности не проявляются в виде узких спектральных линий, а наоборот, рассредоточены по широким перекрывающимся пикам. Поэтому для их анализа требуются методы, позволяющие находить и учитывать эти особенности в широких спектрах. При этом кроме высокой специфичности необходимо добиться одновременно и большой чувствительности, поскольку порог обнаружения и определения концентраций микроорганизмов может оказаться слишком высоким, чтобы не определить содержание микроорганизмов в слабоконцентрированных суспензиях.
Все приведенные доводы указывают на необходимость поиска новых методов определения и идентификации микроорганизмов на основе экспресс-метода ЛФД. Также это относится к достижению необходимых качеств диагностики, таких как чувствительность, дешевизна и экспрессность.
Специфичность флуоресценции микробосодержащих взвесей слабо выражена и была недостаточно исследована к моменту начала работы, и это отражается в неспособности ЛФД без необходимого аналитического инструментария анализировать и диагностировать смеси различных микроорганизмов. Поэтому целью данного исследования является разработка метода и аппаратуры для объективной оценки специфичности флуоресценции нативных биологических субстратов (микробов) и их смесей в микробосодержащих жидкостях. В рамках достижения поставленной цели решаются задачи набора спектров флуоресценции нескольких видов микробов в зависимости от концентраций, составления метода, алгоритма и программного обеспечения дифференциальной диагностики микробов в составных взвесях и поиска способов улучшения диагностических качеств снимаемых данных при помощи использования детергента для увеличения относительной интенсивности флуоресценции и учета влияния некоторых оптических характеристик среды на спектры флуоресценции.
Цель и задачи диссертационной работы
Цель: Исследование и разработка метода дифференциальной диагностики объектов микробной природы на основе спектральных измерений лазерно-индуцированной флуоресценции. Задачи:
1. Экспериментально-теоретическое обоснование и метод обработки диагностических данных с целью дифференциации и видовой идентификации микробосодержащих биологических субстратов.
2. Экспериментальное и исследование флуоресценции биологических субстратов, взятых непосредственно от пациентов.
3. Исследование флуоресценции различных микробов и их дифференциация методами многомерного статистического анализа.
4. Повышение эффективности видовой идентификации микробов на основе учета характеристик рассеивания и поглощения биологического субстрата, содержащего флоурофоры микробов.
5. Осуществление программной реализации дифференциальной диагностики микробосодержащих биологических субстратов.
6. Тестовые испытания разработанной системы дифференциальной диагностики, возможности и перспективы.
Защищаемые положения
1. Применение методов многомерного статистического регрессионного анализа данных лазерной флуоресцентной диагностики биологических веществ позволяет эффективно проводить дифференциальную диагностику ассоциаций микроорганизмов.
2. При восстановлении спектров лазерноиндуцированной флуоресценции с учетом оптических характеристик вещества точность и эффективность дифференциальной диагностики повышается.
3. Добавление в суспензии микроорганизмов препарата на основе детергента увеличивает интенсивность флуоресценции и повышает чувствительность лазерной флуоресцентной диагностики.
Глава 1. Введение во флуоресцентную диагностику 1.1 Природа флуоресценции
Люминесценция — испускание фотонов из электронно-возбужденных состояний — делится на два типа в зависимости от скорости процесса и природы основного и возбужденного состояний. В сингл етном возбужденном состоянии электрон на энергетически более высокой орбитали и второй электрон на орбитали с более низкой энергией имеют противоположную ориентацию спинов. Говорят, что спины этих электронов спарены. В триплетном состоянии эти электроны не спарены по спинам, т. е. их спины имеют одинаковую ориентацию. При возвращении электрона из возбужденного синглетного состояния в основное ориентация его спина не должна меняться. Изменение ориентации спина необходимо при переходе из триплетного состояния в синглетное основное состояние. Флуоресценция -это испускание, происходящее за короткое время, обычно при возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомеханически «разрешены», а типичные величины скоростей испускания для них ~108 с"1. Высокие значения скоростей испускания приводят к временам затухания флуоресценции-10"8 с (10 не). Фосфоресценция — это испускание, происходящее за более длительное время, обыкновенно при переходе между состояниями различной мультиплетности. Типичный диапазон времени затухания фосфоресценции — от миллисекунд до секунд, что главным образом зависит от вклада других процессов дезактивации. [6]
Длина волны, нм
Волновое число, см-'
РИС. 1.1. Спектры поглощения и испускания флуоресценции перилена и хинина.
В органических веществах, проявляющих значительную флуоресценцию, электроны в основном делокализованы и формально расположены на сопряженных двойных связях. Структуры типичных органических флуорофоров содержат одноядерные или многоядерные ароматические кольца. В отличие от молекул органических ароматических соединений ионы элементов в основном не флуоресцируют в конденсированной фазе [6].
Два типичных спектра испускания флуоресценции приведены на рис. 1.1. Спектры испускания сильно изменяются и зависят как от химической структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором флуорофор растворен. Спектры некоторых соединений, таких как перилен, имеют четкую структуру, обусловленную отдельными колебательными уровнями энергии основного и возбужденного состояний [28].
Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уровней энергии, предложенная Яблонским [6], Основное, первое и второе электронные состояния обозначают 80, 8ь и соответственно (рис. 1.2), Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебательных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Переходы между различными электронными уровнями обозначены вертикальными линиями. Такое представление используется, чтобы наглядно показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происходит примерно за 10"1э с, время, слишком короткое для заметного смещения ядер (принцип Франка -Кондона).
Энергетическая щель между различными колебательными уровнями энергии видна из спектра испускания перилена (см. рис. 1.1). Относительное число молекул перилена, находящихся в колебательных состояниях 0 и 1, описывается распределением Больцмана:
Отношение Я числа молекул в двух состояниях с разностью энергий АЕ дается выражением
Я = е’АЕ/кТ (1.1) где к — константа Больцмана- Т — абсолютная температура, К. При комнатной температуре 300 К отношение Я равно-0,01. Следовательно, большинство молекул будет находиться в самом нижнем колебательном состоянии- именно такие молекулы и поглощают свет.
Рис. 1.2. Диаграмма Яблонского.
Из-за большой разности энергий между уровнями Бо и Б) по существу, ни у каких флуорофоров состояние Б] не может быть заселено термическим путем. Отметим, однако, что даже малое термически активированное заселение первого возбужденного колебательного состояния молекул можно зарегистрировать, используя различие спектров поглощения при разных температурах [28].
За поглощениемета обычноедует несколько других процессов. Возбуждение флуорофора, как правило, происходит до некоторого высшего колебательного уровнястояний ($ 1 либо 82). За некоторыми редкими исключениями, для молекул в конденсированной фазе характерна быстрая релаксация намый нижний колебательный уровеньстояния Б]. Этот процесс называется внутренней конверсией и происходит большей частью за 10"12 Поскольку типичные времена затухания флуоресценции близки к 10″ внутренняя конверсия обычно полностью заканчивается до процесса испускания. Следовательно, испускание флуоресценции чаще всего осуществляется из термически равновесного возбужденногостояния. Аналогично поглощению обратный переход электронов намый нижний электронный уровень также приводит к колебательно возбужденномустоянию (рис. 1.2). Термическое равновесие достигается за время порядка 10 «В большинствеучаев электронное возбуждение нельно изменяет расположение колебательных уровней энергии. В результате этого колебательныеруктуры, проявляющиеся вектрах поглощения и испускания, сходны [6].
Молекулы в состоянии 81 могут также подвергаться конверсии в первое триплетное состояние Т,. Испускание из Т, называемое фосфоресценцией, обычно сдвинуто в сторону больших длин волн (меньших энергий) по сравнению с флуоресценцией. Конверсия из Б, в Т, называется интеркомбинационной конверсией. Переход из ^ в основное состояние запрещен, в результате чего константа скорости такого испускания на несколько порядков меньше соответствующей константы для флуоресценции. На испускание флуоресценции могут влиять и другие факторы, не показанные в явном виде на рис. 1.2: влияние растворителей, релаксация растворителя, тушение, а также реакции, происходящие в возбужденных состояниях [6].
Для явления флуоресценции известно несколько основных характеристик. Существуют и исключения, но они редки. Если какая-либо из ниже перечисленных характеристик отсутствует у данного флуорофора, можно сделать вывод о некоторых особых свойствах этого соединения.
Как правило, всегда наблюдается сдвиг испускания относительно поглощения в сторону больших длин волн, т. е. потеря энергии (исключение — атомы в газовой фазе). Потери энергии между возбуждением и испусканием, которые и составляют феномен уменьшения энергий квантов испускания по отношению к квантам возбуждения, неизменно наблюдаются для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных причин возникновения стоксова сдвига является быстрая колебательная релаксация. Вдобавок к этому стоксов сдвиг может быть еще более увеличен благодаря влияниям растворителя на флуорофоры и реакциям в возбужденных состояниях. Столкновения между молекулами приводят к релаксации, а в жидкой фазе процессы соударения происходят непрерывно.
Спектр испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждения. При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный уровень состояния 81. Эта релаксация происходит за время порядка 10"12 с и является, по-видимому, результатом сильного перекрывания множества состояний с примерно равными энергиями. Благодаря такой быстрой релаксации длина волны возбуждения обычно не влияет на спектр испускания[6].
Обычно спектр испускания флуоресценции представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое соответствует переходу из 8о в Это особенно наглядно в случае перилена (см. рис. 1.1). Симметричная природа этих спектров определяется тем, что и поглощение и испускание обусловлены одними и теми же переходами, а также сходством колебательных энергетических уровней состояний Эо и 8].
Длина Волны, им
1 г 1 л, А 1 1 ЛД о-о Поглощение -1., 1 1 | ¡-Испускание 1 1 I 1 ^^
1 0,
§ волновое число, с"'
Рис. 1.3. Спектры поглощения и испускания дифенила.
Несмотря на то, что правило зеркальной симметрии часто выполняется, из него существует множество исключений. В качестве примера на рис
1.6 приведены спектры флуоресценции дифенила.
Вслед за возбуждением фенольный протон в молекуле флуорофора переходит к акцепторам протона в растворе. В зависимости от концентрации этих акцепторов в спектре испускания может преобладать флуоресценция либо фенола, либо фенолята. Примечательно то, что многие полиядерные ароматические углеводороды также вступают в реакции в возбужденных состояниях. Так, например, молекулы пирена в возбужденном состоянии объединяются в комплексы, называемые эксимерами (сокращение от excited dimers — возбужденные димеры). Испускание эксимеров смещено в длинноволновую область по сравнению с испусканием мономеров пирена, в нем отсутствует колебательная структура. Такие полиядерные ароматические углеводороды, как пирен, перилен и антрацен, образуют с аминами комплексы с переносом заряда. Комплексы, образующиеся в возбужденном состоянии, называют эксиплексами. 28]
Часто измеряют времена затухания и квантовые выходы флуоресцирующих соединений. Смысл этих параметров состоит в описании кинетики флуоресценции. Не указывая подробно отдельные процессы релаксации, приводящие к релаксированному состоянию Si, большое внимание обращаем на процессы, которые ответственны за возвращение в основное состояние. В частности, нас интересует константа скорости излучательной дезактивации флуорофора (Г) и константа скорости безызлучательной дезактивации в состояние So (k) [6].
Квантовый выход флуоресценции — это отношение числа испущенных фотонов к числу поглощенных. Квантовый выход определяются выражением:
Q = Г/(Г+к), (1.2) где Г — константа скорости излучательной дезактивации флуорофора, 1с -скорости безызлучательной дезактивации в основное состояние [6].
Квантовый выход близок к единице в том случае, если константа скорости безызлучательной дезактивации много меньше константы скорости испускания, т. е, к «Г. Заметим, что энергетический выход флуоресценции всегда меньше единицы из-за стоксовых потерь.
Время жизни возбужденного состояния определяется как среднее время, в течение которого молекула находилась в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Обычно время затухания флуоресценции Ю"10 не. Время затухания выражается следующей формулой т = 1/(Г +к) (1.3)
Квантовый выход и время жизни могут изменяться под действием любых факторов, влияющих на константы скорости. Например, молекула может оказаться неспособной флуоресцировать из-за большой скорости внутренней конверсии либо малой скорости испускания [6].
Явления флуоресценции и фосфоресценции многих веществ, как в газовой так и в твердой и жидкой фазах, служат основой для их количественного и качественного анализа. Преимущества диагностики и анализа веществ на основе люминесценции перед другими методами заключаются в большой чувствительности и специфичности. В основном анализ флуоресцентных характеристик, как видно, происходит через прямое их измерение, например, в случае флуоресценции газообразных веществ идентификация возможна по спектральным интенсивностям на отдельных длинах волн.
1.2 Методы регистрации флуоресценции и принципы соответствующей целевой аппаратуры.
Применение явления флуоресценции для исследования веществ, определения их свойств, качественного и количественного анализа флуорофоров, а также в различных задачах контроля процессов предполагает наличие методов и инструментария для возбуждения, измерения характеристик флуоресценции и процедуры пробоотбора исследуемого материала. Во-первых, флуоресценция — очень чувствительный метод. Почти всегда можно получать наблюдаемые сигналы, увеличив коэффициент усиления приборов. Это определяет задача исследования, соответственно выбор аппаратуры регистрации должен быть согласован с требованиями диапазона параметров эмиссии вещества. Во-вторых, для выбора источника возбуждения флуорофоров необходимо знать параметры возбуждения, которые можно получить, исследуя, например, спектры поглощения вещества, и этот источник должен быть достаточно интенсивным. Подготовка и дозирование исследуемого материала налагает некоторые ограничения на виды веществ и их относительную флуорофорную чистоту. Если производится анализ слабоконцентрированного флуорофора, то флуоресценция примесей должна иметь тоже небольшую величину, сравнимую с флуоресценцией аналита. Флуоресцентный метод дает основные преимущества, делающие его иногда почти единственным методом качественного анализа [6,7, 36].
Сейчас используют несколько способов возбуждения образцов флуоресцирующих веществ. В основном применяют возбуждение оптическим излучением относительно мощного источника, в традиционной схеме в качестве которого выступает тело, испускающее излучение со сплошным спектром. Этими могут быть наиболее универсальные источники ксеноновые (Хе) дуговые лампы высокого давления. Они обеспечивают почти непрерывный спектральный выход в области 270 — 700 нм (рис. 2.3), за исключением нескольких узких линий вблизи 450 нм. Испускание света ксеноновыми дуговыми лампами происходит за счет рекомбинации электронов с ионизованными атомами Хе. Атомы Хе, находящиеся в возбужденном состоянии, дают линии в спектре, а не широкие полосы- этим обусловлены пики вблизи 450 им. Интенсивность испускания резко падает в области < 280 нм [8,9 3,4].
Л ли г, а им
РИС. 1.3. Спектральные выходы ртутно-ксеноновой (а) и ксеноновой (б) дуговых ламп.
Ртутные лампы высокого давления. Излучение этих ламп более интенсивно, чем ксеноновых, но они имеют линейчатый спектр. Обычно необходимо бывает выбрать ту длину волны, которая нужна для данного флуорофора, а не наоборот. Следовательно, такие лампы годятся только в том случае, если ртутные линии имеют подходящую длину волны для возбуждения данного флуорофора [10].
Ртутно-ксеноновые дуговые лампы имеют более высокие интенсивности излучения в ультрафиолетовой области, чем ксеноновые лампы, а присутствие Хе приводит к более широкому спектральному выходу. Однако распределение интенсивности не такое плавное, как у ксеноновых ламп (рис. 1.3). Ртутные лампы низкого давления дают очень узкие линии спектра ртути, которые используются главным образом для целей градуировки [10].
Поскольку источники вышеприведенного вида обладают сплошными спектрами излучения, для выбора излучения необходимой частоты, задаваемого спецификой задачи, вырезают всю остальную часть излучения источников с помощью монохроматора, который называется монохроматором возбуждения [9]. При этом, конечно, относительная интенсивность возбуждающего излучения будет мала по сравнению с мощностью источника. Но существует другой тип источников излучения, обладающих высокой спектральной мощностью и монохроматичностью, называемых лазерами. При возбуждении такими средствами можно достигнуть не только большой чувствительности, но и стабильности измеряемых при этом характеристик флуоресценции, а в исследовании газообразных веществ также высокой селективности. Появление лазеров открыло расширенные возможности флуоресцентных методов в науке, промышленности, медицине и технике [12,13].
Для регистрации флуоресценции и измерения ее характеристик существуют несколько схем, в основе которых лежит оптическая обработка светового отклика вещества и детектирование получаемого обработанного оптического сигнала. Чаще всего необходимо измерить как спектры возбуждения, так и спектры испускания. Спектр испускания представляет собой зависимость интенсивности испускания от длины волны при фиксированной длине волны возбуждающего света. Для измерения анизотропии флуоресценции на пути возбуждающего и испускаемого световых потоков ставят поляризаторы. Для точного измерения анизотропии флуоресценции требуется расположение поляризаторов под определенным углом, поэтому оправы поляризаторов должны быть хорошо закреплены и тщательно проградуированы. Оптический модуль может иметь дополнительный оптический путь в стороне от держателя образца. С его помощью можно проводить измерения анизотропии флуоресценции двухканальным методом, более точным, чем одноканальный метод, в котором этот дополнительный оптический канал не требуется [11].
Появление импульсных лазерных источников расширило методы регистрации такой характеристики флуоресценции, как ее кинетика. Использование пикосекундных и фемтосекундных лазеров, имеющих короткие длительности импульсов, в сочетании быстродействующими оптическими затворами позволяет регистрировать временные зависимости флоуресценции многих органических флуорофоров. Такие измерения проводят для исследования динамики молекулярных процессов и химических реакций, а также для анализа вещества с большей специфичностью [13,14,15].
При использовании сильнофокусированных пучков света для возбуждения флуоресценции становится возможным применение метода флуоресцентной коррелометрии. Он основывается на принципе регистрации самокоррелированности флуоресцентного сигнала вследствие флуктуации плотности оптически задействованных молекул внутри пучка. Такой метод позволяет с большой точностью определять концентрацию вещества в растворе и специфику [16,17,18].
Для биофизических и медицинских исследований и других областей исследования и диагностики применяют в основном спектрофлуоресцентный метод при возбуждении биологического субстрата лазерным излучением. Сигнал регистрирут при помощи полихроматора, соединенного с многоканальной ПЗС — линейкой, оцифровывают и подают на вход компьютера, который обрабатывает результаты измерений. Для удобства при эндокавитарных исследованиях возбуждающее излучение и флуоресцентный сигнал подводят к исследуемому участку через оптоволокно [19,20].
В большинстве практических задач биомедицинских исследований применение флуоресцентного метода требует наличия специфических флуоресцирующих веществ, вводимых в исследуемый материал в качестве зондов и маркеров. Такой подход сопряжен с дополнительными расходами и не является универсальным вследствие необходимости постоянной разработки флуоресцентных материалов для расширения области применения такой диагностики. Напротив, детектирование и спектральный анализ флуоресценции природных флуорофоров используется сравнительно узкоспециализированно, хотя сами методики на основе этого являются более универсальными и менее затратными и трудоемкими [46].
Получаемый сигнал во всех измерительных системах для осмысления несомой им информации требует наличия специфических методов его обработки и экспертной системы прогнозирования и диагностики на результатах информационного преобразования. При этом получаемый в результате измерений сигнал должен быть тоже хорошего качества. Эти качества задаются такими параметрами измерительных установок, как чувствительность (минимальная концентрация определяемых веществ), воспроизводимость (повторение сигналов в хорошем качестве от измерения к измерению), объективность (насколько производимый на основе получаемого сигнала анализ соответствует действительности). По сравнению с другими методами анализа, такими как бактериологический, флуориметрический, например реализуемый на аппарате «Спектролюкс МБ», уступает в чувствительности (102 против 10б КОЕ (колониеобразующие единицы)/мл), однако намного превосходит по скорости (несколько недель против минут) и объективности (не всегда удается высевать материал бактериологическим методом). Аппаратура для диагностики должна снабжаться методическим обеспечением, доступным для использующего аппаратуру врача, или другого специалиста. Также важна стандартизация всех этапов диагностики, например пробоотбора, когда взятие образцов и их предварительная обработка происходит в одинаковых условиях
1.3 Методы диагностики на основе регистрации флуоресценции природных флуорофоров для биологии и медицины.
Взаимодействия излучения с живым веществом протекают в основном с участием сил электромагнитного взаимодействия заряженных элементарных частиц атомов и молекул с полем излучения, а также дополнительно с участием их обменного взаимодействия друг с другом. При этом наблюдаются такие эффекты, как отражение, рассеяние, поглощение, генерация акустического поля, нелинейные эффекты, флуоресценция и.т.д. [6, 20, 37].
Свет, отраженный от организма, в первую очередь дает информацию о содержащихся в ткани фотохромах и структуре ткани. Если ткань содержит собственные или введенные извне флуорохромы, то индуцированная светом флуоресценция несет информацию о многих биологических процессах, протекающих в организме. Стандартной целью медицинской диагностики, основанной на флуоресценции вещества организма, является в конечном итоге принятие решения о принадлежности тестируемого больного к той или иной группе известных заболеваний [46].
Из большого числа видов биологических веществ есть достаточно много таких, которые являются природными, или естественными, флуорофорами. Это означает, что при соответствующих оптических способах возбуждения и регистрации можно наблюдать некоторый флуоресцентный отклик, характеризующий возбуждаемый материал. Иногда содержание эндогенных флуоресцирующих веществ в составе живых систем и организмов настолько велико, что флуоресценцию можно наблюдать визуально. Такую сильную флуоресценцию дают, например, все зеленые части фотосинтезирующих растений, поскольку пигмент хлорофилл состоит из ароматического порфиринового комплекса, обладающего кроме сильной окраски еще относительно большим квантовым выходом флуоресценции [22]. На основе регистрации лазерно-индуцированной флуоресценции фотосинтезирующих зеленых организмов существуют методы диагностики состояний садовых и культивируемых растений, наличие болезней, минеральной специфики питающих растения почв, а также дифференцирование различных типов водорослей, обитающих около поверхности океанических вод, и.т.д. [22,40]. Таким образом, диагностика на основе регистрации флуоресценции эндогенных флуорофоров может быть универсальным методом определения специфики и состояния живых организмов и их систем, таких как не только растения, но и все остальные организмы. Этот пример диагностики на основе флуоресценции растений не уникален в своем роде, поскольку кроме хлорофилла можно наблюдать флуоресценцию других природных органических веществ. Ниже приведены некоторые классы флуоресцирующих веществ, встречающихся в живых системах.
Большинство порфиринов дают флуоресцентный отклик, который можно наблюдать при возбуждении излучением из широкого диапазона длин волн. Порфирины и их производные входят в разнообразные биологически активные соединения, такие как белковые комплексы различных фотосинтетических аппаратов растений и водорослей, ферментирующие комплексы, осуществляющие различные звенья дыхательного внутриклеточного цикла (цитохромы, пероксидаза, оксидаза, каталаза), в состав различных гемопротеидов (гемоглобин, миоглобин) и мн. др. [65]. Они представляют собой производные тетрапиррола порфина, состоящего из 4-х пиррольных колец соединенных метиленовыми группами. Такая конфигурация позволяет этим молекулам разнообразным образом взаимодействовать с большим количеством видов минеральных и органических веществ, что и определяет их большую биологическую активность. В тоже время электроны, делокализованные в ароматических кольцах, могут эффективно возбуждаться оптическим путем и совершать флуоресцентную релаксацию возбужденных состояний. Флуоресценция порфиринов может быть индуцирована излучением с длиной волны от 250 нм до 700 нм [23].
В организме человека биологически-активными являются металлопорфирины- они, как правило, флуоресцируют слабо. При образовании комплексов с белками (гемоглобин) они даже гасят флуоресценцию. При отрыве атома железа от простетической группы внутриклеточные гемопорфирины начинают флуоресцировать. В тканях и препаратах ферментов, способных к осуществлению начальных этапов синтеза порфиринов, наблюдается усиление интенсивности флуоресценции. Протопорфирины — часть молекулы гемоглобина, найдены в свободной форме в эритроцитах, что придает им красную флуоресценцию низкой интенсивности. При недостаточности железа, например, при отравлении свинцом, содержание протопорфиринов растет [36]. Основным порфирином, присутствующим в норме в моче и кале, является корпропорфирин. Примерно половина корпропорфирина в свежей моче находится в не флуоресцирующей форме. При довольно мягких условиях окисления не флуоресцирующая форма переходит во флуоресцирующую. В результате распада порфиринов, проходящего в несколько этапов, образуется уробилиноген, часть которого из производных желчного сока вновь всасывается через стенки кишечника и удаляется из кровотока с кровью, но при некоторых патологических процессах выводится с мочой. На воздухе уробилиноген окисляется до уробилина, который флуоресцирует[37].
Список литературы
- Осин H. С., Храмов E. H., Злобин В. H. Технические средства индикации биопатогенов как основа обеспечения биологической безопасности, Молекулярная медицина № 3 2006
- Alexandrov М., Vorobjev A., Pashkov Е., Philotov М., et. al. The laser fluorescent diagnostics in medicine, food, industry, ecology. 2003, Electronics: NTB, 3, 43
- Vandepitte, K. Engbaeck, P. Piot at al., Basic laboratory procedures in clinical bacteriology, World Health Organization, Geneva, 1994, vol. 132.
- Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. Меньшикова В. В., М., Медицина, 1987, 368с.
- Л.В. Левшин, A.M. Салецкий Люминесценция и ее измерения. МГУ, 1989, 279 с.
- Paul Westerhoff, Wen Chen and Mario Esparza, Fluorescence Analysis of a Standard Fulvic Acid and Tertiary Treated Wastewater Journal of Environmental Quality 30:2037−2046 (2001)
- Хейфец B.X., Хролович А. Б., Каган О. Ф. фотодинамическая диагностика и ее использование для выявления и лечения злокачественных новооразований мочевого пузыря, российский медицинский журнал, т 5, СТ. 17 (стр. 260−263)
- Беловолова Л.В., Глушков М. В., Виноградова Г. И. Особенности флуоресценции воды, активированной электролизом. Роль активных форм кислорода. ЭНЖ «Исследовано в России» http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/268.pdf
- Брумберг Е.М. Применение ультрафиолетовых лучей в хроматографии. Успехи физических наук Т. XLIII, вып. 4, 1951.
- Николаев И.В., Очкин В. Н., Савинов С. Ю., Спиридонов М. В., Цхай С. Н., Измерение поглощения двуокиси азота в атмосфере методом двулучевой диодной лазерной спектроскопии, Известия ФИАН, 2007.
- Palmer GM, Keely PJ, Breslin TM, Ramanujam N, Autofluorescence spectroscopy of normal and malignant human breast cell lines, Photochemistry and Photobiology, 78: (5) 462−469 NOV 2003
- Two-photon fluorescence excitation in detection of biomolecules, Soini E, Meltola NJ, Soini AE, Soukka J, Soini JT, Hanninen PE, Photochemical society transactions, 28: 70−74, Part 2 FEB 2000
- Z Bajzer, AC Myers, SS Sedarous and FG Prendergast Pade-Laplace method for analysis of fluorescence intensity decay, Biophys. J. 56: 79−93.
- К Clays, J Jannes, Y Engelborghs and A Persoons, Instrumental and analysis improvements in multifrequency phase fluorometry, 1989 J. Phys. E: Sci. Instriim. 22 297−305
- Peter J. Verveer, Anthony Squire, and Philippe I. H. Bastiaens, Global Analysis of Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy Data, Biophys. J, April 2000, p. 2127−2137, Vol. 78, No. 4
- Blom H, Johansson M, Gosch M, Sigmundsson T, Holm J, Hard S, Rigler R, Parallel flow measurements in microstructures by use of a multifocal 4×1 diffractive optical fan-out element, Applied Optics, 41: (31) 6614−6620 NOV 1 2002
- Edman L, Mets U, Rigler R, Conformational transitions monitored for single molecules in solution, Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America, 93: (13) 6710−6715 JUN 25 1996
- Schwille P, MeyerAlmes FJ, Rigler R, Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution, Biophysical Journal, 72: (4) 1878−1886 APR 1997
- Приезжев А.П., Тучин B.B., Лазерная диагностика в биологии и медицине, М.: Наука 1989
- Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях, Саратов Изд-во Сарат. Ун-та 1998, 350с.
- V.A. Karavaev, I.B. Polyakova, М.К. Solntsev, Т.Р. Yurina, Effect of various chemical agents on photosynthesis studied by the method of fluorescence induction, Journal of Luminescence. 1998. V.76. P.335.
- Александров M.T., Таубинский И. М., Козьма С. Ю. Способ для обнаружения и оценки концентраций анаэробных бактерий в биологическом субстрате. Патент РФ № 97 100 364 от 21.01.97.
- Zengbush P. Molecular and cellular biology 1982, M, Mir, v. 1,2.
- Luppa C. General histochemistry, 1980, M, Mir.
- Lakowiczh J. Fluorescence spectroscopy p. 1982, Willey.
- H. Schneckenburger Laser-Assisted Fluorescence Microscopy and Biomedical Screening 2006, Laser Physics 16, 5, 799
- Martens H., Naes T. Multivariative calibration. 1998, Willey.
- Kloefer J.A., Mielke R.E., Wong M.S., et al. Quantum dots as strain- and metabolism-specific microbiological labels, 2003, Applied and environmental biology, 69, pp 4205−4213
- Lucas A., Perk M., Wen Y., Smith C. Fluorescence spectroscopic detection of early injury-induced atherosclerosis, 1992, Proc. SPIE, v. 1642, p 183−190
- V.V. Sokolov, E.V. Filonenko, L.V. Telegina, N.N. Bulgakova, V.V. Smimov, Quantum electroincs, 32, 11, c. 963−969.(2002)
- T. Naes, H. Martens, Multivariate calibration.
- Юденфренд С «флуоресцентный анализ в биологии и медицине» М., Мир 1965 г.
- Kanig К., Hibst R., Meyer Н., Laser-induced autofluorescence of carious regions of human teeth and cariesinvolved bacteria. Proc. of SPIE, 1993, 2080: 170−180
- Kloepfer JA, Mielke RE, Wong MS, Nealson KH, Stucky G, Nadeau JL, Quantum dots as strain- and metabolism-specific microbiological labels, Applied Environmental Microbiology, 69: (7) 4205−4213 JUL 2003
- Владимирский M.A., Шипина, JI.K., Филиппов В. И., Иртуганова О. А., Стаханов В. А. патент РФ № 2 140 084, 1998 г. «Матрица иммуносорбента».
- Фадеев В.В. //Вестн. МГУ. Сер. 3, Физика, астрономия. 1998. № 4. С. 4958.
- Ежов А.Н., Шумский С. А. Нейрокомпьютинг и его приложение в экономике и бизнесе. М.: МФТИ, 1998Л
- О.В. Козырева, К. В. Попов, О единственности решения обратных задач флуориметрии насыщения сложных органических соединений. «Квантовая электроника», 30, № Ю, 2000.
- Тихонравов А.В., Трубецков М. К. В сб. Компьютеры в лаборатории (М., изд-во МГУ, 1992, с 32).
- Ежов А.Н., Шумский С. А. Нейрокомпьютинг и его приложение в экономике и бизнесе. М.: МФТИ, 1998
- Н.М. Гальберштам, И. И. Баскин, В. А. Палюлин, Н. С. Зефиров. Нейронные сети как метод поиска зависимостей структура свойство органических соединений Успехи химии, 72, 706 (2003).
- Zengbush P. Molecular and cellular biology 1982, M, Mir, v. l, 2.
- Luppa C. General histochemistry, 1980, M, Mir.
- Lakowiczh J. Fluorescence spectroscopy p. 1982, Willey.
- H. Schneckenburger Laser-Assisted Fluorescence Microscopy and Biomedical Screening 2006, Laser Physics 16, 5, 799
- Alexandrov M., Vorobjev A., Paslikov E., Philotov M., et. al. The laser fluorescent diagnostics in medicine, food, industry, ecology. 2003, Electronics: NTB, 3, 43
- Martens H., Naes T. Multivariative calibration. 1998, Willey.
- Beeb K. R., Pell R. J., Seasholtz M. B. Chemometrics A Practical Guide., Wiley.
- Eriksson L., Johansson E., Kettaneh-Would N., Would S. Multi and Megavariate Data Analysis. 2001, Umetrics AB.
- Cattell, R. B. The screen test for the number of factors. 1966, Multivariate Behavioral Research, 1, 629−637.
- P. Geladi, K. Esbensen. Chemometrics, a growing and maturing discipline (Editorial).
- Chemom. Intell. Lab. Syst., 7, 197 (1990)
- M.A. Шараф, Д. Л. Иллмэн, Б. Р. Ковальски. Хемометрика, Пер. с англ. М. Мир: 1987 М. Sharaf, D. Illman, В. Kowalski. Chemometrics. NY: Wiley. 1986.
- B.G. Osborne, T. Feam. Near Infrared Spectroscopy in Food Analysis, Longman Scientific and Technical, Harlow, Essex, England, 1986.
- T. Naes, C. Irgens, H. MartensComparison of linear statistical methods for calibration of
- NIR instruments. Appl. Stat., 35,195 (1986)
- P. Geladi, H. Grahn. Multivariate Image Analysis, Wiley, Chichester 1996
- G. Molenberghs. Biometry, Biometrics, Biostatistics, Bioinformatics,., Bio-X Biometrics, 61, 1 (2005)
- A. Bogomolov, M. McBrien. Mutual peak matching in a series of HPLC/DAD mixtureanalyses, Anal. Chim. Acta, 490, 41 (2003)
- Морозова O.A. Экспериментальное обоснование экспресс-метода лазерной флуоресцентной диагностики заболеваний микробной природы: Автореф. Дис. Кнд. Мед. Наук. -М., 2001. 25с.
- Грачева Н. М., Гончарова Г. И., Аваков А. А. и др. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика, лечение дисбактериоза кишечника. Метод. Рекомендации, М., 1986, 24 с.
- Bennet R., Nord С.Е., Infection, 1988, vol. 18, p.332−336.
- Воробьев A.A., Несвижский Ю.В.Микрофлора человека и иммунитет: единство и противоположность. Сборник трудов. Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии., М. 1997, с.137−141
- Воробьев A.A., Пак С.Г., и др. Дисбактериозы у детей. Учебное пособие для врачей и студентов, М. 1998, 64 с.
- Бондаренко В.М. Общий анализ представлений о патогенных и условно патогенных бактериях. Микробиология, 1997, № 4, с.20−25.
- Куваева И.Б., Ладодо К. С. Микроэкологичекие и иммунные нарушения у детей: диетическая коррекция. АМН СССР, М., Медицина, 1991, 240 с.
- Шендеров Б.А. Значение колонизационной резистентности в патогенезе инфекционных заболеваний. В кн.: Иммунология инфекционного процесса. Под ред. В. И. Покровского и др., М. 1994.
- Luckey T.D. Overview of gastrointensial mikroecology. Die Nahurg, 1987, vol. 31.5−6
- Savage D.C. The normal human microflora composition-In: The regulatory and protective role of the normal microflora (eds. Grubb R. et al.) M Stocton Press, New York, 1989.
- Simon G.L., Gorbach S.L. Intensial flora in heath and disease. Gastroentorology, 1984, vol. 86.
- Шендеров Б. А Медицинская микробная экология и функциональное питание, т. 1, М., 1998, 287с.
- Несвижский Ю.В., Воробьев A.A. и др. Анализ межмикробных взаимоотношений в биоценозе толстой кишки. Материалы VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов., М., 1997, с.272−273.
- Rush V.C. Das konzept symbiose: Eine ubersieht uber die terminologie zur beschreburng von lebensgemeinschaften ungleichnamiger Organismen. Microecol. Theraphy., 1989, vol. 19.
- M3 СССР, приказ № 535, 22.04.1985 г., «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебго-профилактических учреждений, М., 1985
- Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология, М., Гэотар медицина, 1999, с 1200
- Vandepitte, К. Engbaek, P. Pilot at al. Basic laboratory procedures in clinical bacteriology, Worlf Health Organization, Geneva, 1994, vol. 132
- Осипов Г. А. Способ определения родового (видового) состава ассоцации микроорганизмов. Патент РФ № 2 086 642. C12N 1/100, 1/20, C12Q Ул. Приоритет от 24 дек 1993 г.
- Kanig k. et al., «Laser induced auto fluorescence of carious regions of human teeth and canesinvolved bacteria», Proceedings SPIE Budapest. 2080., 1993
- Миронов А.Ю., Пашков Е. П. Использование газожидкостной хроматографии в анаэробной бактериологии //Лаб. Дело, 1988, № 3, с. 3−9.
- Осипов Г. А., Демина A.M. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах// Вестник РАМН. -1996, Т.13, № 2, С. 52−59.
- V. Moskalenko, N.A. Molodtsov., Laser-based point detector for on-line identification of biological warfare materials., NATO advanced research workshop (Brno, Czech Republic, 2006) p. 13−14.