На современном этапе развития медицины проблема гнойно-воспалительных заболеваний (ГВЗ) привлекает внимание специалистов разного профиля. Высокая частота внутрибольничного инфицирования, удлинение сроков госпитализации с соответствующим удорожанием и ухудшением результатов лечения, высокий процент летальности определяют неослабевающий интерес к этой проблеме, имеющей не только медицинское, но и социально-экономическое значение.
Распространенность ГВЗ, вызванных грамположительными микроорганизмами, возрастает во всем мире (Яцык F.B.,, Бомбардирова Е. П., 2000; Real Т.М., 1999; Chang S.C. et al., 2000; Shopsin B. et al., 2000). Среди последних, несомненно, ведущее место занимают стафилококки.
Интерес к изучению стафилококковых инфекций, «чумы XX века», как их называли в 60−70-е гг., не ослабевает и в настоящее время. Это объясняется большим удельным весом стафилококков в этиологии самых разнообразных гнойно-воспалительных заболеваний. Гнойно-воспалительные заболевания, в том числе и стафилококковые, инфекции, чаще развиваются при состояниях, сопровождающихся угнетением противоинфекционной резистентности организма, что в большей степени реализуется в условиях стационара. К тому же широкое применение антибиотиков при лечении инфекционных заболеваний резко изменило биологические свойства многих микроорганизмов, в том числе и стафилококков.
Стафилококк имеет существенное значение как патоген, демонстрирующий выраженную способность к формированию устойчивости практически ко всем противостафилококковым антимикробным препаратам, используемым в клинической практике. К сожалению, тенденция роста устойчивости бактерий имеет прогрессирующий характер и в ближайшей перспективе не видно реальных мер по сдерживанию этого процесса (Яковлев С.В. с соавт., 2001; Rubin RJ. et al., 1999).
Особую важность представляет собой распространение стафилококков, резистентных к метициллину (или оксациллину). В настоящее время метициллинорезистентные стафилококки (MRS) рассматриваются в качестве одного из ведущих нозокомиальных патогенов (Зайцев А.А. с соавт., 2003). Весьма тревожным фактом является появление стафилококков со сниженной чувствительностью к ванкомицину (Hiramatsu К et.al., 1997; Rasooly A., Weisz А., 2002; Bell J.M. et al., 2002 и др.). Эти особенности стафилококков являются причиной существенного ограничения выбора антибактериальных препаратов для лечения инфекций, вызванных такими штаммами микроорганизмов.
Необходимость поиска путей и средств борьбы со стафилококковой инфекцией и преодоления антибиотикорезистентности стафилококков подчеркивалась неоднократно. Для борьбы с развитием лекарственной устойчивости стафилококков возможны разные пути: предупреждение формирования и ограничение распространения лекарственноустойчивых популяцийснижение уровня уже сформировавшейся резистентностииспользование антимикробных препаратов, относящихся к разным классам химиотерапевтических средств (Навашин С.М., Сазыкин Ю. О., 1985; Дьяков С. И. с соавт., 1988).
Кроме перечисленных, одним из перспективных путей преодоления лекарственной устойчивости является поиск и внедрение в практику новых антибактериальных агентов, в том числе с отличным от широко применяемых антибиотиков строением и механизмом действия. Значительным событием на этом пути явилось открытие в 1939 году Доддом, Стилменом и др. у производных 5-нитрофурана антимикробного действия и успешно произведенный их синтез. В дальнейшем на их основе.
8 • был создан ряд высокоактивных противомикробных средств (Алексеева JI.H., 1963).
По сравнению с другими антимикробными средствами препараты нитрофуранового ряда имеют ряд преимуществ. Обладая широким спектром антимикробной активности, они существенно не влияют на общую иммунологическую реактивность макроорганизма (Шуб Г. М., 1965). Нитрофураны обладают способностью усиливать поглотительную активность фагоцитирующих клеток (Проскуров В.А., 1974) и клеток ретикуло-эндотелиальной системы (Шуб F.M. с соавт., 1970). Кроме того, стоимость большинства препаратов невелика, что немаловажно при их массовом применении в терапевтических и профилактических целях. Нитрофураны (кроме фуразолидона) имеют небольшую молекулярную массу (157−297 Дальтон), благодаря чему легко проникают через стенки кровеносных и лимфатических сосудов, а также гематоэнцефалический барьер, что выгодно отличает их от антибиотиков. Как вещества с низкой молекулярной массой, нитрофураны менее активны как возможные аллергены.
В медицинской практике препараты нитрофуранового ряда получили наибольшее распространение в 60−70-х гг. Однако, и в настоящее время, несмотря на создание новых антибиотиков, данные соединения не утратили своего значения, т.к. нитрофураны эффективны против антибиотикои сульфаниламидоустойчивых штаммов возбудителей. Об этом свидетельствуют результаты исследований А. В. Чернышкова (2003), отметившего, что 90−98% S. flexneri и S. sonnei сохраняют чувствительность к нитрофурантоину.
По данным А. Ю. Томникова (1989), максимальное и минимальное значение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) фурагина для 215 изученных им клинических штаммов стафилококков составили 50 и 1,56 мкг/мл, соответственно. Тем не менее, развитие устойчивости к препаратам нитрофуранового ряда является вполне реальным, о чем.
9 ¦ свидетельствуют результаты исследований Т. И. Турлуповой (1974), Олениной Н.А.(1982) и др.
Учитывая вышеизложенное, поиск веществ с антимикробной активностью в ряду производных нитрофуранового ряда и их изучение в т. ч. и в отношении стафилококков является достаточно актуальной задачей.
На кафедре органической и биоорганической химии Саратовского государственного университета им. H.F. Чернышевского и кафедре микробиологии с вирусологией и иммунологией Саратовского государственного медицинского университета на протяжении многих лет проводится совместная работа по синтезу и изучению антимикробной активности новых химических соединений. Одним из направлений этой работы является поиск новых антимикробных средств в ряду серу-, азоти кислородсодержащих гетероциклов.
Целью настоящей работы явилось изучение антимикробного действия новых оригинальных несимметричных диарилиденцикланонов и синтезированных на их основе замещенных гексагидроиндазолов и углубленное исследование выявленных среди них средств, обладающих противостафилококковой активностью.
Задачи исследования:
1) Изучить противомикробную активность в отношении основных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний, в том числе стафилококков, новых оригинальных несимметричных диарилиденцикланонов и синтезированных на их основе замещенных гексагидроиндазолов.
2) На клинических штаммах стафилококков — возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний изучить антимикробную активность отобранных по результатам первичного скрининга соединений.
3) Провести сравнительный анализ антистафилококковой активности отобранных соединений с коммерческим препаратом нитрофуранового ряда (фуразолидон) и с одним из цефалоспоринов III поколения цефотаксим натриевая соль), часто используемыми для лечения стафилококковых инфекций.
4) Определить оптимальные условия проявления противостафилококковой активности этих соединений и изучить влияние на некоторые биологические свойства стафилококков.
5) С использованием микробиологических показателей изучить влияние отобранных соединений на функциональное состояние нормальной микрофлоры кишечника белых мышей.
6) На модели экспериментальной стафилококковой инфекции белых мышей дать оценку химиотерапевтической эффективности отобранных соединений.
Актуальность работы определяется широким распространением стафилококковых инфекций, трудностями их лечения, необходимостью изыскания новых химиотерапевтических средств, активных в отношении антибиотикорезистентных стафилококков.
Научная новизна. В работе впервые дана характеристика антимикробной активности новых оригинальных несимметричных диарилиденцикланонов и замещенных гексагидроиндазолов на их основе в отношении тест-штаммов S. aureus АТСС 29 213,.
E.coli АТСС 25 922, P. aeruginosa АТСС 27 853, P. mirabilis 20 -представителей наиболее частых возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний. Отобраны 2 активных в отношении стафилококков соединения (нитро)фурфурилиденсодержащих гексагидроиндазолов: 2,3-дифенил-7-(5-нитрофурфурилиден)-3,За, 4,5,6,7-гексагидроиндазол (лабораторный шифр 19) и 3-(5-нитрофурил)-7-(5-нитрофурфурилиден)-3,За, 4,5,6,7-гексагидро-2Н-индазол (лабораторный шифр 26). Показана их высокая, не уступающая фуразолидону и близкая цефотаксиму натриевой соли, антимикробная активность в отношении клинических штаммов стафилококков.
Установлено, что на проявление противостафилококковой активности соединений 19 и 26 оказывает влияние концентрация микробных тел, присутствие в среде биологических субстратов (крови и сыворотки крови) в концентрациях 5 и 10%. Показано, что популяции стафилококков гетерогенны по признаку чувствительности к соединению 26.
Представлены данные об отсутствии влияния соединения 26 на колонизационную резистентность кишечника белых мышей.
Впервые дана оценка химиотерапевтической эффективности соединения 26 при экспериментальной стафилококковой инфекции.
Практическая значимость. Результаты проведенного исследования позволили впервые охарактеризовать антимикробную активность оригинальных несимметричных диарилиденцикланонов и синтезированных на их основе замещенных гексагидроиндазолов, выявить среди них и изучить вещества с выраженной противостафилококковой: активностью, оценить их химиотерапевтическую эффективность при экспериментальной стафилококковой инфекции и рекомендовать их для углубленного изучения в качестве потенциальных средств химиотерапии стафилококковых инфекций.
Полученные результаты исследований охраноспособны. На соединение с лабораторным шифром 26 подана заявка на патент РФ. Регистрационный номер 2 005 100 679 от 17.01.05.
Результаты проведенных исследований позволяют проводить направленный синтез в ряду серу-, азоти кислородсодержащих гетероциклических соединений производных гексагидроиндазолов веществ с антимикробной активностью, а вещества с лабораторным шифром 19 и 26 рекомендовать для углубленного лабораторного и доклинического изучения в качестве возможных средств этиотропной химиотерапии стафилококковых инфекций.
По материалам диссертации подготовлены и изданы методические рекомендации «Изучение антимикробной активности новых химических соединений», предназначенных для студентов факультета медико-профилактическое дело и фармацевтического факультета (утверждено на ЦКМС СГМУ, выписка из протокола № 5 от 20.01.05).
Результаты диссертационной работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий на факультетах Саратовского государственного медицинского университета, Саратовского государственного аграрного университета им. Н. И. Вавилова, Саратовского государственного университета им. Н. Г. Чернышевского, что подтверждено актами о внедрении в учебный процесс.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях Саратовского государственного медицинского университета «Молодые ученые — здравоохранению региона» (2003, 2004), V Российской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии» (2003), VI Российской конференции «Современные проблемы антимикробной химиотерапии» и 11th Scientific Meeting European Society of Chemotherapy Infection Diseases (2004), Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология-XXI век» (2004), X Всероссийской конференции «Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов» (2004), Научно-практической конференции с международным участием «Роль клинической микробиологии в профилактике внутрибольничных инфекций» (2004), 2nd Interactional Symposium «Resistant Gram-Positive Infections» (2004).
Структура работы. Диссертации изложена на 179 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, практических рекомендаций, выводов, списка использованной литературы, включающего 254 источника, из них 136 отечественных и 118 иностранных авторов и приложений. Работа иллюстрирована 18 таблицами, 19 рисунками и 6 фотографиями.
ВЫВОДЫ.
1. В ряду новых оригинальных несимметричных диарилиденцикланонов и синтезированных на их основе замещенных гексагидроиндазолов обнаружены соединения с лабораторными шифрами 26 и 19, обладающие выраженной антимикробной активностью в отношении стафилококков. LD50 соединения 26 для белых мышей при внутрибрюшинном введении составляет 500 мг/кг, что позволяет отнести его к группе малотоксичных.
2. Соединение 26 обладает высокой антимикробной активностью в отношении клинических штаммов стафилококков, превышает таковую соединения 19, фуразолидона и цефотаксима натриевой соли в 5,7, 3,0 и 1,5 раза соответственно.
3. Противостафилококковая активность соединений 19 и 26 находится в обратной зависимости от величины микробной нагрузки и не зависит от изменений рН в диапазоне 6,0−8,0, а также наличия в среде биологических субстратов (сыворотки или крови) в концентрации не более 1%.
4. Соединение 26 в концентрации, равной 0,5 МИК, вызывает удлинение лаг-фазы развития популяций стафилококков и к 24 часам снижает уровень их численности по сравнению с контролем на 1 — 4 порядка. В концентрации 1 МИК оказывает бактериостатический и бактерицидный эффект. Соединение 26 не оказывает влияния на покоящиеся клетки культур стафилококков.
5. Популяции штаммов стафилококков гетерогенны по признаку чувствительности к соединению 26. В популяциях всех изученных штаммов имеется до 17% клонов устойчивых к 2 МИК, от 2 до 40% клонов чувствительных к 0,5МИК и 1 — 4% клонов чувствительных к 0,25 МИК.
6. Соединение 26 при энтеральном введении в течение 3-х и 6-ти дней в дозах 50мг/кг и 100 мг/кг не оказывает влияния на колонизационную резистентность толстого кишечника белых мышей.
7. Соединение 26 при введении в течение 3-х дней в дозах 20 и 10 мг/кг обладает выраженной химиотерапевтической активностью при лечении экспериментальной стафилококковой инфекции, вызванной внутрибрюшинным заражением белых мышей, начатом как одновременно с заражением, так и через 24 часа. Эта активность подчиняется закону доза — эффект.
8. Соединение 3-(5-нитрофурил)-7-(5-нитрофурфурилиден)-3,За, 4,5,6,7-гексагидро-2Н-индазол (лабораторный шифр 26), рекомендуется для углубленного изучения как потенциальное средство химиотерапии стафилококковой инфекции.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
1. Результаты проведенных исследований позволяют проводить направленный синтез новых азотсодержащих гетероциклических соединений с антимикробной активностью.
2. Соединение 3-(5-нитрофурил)-7-(5-нитрофурфурилиден)-3,За, 4,5,6,7-гексагидро-2Н-индазол (лабораторный шифр 26), обладающее низкой токсичностью, высокой противостафилококковой активностью и выраженной химиотерапевтической эффективностью при лечении экспериментальной стафилококковой инфекции, подлежит дальнейшему углубленному изучению с целью создания на его основе препаратов для химиотерапии стафилококковых инфекций.
