Характеристика паттернов информативных лабораторных показателей развития системного воспалительно-инфекционного процесса у больных с тяжелыми термическими травмами

Актуальность проблемы.

Ожоги — одна из самых распространенных и разрушительных форм травмы. По данным Всемирной организации здравоохранения термические поражения занимают 3 место среди прочих травм, в России на их долю приходится 10−11% случаев [2, 21, 34]. 75% пациентов с тяжелыми ожогами (более 40% общей поверхности тела) умирают от сепсиса, вызванного инфекцией ожоговой раны и/или от развивающегося синдрома полиорганной недостаточности (ПОН) [68, 77, 83, 136]. Как отмечает H.A. Гординская (2008): «практически каждого больного с обширными глубокими ожогами следует рассматривать как потенциально септического с первых суток после травмы». В настоящее время сепсис характеризуется как комплексный иммунный ответ, который варьирует во времени и демонстрирует поляризацию цитокиновой экспрессии:

1) в раннюю фазу — системный гипервоспалительный ответ на фоне потери компетенции основных эффекторов врожденного иммунного ответа — клеток миелоидно-фагоцитарной системы (МФС) (главным образом, способности к партнерству и кластрированию в создании очага локального воспаления) при тяжелых ожоговых травмах;

2) в позднюю фазу — гиперпродукцию противовоспалительных цитокинов в ассоциации с выраженным апоптозом клеток врожденного и адаптивного иммунных ответов [11,91, 104, 109].

Цитокины являются важными регуляторами иммунных процессов, и их продукция осуществляется клетками многих типов, прежде всего, моноцитами и нейтрофилами [8, 14, 60, 72, 106, 128, 140, 142]. Однако в условиях системного воспаления основную роль в создании системных цитокиновых полей различной поляризации и выраженности берут на себя клетки эндотелия [66, 92], в то время как мононуклеары (МПК) и нейтрофилы (НПК) периферической крови выступают больше не в качестве организаторов локального очага классического воспаления, а в роли мишеней активных биологических молекул, включая цитокины сыворотки крови, молекулы микробных паттернов и т. д., то есть теряют свойства чрезвычайно значимые для защиты организма от инфекции [56, 94].

Анализ литературы, посвященной вопросам дестабилизации цитокинового гомеостаза при ожоговой болезни, показал, что большинство исследований направлено на мониторирование уровней цитокинов в сыворотке крови на протяжении с 1-х по 28-е сутки после ожога, в зависимости от клинико-лабораторных параметров пациентов, в том числе: площади ожоговой поверхности, глубины поражения, вида колонизирующих и (или) инвазирующих ожоговую рану микроорганизмов и т. д., которые могли бы стать основой построения прогностической кривой [44, 79, 85, 126]. К сожалению, ожидания не принесли желаемых результатов.

Нами был выбран другой подход — комплексная оценка цитокиновой составляющей и растворимой формы триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках 1 типа (soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 — sTREM-1), сыворотки крови и цитокинового ответа клеток МФС больных с тяжелой термической травмой в период после ожогового шока (3−6 сутки после травмы) и период септикотоксемии (10−17 сутки после ожога), с последующей интерпретацией полученных показателей в зависимости от данных ретроспективной оценки тяжести течения и исхода ожоговой болезни (25−40 сутки — дни наблюдения) [38]. Выбор временных точек был основан на результатах исследований авторов [2, 10,23, 104] о наибольшем риске развития сепсиса у обожженных в период с 7 по 14 сутки после ожога (по типу септического шока), либо спустя месяц и более после поражения при длительном существовании инфицированных ожоговых ран.

К сожалению, несмотря на достигнутые успехи в области комбустиологии, многие вопросы, касающиеся патогенетических механизмов развития сепсиса при ожоговой болезни, изучены недостаточно, а результаты работ часто носят дискуссионный характер. Об этом свидетельствует рост частоты возникновения сепсиса, ежегодное увеличение количества летальных исходов у септических больных, недостаточная эффективность терапевтических мероприятий, что приводит к большим экономическим затратам и оставляет актуальными дальнейшее исследование комплексных механизмов, вовлеченных в развитие сепсиса при ожоговой болезни, поиск ранних предикторов развития сепсиса, его осложнений и исхода, и идентификацию новых терапевтических мишеней [58, 68, 75].

Цель исследования.

Оценить комплекс иммунологических лабораторных показателей, характеризующих развитие системного воспалительно-инфекционного процесса у больных с тяжелой термической травмой в ранний период ожоговой болезни и соотнести полученные результаты с данными ретроспективного наблюдения — развитием сепсиса, тяжестью течения (сепсис/осложненный сепсис) и его исходом (выжил/не выжил).

Задачи исследования.

1. Оценить концентрацию цитокинов (интерлейкина (1Ь)-6, 1Ь-8, фактора некроза опухоли альфа (ТЪГР-а), интерферона гамма (1Р1Ч-у), 1Ь-1р, рецепторного антагониста интерлейкина 1 (1Ь-1Ыа), 1Ь-10,1Ь-18,1Ь-2,1Ь-4) и зТ11ЕМ-1 в сыворотке крови больных на 3−6 (период после ожогового шока) и 10−17 (период септикотоксемии) сутки после тяжелой термической травмы и выявить возможную взаимосвязь между их уровнями и моно/смешанным инфицированием ожоговой раны.

2. Провести сравнительный анализ уровней цитокинов и бТЯЕМ- 1 в сыворотке и супернатантах активированных и интактных мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови доноров и пациентов с тяжелыми ожогами на 3−6 и 10−17 сутки после травмы.

3. Определить уровень секреции цитокинов мононуклеарами и нейтрофилами периферической крови ожоговых больных на 3−6 и 10−17 сутки после травмы в зависимости от тяжести (сепсис/осложненный сепсис) и исхода (выжил/не выжил) ожоговой болезни, с помощью нелинейного анализа главных компонент по алгоритму САТРСА.

4. По результатам оценки содержания цитокинов и sTREM-1 в сыворотке крови ожоговых больных выделить прогностические лабораторные маркеры риска развития осложненного сепсиса и его исхода.

Научная новизна.

Впервые показано, что в ранние сроки ожоговой болезни высокие уровни растворимой формы триггерного рецептора, экспрессированного на миелоидных клетках 1 типа (sTREM-1) в сыворотке крови пациентов с тяжелыми термическими поражениями ассоциируются со смешанным инфицированием ран, что может использоваться в предиктовой небактериологической лабораторной диагностике в качестве дополнительного критерия генерализации инфекционного процесса.

С помощью нелинейного анализа методом главных компонент нами впервые показано:

1. сетевое взаимодействие цитокинов, как базовая составляющая иммунобиологических процессов, может быть описано различными профилями, характерными для определенных состояний — цитокиновый гомеостаз/патобиологический процесс: в ранние сроки ожоговой болезни (после периода ожогового шока) — это комплексный гиперпродуктивный профиль системного цитокинового поля, важной составляющей которого является кластер провоспалительных цитокинов нейтрофилов периферической кровив период септикотоксемии — функциональная обособленность цитокиновых партнеров врожденного иммунитетамононуклеаров и нейтрофилов, друг от друга и от влияния на них системного цитокинового поля.

2. ранняя (до развития клинической картины сепсиса) поляризация секреции (высокая/низкая) некоторых цитокинов в условиях in vitro у двух важных эффекторов иммунного ответа — мононуклеаров и нейтрофилов периферической крови, по отношению друг к другу, ассоциирована с последующим развитием сепсиса и его исходом: у выживших — высокий уровень секреции мононуклеаров, низкий — нейтрофилов, у не выживших, в противовес, — высокий уровень секреции нейтрофилов и низкиймононуклеаров.

Определено, что предиктовыми биомаркерами летального исхода сепсиса при ожоговой болезни могут являться высокие уровни цитокинов в сыворотке крови пострадавших: IL-10 на 3−6 сутки и IL-6 на 10−17 сутки после ожога.

Впервые, на основании комплексного анализа иммунологических параметров пациентов с тяжелыми ожогами, разработана модель, позволяющая стратифицировать индивидуальный риск развития осложненного сепсиса на 10−17 сутки после травмы, до появления клинических симптомов сепсиса.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Полученные данные расширяют представление о пластичности функциональных свойств нейтрофилов и мононуклеаров периферической крови в условиях стресса. Показано, что уровень поляризации секреции основных цитокинов клетками больных с тяжелой термической травмой (оценка in vitro) на ранних стадиях ожоговой болезни ассоциирован с последующим развитием сепсиса (сепсис/осложненный сепсис) и его исходом (выжил/не выжил).

Определены лабораторные маркеры летального исхода ожоговой болезни на ранних сроках, до развития клинических признаков сепсисадостоверно высокие уровни цитокинов в сыворотке крови: IL-10 на 3−6 сутки после травмы и IL-6 на 10−17 сутки после травмы.

Установлено, что на ранних сроках развития ожоговой болезни уровень sTREM-1 в сыворотке крови ожоговых больных, может служить небактериологическим маркером смешанного инфицирования ожоговой раны.

Предложена математическая модель, определяющая комплекс показателей: цитокинов — 1Ь-6, ТЬ-1 (3, Ш1М-у, и бТИ-ЕМ-1 сыворотки крови ожоговых больных, которые могут быть использованы для определения индивидуального риска развития септических осложнений на 10−17 сутки после травмы.

Положения, выносимые на защиту.

1. Определен комплекс информативных иммунологических параметров, характеризующих развитие системного воспалительно-инфекционного процесса у больных с тяжелыми термическими травмами, и выделен ряд паттернов лабораторных показателей, которые могут использоваться на ранних сроках ожоговой болезни (до появления клинических симптомов сепсиса) в качестве маркеров прогноза течения (сепсис/осложненный сепсис) и исхода (выжил/не выжил).

2. Высокие уровни растворимой формы триггерного рецептора, экспрессированного на миелоидных клетках 1 типа (зТЯЕМ-1) в сыворотке крови пострадавших в ранний период ожоговой болезни ассоциированы со смешанным инфицированием ожоговых ран и могут применяться в качестве дополнительных предиктовых небактериологических показателей генерализации инфекционного процесса.

Внедрение результатов исследования.

Результаты работы используются в учебном процессе: при преподавании курса «Иммунный гомеостаз в норме и при патологии» в магистерской программе «Медико-биологические науки» на кафедре микробиологии биологического факультета ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный университет».

Апробация работы.

Основные положения работы доложены и обсуждены на XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009 г.) — Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология — практическому здравоохранению» (Москва, 2010 г.) — Областной научно-практической конференции «Инфекции кровяного русла» (Челябинск, 2010 г.) — VIII конференция иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010 г.) — Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии — междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010 г.) — XV Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (Самара, 2010 г.) — IX конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011 г.) — II Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» (Екатеринбург, 2011 г.) — Национальной конференции «Клиническая иммунология и аллергология — практическому здравоохранению» (Москва, 2012 г.).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, включает семь рисунков, девять таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав материалы и методы исследования, и результаты собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка литературы, включающего работы 45 отечественных и 97 иностранных авторов, и приложения, включающего 10 таблиц.

ВЫВОДЫ.

1. Предиктовым методом небактериологической диагностики смешанного инфицирования ожоговых ран на ранних сроках ожоговой болезни, до развития клинической картины сепсиса, является оценка уровня sTREM-1 в сыворотке крови: на 3−6 сутки после травмы — выше 298,8 пг/мл, на 10−17 сутки после ожога — выше 294,2 пг/мл.

2. Использование эксплораторного анализа данных методом нелинейных главных компонент позволило показать:

2.1. В ранний период ожоговой болезни (период после ожогового шока) гиперпродуктивный тип системного воспалительного поля может быть охарактеризован как «цитокиновый шторм» и поддерживается локальным цитокиновым полем нейтрофилов периферической крови (IFN-y IL-8, IL-IRa). В период септикотоксемии инициируется процесс обособления локальных цитокиновых полей мононуклеаров и нейтрофилов друг от друга и от системного цитокинового поля сыворотки, что, возможно, определяет в дальнейшем тяжесть ожоговой болезни (сепсис/осложненный сепсис) и ее исход (выжил/не выжил).

2.2. Отмечен полярный характер секреции цитокинов (высокий/низкий) между мононуклеарами и нейтрофилами периферической крови пострадавших в условиях in vitro в зависимости от исхода ожоговой болезни: на 10−17 сутки после травмы у не выживших наблюдался достоверно высокий уровень секреции цитокинов активированными нейтрофилами (IL-6, IL-ip, TNF-a) и низкий — активированными мононуклеарами (IL-6, IL-10), в противовес — у выживших — секреция цитокинов низкая у активированных нейтрофилов (IL-6, IL-1(3, TNF-a) и высокая у активированных мононуклеаров (IL-6, IL-10), при сравнении друг с другом.

3. Биомаркерами плохого прогноза ожоговой болезни — сепсис с синдромом полиорганной недостаточности, летальный исход, могут являться достоверно высокие уровни цитокинов в сыворотке крови: 1Ь- 10 на 3−6 сутки и 1Ь-6 на 10−17 сутки от термической травмы.

4. С помощью логистического регрессионного анализа разработана математическая модель, позволяющая на 10−17 сутки после травмы, до появления клинических симптомов сепсиса, на основе показателей уровней цитокинов: 1Ь-6, 1Ь-1(3, ШКГ-у, и бТЯЕМ- 1 в сыворотке крови ожоговых больных оценить индивидуальный риск развития септических осложнений.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

АФК — активные формы кислорода БТШ — белки теплового шока ГК — главная компонента.

ГМ-КСФ — гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор

ДК — дендритная клетка.

ИТП — индекс тяжести поражения.

КОЕ — колониеобразующая единица.

ЛПС — липополисахарид.

МПК — мононуклеары периферической крови.

МФС — миелоидно-фагоцитарная система.

НПК — нейтрофилы периферической крови.

ПКТ — прокальцитонин.

ПОН — полиорганная недостаточность.

СРБ — С-реактивный белок.

ССВО — синдром системного воспалительного ответа ФАТ — фактор активации тромбоцитов.

DAMPs (damage-associated molecular patterns) -повреждение-ассоциированные молекулярные образцы IFN-y (interferon) — интерферон гамма IL (interleukin) -интерлейкин.

IL-IRa (IL-1 receptor antagonist) — рецепторный антагонист IL-1 HMGB1 (high-mobility group protein Box 1) — негистоновый ядерный белок высокомобильной группы В1.

PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) — патоген-ассоциированные молекулярные образцы sTREM-1 (soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1) -растворимая форма триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках 1 типа.

TLR (Toll-like receptor) — Толл-подобный рецептор TNF-a (tumor necrosis factor alfa) — фактор некроза опухоли альфа TGF-p (transforming growth factor beta) — трансформирующий фактор роста бета.

Дестабилизация гомеостаза организма: нарушение саморегуляции, невозможность сохранять постоянство своего внутреннего состояния посредством скоординированных реакций, направленных на поддержание динамического равновесия в организме.

Мониторинг: комплексная система наблюдений за состоянием пациента, оценки и прогноза изменений состояния человека под воздействием болезни.

Паттерн: комплекс взаимосвязанных показателей.

Предиктор: прогностический параметр, средство прогнозирования какого-либо процесса при отсутствии его клинических признаков.

Системный воспалительно-инфекционный процесс: системная воспалительная реакция с добавлением инфекционного процесса.

Тяжелая термическая травма: ожоговая травма с поражениями более 10−15% поверхности тела, сопровождающаяся развитием ожоговой болезни и неспецифического синдрома воспалительного ответа, которые часто приводят к синдрому полиорганной недостаточности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В настоящее время одним из приоритетных направлений современной медицины является ранняя диагностика и профилактика развития септических состояний в отделениях реанимации и интенсивной терапии [20, 31]. Несмотря на улучшения в понимании патогенеза сепсиса и его лечения, тяжелый сепсис и синдром полиорганной недостаточности остаются главными причинами смертности у ожоговых больных [23, 68].

Известно, что системный цитокиновый профиль больного способен стать одним из значимых факторов, определяющих персональный риск развития сепсиса, неблагоприятный исход и потенциал ответа хозяина на терапию. Системный цитокиновый профиль, в свою очередь, зависит от многих параметров, в том числе от вида инициатора, клеток-продуцентов и их микроокружения. Важными продуцентами цитокинов при классическом воспалении являются клетки миелоидно-фагоцитарной системы (прежде всего, нейтрофилы и макрофаги), которые при системном воспалении обнаруживают функциональную недостаточность [56, 94]. В то же время необходимо отметить, что, несмотря на огромное количество исследований, посвященных изучению этиологии, патогенеза и терапии сепсиса при ожоговой болезни, результаты работ, прежде всего, по ранней диагностике развития септических состояний, включая оценку дестабилизации цитокинового гомеостаза, часто носят дискуссионный характер и не оправдывают надежд [58, 68, 75]. До сих пор не ясно, является ли сверхактивация компонентов врожденной иммунной системы, сопровождающаяся «цитокиновым штормом», ответом на тяжелую микробную инфекцию или на выраженное поражение тканей (термическая травма) — почему одни пациенты умирают на ранних стадиях развития сепсиса, в период ССВО (3−10 день), а другие — на поздних стадиях, которые ассоциируются не только с противовоспалительным профилем цитокинов, но и с состоянием «иммунного паралича» нейтрофилов, в ассоциации со снижением их апоптоза и ответа на сигналы, регулирующие их поступление в ткани [9, 125]- до настоящего времени не обнаружен комплекс лабораторных показателей, который, уже на ранних сроках ожоговой болезни, имел бы высокую диагностическую значимость для прогноза развития и исхода сепсиса у больных с тяжелыми термическими травмами.

Поэтому, поиск иммунологических показателей, которые могут обладать клинической ценностью и исполнять роль ранних лабораторных маркеров развития сепсиса, его осложнений и исхода у ожоговых больных, а также мишеней для разработки новых подходов к лечению остается актуальной проблемой современной медицины.

Для выявления ранних маркеров прогноза течения ожоговой болезни (сепсис/осложненный сепсис) и ее исхода (выжил/не выжил), нами были определены некоторые иммунологические показатели (цитокиновый профиль сыворотки и цитокиновый потенциал лейкоцитов периферической крови) на определенных стадиях развития ожоговой болезни: на 3−6 сутки (период после ожогового шока) и на 10−17 сутки после травмы (период септикотоксемии), до появления клинических симптомов сепсиса. Выбор временных точек был основан на результатах исследования авторов [2, 23, 104] о наибольшем риске развития сепсиса у обожженных в период с 7 по 14 сутки после ожога (по типу септического шока), либо спустя месяц и более после поражения при длительном существовании инфицированных ожоговых ран.

Особенностью сепсиса ожоговых больных является базовый иммунный фон, формирующийся в ранний ожоговый период: выраженный ССВО без наличия инфекции, инициатором которого выступают БАМРз [43, 68, 109]. Степень выраженности ССВО, его бесконтрольность, поляризацияэкстенсивный системный провоспалительный ответ/ противовоспалительный цитокиновый профиль, способны привести к «цитокиновому шторму», гиперактивации клеток врожденного иммунного ответа, к активному выбросу вторичных медиаторов и (или) к выраженной иммуносупрессии (сепсис) [18, 111, 112, 126].

Поэтому, для выявления особенностей формирования системного воспалительно-инфекционного ответа у больных с тяжелыми ожогами, мы провели сравнительный анализ показателей лейкоцитарной формулы и уровней некоторых цитокинов и sTREM-1 в сыворотке крови доноров и пациентов с тяжелой термической травмой на 3−6 и 10−17 сутки после ожога. Обнаружено, что, у ожоговых больных уже на 3−6 сутки после травмы наблюдается ярко выраженный ССВО (характеризуется стойкими изменениями в распределении субпопуляций лейкоцитов и повышением уровня некоторых цитокинов в циркуляции: IL-6, TNF-a, IL-8, IL-1(3, IL-IRa, IFN-y, IL-18 и IL-10), который сохраняется к 10−17 суткам после травмы. Полученные нами данные согласуются с данными ряда авторов: Усов В. В. (2008), Greenhalgh D.G. (2007), Pileri (2008).

Проявления и выраженность ССВО при ожоговой травме во многом определяется характером раны: площадью поражения, глубиной поражения, и ее инфицированием [68, 83]. Образование на поверхности ожоговой раны некротической ткани — струпа, обеспечивает нишу, благоприятную для микробной колонизации и пролиферации и, в то же время, является источником токсических молекул, деструктирующих локальный иммунный ответ [68].

Поэтому мы проанализировали результаты бактериологического исследования: выраженность инфицирования и видовое разнообразие этиологически значимых микроорганизмов в ожоговой ране пациентов с тяжелыми термическими поражениями на 3−6 и 10−17 сутки после травмы. Было показано, что колонизация поверхности ран развивается уже с 1−2 суток после травмы. К 6 суткам диагноз «инфекция ожоговой раны» был поставлен 69% обследованным. Одновременное развитие в ране нескольких видов возбудителей было определено у 25% пациентов. На 10−17 сутки после травмы количество больных с инфицированием ожоговой раны не изменялось. Количество пациентов со смешанным инфицированием ожоговых ран увеличивалось до 43%. Основными возбудителями раневой инфекции являлись: S. aureus, Р. aeruginosa, Acinetobacter spp. На 10−17 сутки после травмы происходило расширение ассортимента микроорганизмов в ожоговой ране, за счет: Klebsiella pneumoniae и Enterococcus faecium. Смешанная инфекция была представлена, в основном, ассоциацией S. aureus и P. aeruginosa или S. aureus совместно с Acinetobacter spp., что согласуется с данными ряда авторов: Меньшиков Д. Д., 2009; Шлык И. В., 2009; Boekema B. K, 2012; Fu Y, 2012; Wysocki A.B., 2002.

Мы обратили внимание, что характерной особенностью микробного пейзажа ожоговой раны является раннее (4−6 сутки после ожога) образование микробных ассоциаций между разными видами возбудителей. По данным ряда авторов [5, 70] одновременное развитие в ране нескольких возбудителей приводит к возникновению сложных и неоднозначных взаимоотношений между ними, и оказывает существенное влияние на характер инфекционного процесса, резко утяжеляя его. Выявление потенциальных ранних маркеров смешанного микробного инфицирования ожоговой раны позволило бы своевременно назначать и корректировать антибиотикотерапию, тем самым снизить риск развития сепсиса и его осложнений у больных с тяжелой термической травмой. К сожалению, классический бактериологический метод диагностики генерализации инфекции часто является несостоятельным, прежде всего, из-за применения стартовой антибиотикотерапии и длительности времени, требующегося для проведения исследования. Поэтому, в настоящее время ведутся поиски небактериологических маркеров инфекционного процесса. Рядом авторов показано, что в качестве такого маркера могут выступать высокие уровни sTREM-1 в сыворотке крови [80, 88, 119]. Обнаружено, что в присутствии микробных продуктов происходит усиление транскрипции гена TREM-1 на нейтрофилах и моноцитах, что приводит к запуску синтеза провоспалительных цитокинов и освобождению в циркуляцию растворимой формы рецептора TREM-1 [87]. Однако, данные о том, является ли sTREM-1 показателем тяжести инфекционного процесса (смешанная инфекция) носят дискуссионный характер.

Поэтому, мы оценили изменение уровней цитокинов и sTREM-1 в сыворотке крови пациентов с тяжелой термической травмой в зависимости от монои смешанной инфекции ожоговой раны с целью выявления ранних маркеров смешанного микробного инфицирования. Нами показано, что уровень sTREM-1 в сыворотке крови больных со смешанным инфицированием ожоговой раны был достоверно повышен по сравнению с пациентами с моноинфекцией как на 3−6, так и на 10−17 сутки после травмы (341,0: 251,8 и 367,5: 239,7 соответственно). В уровнях цитокинов в сыворотке крови пациентов с монои смешанной инфекцией ожоговой раны статистически значимых различий не выявлено.

С помощью ROC-анализа мы оценили диагностическую значимость уровней sTREM-1 в сыворотке крови и определили конкретные значения этого показателя, которые могут быть использованы в качестве маркеров небактериологической диагностики смешенного микробного инфицирования. Установлено, что уровень sTREM-1 в сыворотке крови выше 298,8 пг/мл на 3−6 сутки и выше 294,2 пг/мл на 10−17 сутки после травмы может являться предиктовым небактериологическим маркером инфицирования раны двумя и более видами возбудителей. В 2007 г. Gibot S. было продемонстрировано, что высокие уровни TREM-1 зарегистрированы у мышей с летальным исходом при полимикробном сепсисе [89].

Работы по изучению иммунологических механизмов сепсиса, в том числе и у ожоговых больных, чаще всего сосредоточены на определении роли отдельных посредников, например, TNF-a, IL-6, IL-10, СРБ, ПКТ [55, 63, 82, 125] или таких процессов, как апоптоз и клеточная смерть при внутрибольничных инфекциях и ПОН после травмы [36, 94, 103] и не приносят ожидаемых результатов. Поэтому, мы решили не использовать редукционный подход при изучении исследуемых показателей, а провести комплексную оценку цитокиновой составляющей сыворотки крови и цитокинового ответа клеток МФС (прежде всего, моноцитов и нейтрофилов) на 3−6 и 10−17 сутки после ожога у больных с тяжелой термической травмой, как целостной многопараметрической системы, с использованием многомерных статистических техник: эксплораторного анализа данных методом главных компонент по алгоритму САТРСА и метода множественной логистической регрессии, с целью определения прогноза тяжести течения сепсиса и его исхода.

В свете поставленной задачи на первом этапе мы провели поиск взаимозависимых влияний показателей цитокинов сыворотки и клеток (МПК и НПК) друг на друга в условиях физиологического гомеостаза (доноры) и при патобиологическом процессе — тяжелая термическая травма. Обнаружено, что для физиологического цитокинового гомеостаза присущи следующие черты: 1) состояние партнерства МПК и НПК в создании локального цитокинового поля- 2) автономность локального и системного цитокиновых полей, а именно: отсутствие существенного влияния цитокиновой составляющей сыворотки крови (системное цитокиновое поле) на цитокиновый потенциал МПК и НПК и обратного влияния, т. е. цитокинов клеток (локальное цитокиновое поле) на цитокиновый профиль сыворотки.

Для патобиологического состояния — тяжелая термическая травма, характерно: 1) процесс обособления локальных цитокиновых полей МПК и НПК друг от друга- 2) партнерство клеток МФС и сыворотки в создании цитокиновых сетей — основы работы врожденного и адаптивного иммунных ответов, претерпевает значительные изменения в зависимости от стадии ожоговой болезни. Так, в ранний период ожоговой болезни (3−6 сутки от травмы, период после ожогового шока) гиперпродуктивный тип системного цитокинового поля поддерживается локальным цитокиновым полем НПК (И<�Ы-у, 1Ь-8, 1Ь-1Яа), что, возможно, отражает состояние — «цитокиновый шторм». Основанием для такого предположения могут служить результаты работ ряда исследователей [60, 106, 115], в которых показано, что цитокины 1Ь-8, 1Ь-1Яа и (именно показатели этих цитокинов участвуют в кооперации двух кластеров: НПК и сыворотка) запасаются в везикулах нейтрофилов и выделяются практически немедленно при действии различных агентов. Однако эти события, как считают авторы [56, 92], не происходят (или происходят в минимальной степени) в циркуляции при физиологических и, вероятно, при патобиологических условиях, но хорошо выражены при классическом воспалении. Возможно при ожогах, в условиях выраженного ССВО, нейтрофилы попадают под события «цитокинового шторма» и дают выброс цитокинов.

К 10−17 суткам — характер паттерна «сыворотка» кардинально меняется: снижается количество показателей цитокинов сыворотки, имеющих связи высокой силы, а сами показатели принадлежат только провоспалительным цитокинам, и полностью исчезают показатели цитокинов НПК, т. е. из комплексного он переходит в состояние автономности, что является, как можно предположить, «образом пограничного состояния».

На втором этапе комплексной оценки цитокинового ответа лейкоцитов периферической крови больных с тяжелой термической травмой, мы выявили профили цитокиновой активности, характерные для НПК и МПК на 3−6 и 10−17 сутки после травмы и соотнесли полученные результаты с данными ретроспективного наблюдения — развитием сепсиса, тяжестью течения (сепсис/осложненный сепсис) и его исходом (выжил/не выжил). Показано, что существует зависимость между тяжестью и исходом системного воспалительно-инфекционного процесса при ожоговой болезни и степенью активности МПК и НПК клеток в отношении секреции цитокинов на 10−17 сутки от травмы до развития полной клинической картины сепсиса.

Цитокиновый профиль МПК и НПК ожоговых больных на 10−17 сутки после травмы имеет полярный характер, а именно: у больных с летальным исходом (наступил на 25−40 сутки после травмы) наблюдется достоверно низкий уровень секреции цитокинов аМПК (1Ь-6, 1Ь-10) и достоверно высокий — аНПК (1Ь-6, 1Ь-1(3, ТЫБ-а) по сравнению с показателями выживших пациентов. Эти данные согласуются с данными ряда авторов [56, 64, 103], о том, что у ожоговых больных наблюдается снижение функциональной активности (в том числе цитокиновой) мононуклеаров на фоне чрезмерной активации нейтрофилов (прежде всего — усиление дегрануляции на фоне снижения фагоцитоза), которые приводят к развитию септических осложнений и летальному исходу.

Хотя нами установлены особенности цитокиносекреции МПК и НПК, в зависимости от тяжести течения и исхода сепсиса у ожоговых больных, данный метод не может считаться эффективным для определения ранних лабораторных маркеров, в связи с большой трудоемкостью. Наиболее информативным и легко доступным методом прогнозирования тяжести и исхода сепсиса при ожогах остается определение изменений уровня различных цитокинов в сыворотки крови. В этом направлении проведено огромное количество исследований, но они так и не принесли желаемых результатов [34, 85, 86, 96, 118, 125, 141], что, возможно, связано со сложностью иммунологических механизмов, лежащих в основе патогенеза сепсиса у ожоговых больных и невозможностью выявления одного конкретного агента для диагностики и лечения множества иммунологических осложнений после травмы. Поэтому, мы предприняли попытку выделить комплекс ранних прогностических лабораторных маркеров риска развития осложненного сепсиса и его исхода при ожоговой болезни на основе показателей цитокинов и бТЯЕМ- 1 в сыворотке крови с помощью методов математического моделирования (нелинейный анализ главных компонент, логистическая регрессия). Установлено, что биомаркерами летального исхода могут быть достоверно высокие уровни цитокинов: 1Ь-10 на 3−6 дни и 1Ь-6 на 10−17 сутки после тяжелой термической травмы. По данным литературы, уровни 1Ь-6 и 1Ь-10 в сыворотке крови выступают как наиболее частые предикторы тяжести течения и летального исхода при септических состояниях [57, 118, 141]. Однако полученные в исследованиях данные противоречивы и не выявляют конкретного значения показателя, которое может эффективно определить риск развития осложнений и летального исхода для каждого обследованного пациента. В свете сказанного, с помощью ЕЮС-анализа мы попытались определить конкретные значения концентрации 1Ь-10 и 1Ь-6 в сыворотке крови ожоговых больных, которые могли бы служить маркерами летального исхода. К сожалению, малые выборки в группах умерших, не позволили нам выявить данные показатели.

Тогда мы с помощью метода множественной логистической регрессии построили математическую модель оценки риска развития септических осложнений (развитие синдрома ПОН) у больных на 10−17 сутки после ожога, в основу которой были взяты показатели, полученные в результате анализа главных компонент. На основе трех показателей сыворотки крови (1Ь-6, 1Ь-1(3, ШЫ-у) и зТЯЕМ-1 была создана высоко диагностически эффективная математическая модель для определения риска развития осложнений при ожоговой болезни уже на 10−17 сутки после травмы. Диагностическая модель имеет вид:

Логит (Р)= -2,5915 +0,009Х! +0,078Х2 -0,321Х3 +0,004X4, где Хь Х2, Х3, Х4, — концентрация 1Ь-6, 1РЫ-у, 1Ь-1{3 и 8ТЯЕМ-1 в сыворотке крови конкретного больного.

Эта модель высоко статистически значима (р=0,0012), обладает высокой диагностической эффективностью (86,96%) и дает возможность уже на 10−17 сутки от ожога определить персонифицированный прогноз риска развития септических осложнений у больных с тяжелой термической травмой.

Полученные нами результаты свидетельствуют о перспективности проведения дальнейших исследований в данном направлении. Мы прекрасно осознаем всю меру условности оценки прогноза осложнений ожоговой болезни с привлечением математических моделей (особенно на небольшом размере исследуемой выборки). Мы лишь пытались показать важность поисков различных подходов, в том числе математических, применяемых к изучению дестабилизации иммунного гомеостаза при различных патобиологических процессах и значимость оценки изучаемых параметров как целостной системы при решении этих вопросов.