Лазерный флуориметрический детектор со сверхвысокой чувствительностью для приборов капиллярного электрофореза

Практическая потребность в аналитических средствах, использующихся в медицине, химии, биотехнологии и экологии, основанных на чувствительных и высокоэффективных методах анализа и контроля твёрдых и жидких сред вызвала интенсивное развитие комбинированных методов. В этих методах совмещены стадии предварительного концентрирования и разделения сложных смесей на компоненты, а также способы качественного и количественного определения искомых компонент. Среди этих методов разделения веществ важное значение занимает электрофорез, получивший всеобщее признание как наиболее удобный для исследования образцов, представляющих собой сложные многокомпонентные смеси неизвестного состава. Современные технические приемы, используемые в электрофорезе, в общем случае можно разделить на две большие части по принципу проведения процесса — это электрофорез на плоскости (классический) и капиллярный электрофорез. Быстрое развитие техники капиллярного электрофореза (КЭ) было обусловлено разработкой высококачественных кварцевых капилляров с равномерным внутренним диаметром 10−200 мкм, имеющих высокую прозрачность в УФ-области. В результате этого удалось улучшить как разделение многокомпонентных смесей, так и возможности детектирования отдельных компонент.

В последние годы КЭ наиболее успешно применяется при анализе ДНК, изучении наследственности, мутаций и в других генетических исследованиях. В силу того, что такие исследования обычно характеризуются малыми количествами пробы и низкими концентрациями исследуемого вещества, необходимо дальнейшее совершенствование эксплуатационных характеристик систем КЭ и повышение чувствительности детектирования.

Целью диссертационной работы является создание флуориметрического детектора с высокой чувствительностью, предназначенных для приборов капиллярного электрофореза, разработка и изготовление на основе этого детектора опытных образцов приборов и внедрение разработанных приборов в производство.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи: — Изучить влияние отражённого от капилляра отражённого излучения на чувствительность измерений;

— Разработать оптическую систему детектора, обеспечивающую прецизионную автоматическую юстировку излучения, возбуждающего флуоресценцию в центре капилляра и оптимизировать элементы детектора;

— Исследовать процесс фоторазложения красителей, используемых в приборах КЭ в качестве флуоресцентных меток, при их взаимодействии с лазерным излучением, с целью оптимизации условий измерений, обеспечивающих достижение наибольшей чувствительности;

— Разработать на основе полученных результатов приборы КЭ для лабораторных биохимических анализов с чувствительными флуориметрическими детекторами на базе лазерных источников возбуждения.

Научная новизна диссертации.

1. Разработана оригинальная схема флуоресцентного детектора для КЭ, обеспечивающая высокую чувствительность за счёт оптимизации условий освещения цилиндрического капилляра.

2. Предложена оригинальная схема автоматической фокусировки лазерного луча точно в центр капилляра с помощью многоэлементного фотоприёмника, основанная на совмещении пучков, отражённых от 4-х поверхностей капилляра.

3. Показано, что для достижения наибольшей чувствительности флуоресцентных измерений константа скорости поглощения света молекулой, используемой в качестве флуоресцентной метки, должна быть близкой по величине к константе скорости флуоресценции.

Практическая ценность.

В работе были получены следующие результаты, получившие внедрение в конкретные разработки приборов КЭ:

— предложена базовая оптическая схема флуориметрического детектора, отличающаяся низкой фоновой засветкой фотоприёмника и прецизионной автоматической юстировкой лазерного луча в центр капилляра;

— на основе проведённых в работы исследований предложена практическая методика по определению оптимальной интенсивности возбуждающего света для систем КЭ.

— разработаны системы капиллярного электрофореза с одноканальным и четырёхканальным флуоресцентными детекторами.

Внедрение результатов работы. Результаты диссертационной работы получены при выполнении:

— ОКР «Приборы капилярного электрофореза для наноаналитической химии», осуществлённой в рамках Государственного контракта № 73.122.11.53 с Министерством промышленности, науки и технологий от 15 декабря 1998 года;

— НИОКР «Приборы для определения числа и последовательности нуклеиновых кислот», осуществлённой в рамках Государственного контракта № 40.032.11.13 от 1 апреля 2002 года.

Разработанные в данной работе флуоресцентные детекторы для видимой и ближней ИК-области спектра применены в опытных образцах приборов КЭ. Выпущена партия анализаторов последовательности нуклеиновых кислот «Нанофор 03-С» с четырёхканальными флуориметрическими детекторами с в количестве 5 шт, которые используются в Институте молекулярной генетики РАН, в Ботаническом института им. В. J1. Комарова РАН, в ЗАО «Синтол».

Основные результаты, выносимые на защиту.

1. Показано, что условия освещения кварцевого капилляра и способ автоматической юстировки луча лазера в центр капилляра, предложенные в работе, позволяют достичь предельной чувствительности анализа в приборах КЭ, использующих флуоресцентные детекторы.

2. Показано, что выбор мощности источника возбуждения флуоресценции рекомендуемой для использования в приборах КЭ, полученный на основе проведенных в работе исследований, имеет благодаря минимизации уровня шума оптимальное значение, при котором обеспечивается наибольшая светоотдача флуоресцентных красителей, что обеспечивает повышение чувствительности анализа в тех случаях, когда молекулы имеют высокую электрофоретическую скорость.

3. Методика, позволяющая определять оптимальную мощность возбуждения флуоресцентной метки в капилляре применительно к анализу молекул в тех случаях, когда их электрофоретическая скорость низкая.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на семинарах лаборатории в Институте Аналитического Приборостроения РАН (С.-Петербург), а также были представлены на Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (Москва, 11−15 апреля 2000) — научной и учебно-методической конференции СПбГУ ИТМО (С.-Петербург 3−6 февраля 2004) — VI международной конференции «Прикладная оптика-2004» (С.-Петербург, 18−21 октября 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ и получен патент на изобретение.

Объём и структура диссертации.

Работа изложена на 103 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков, 4 таблиц и 69 библиографических ссылок на литературу.

Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, списка литературы и приложения. Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цель и задачи работы и перечислены защищаемые положения, отмечена научная новизна и практическая значимость. В первой главе приводится анализ тематической литературы, определяющей основные задачи настоящей работы. Во второй главе рассмотрены процессы распространения светового потока в капилляре. Показано преимущество оптической схемы, при которой возбуждающее излучение падает на каиилляр под углом Брюстера и дана сравнительная оценка достигаемой при этих условиях освещения чувствительности детектора. Предложена система автоматической юстировки возбуждающего излучения точно в центр капилляра. В третьей главе исследовано влияние мощности возбуждающего излучения на чувствительность флуоресцентного детектирования с учётом того факта, что наблюдается фотораспад красителей под действием возбуждающего света. Четвёртая глава посвящена разработке 4-х канального детектора КЭ, предназначенного для определения последовательности ДНК. В заключении подводятся итоги работы, формулируются основные выводы по результатам исследований и разработки прибора. Обсуждаются перспективы дальнейшего развития работы. Приводятся сведения о защищённости технических решений.

Основные результаты работы докладывались на:

1. Всероссийская конференция «Химический анализ веществ и материалов», Москва, 11−15 апреля 2000.

2. VI международная конференция «Прикладная оптика-2004», Санкт-Петербург, 18−21 октября 2004. и опубликовывались в следующих изданиях:

1. Б. Г. Беленький, А. А. Евстрапов, Р. А. Козулин. Влияние отражённого капилляром излучения лазера на чувствительность флуориметрического детектора капиллярного электрофореза // Научное приборостроение. 2001. T. l 1, N2. С. 21−25.

2. Б. Г. Беленький, Р. А. Козулин, В. Е. Курочкин. Детектирование индивидуальных молекул в жидкости. Анализ пробы с концентрацией не более 1×10−13 М. Высокоэффективный капиллярный электрофорез с одномолекулярным ЛИФ-детектированием //Научное приборостроение. 2001. T. l 1, N3. С. 47−57.

3. Б. Г. Беленький, Р. А. Козулин, В. Е. Курочкин, В. М. Золотарев. Приборы аналитического контроля на основе комбинированного метода капиллярного электрофореза и флуоресценции // Оптический журнал. 2002. Т. 69, N3. С. 69−77.

4. Б. Г. Беленький, А. А. Евстрапов, Р. А. Козулин, С. В. Коновалов, В. Е. Курочкин. Флуориметрический детектор. Патент RU 2 182 329, 2002.

5. Б. Г. Беленький, Р. А. Козулин, В. Е. Курочкин, В. М. Золотарев. Аналитический метод определения последовательности ДНК (секвенирование) по спектральным флуоресцентным меткам // Оптический журнал. 2003. Т. 70, N1. С. 65−68.

6. Р. А. Козулин, В. Е. Курочкин, В. М. Золотарев. Системы контроля ДНК на основе флуоресцентного метода // Оптический журнал. 2005. Т. 72, N1. С. 25−28.

ВЫВОДЫ И ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

В диссертационной работе изложены научно-обоснованные технические решения по созданию аппаратурного и методического обеспечения высокочувствительных лазерных флуориметрических детекторов для приборов КЭ.

Суммируя, можно выделить следующие результаты данной работы:

1. Продемонстрированы возможности лазерного флуоресцентного детектирования в ближней-ИК области спектра, характеризующейся низким уровнем фонового рассеяния. Разработан высокочувствительный флуоресцентный детектор КЭ для ближней-ИК области, позволяющий детектировать вещество в сверхмалых (десятки молекул) количествах. Разработанный детектор позволяет измерять кинетику фотораспада флуоресцентных красителей.

2. Исследовано поведение красителей при воздействии на них возбуждающего излучения большой мощности. Установлено, что флуоресценция и скорость фотодеструкции красителя начинают испытывать насыщение в силу того, что молекула не может поглощать кванты света со скоростью большей, чем скорость затухания флуоресценции.

3. Для детекторов КЭ с лазерным возбуждением, особенно в системах определения последовательности ДНК, характеризующихся продолжительным временем анализа, мощность возбуждающего излучения и длительность облучения пробы являются важными параметрами, непосредственно влияющими па чувствительность детектирования. Теоретически и экспериментально обоснована методика нахождения оптимальной мощности лазера, заключающаяся в определении скорости фотораспада красителя, что позволяет достичь максимальной чувствительности при данной скорости движения пробы в капилляре.

4. Разработан и выпускается опытными партиями первый отечественный автоматический анализатор последовательности нуклеиновых кислот «Нанофор 03-С» с высокочувствительным четырёхканальным флуориметрическим детектором.

Диссертационная работа выполнена в рамках НИОКР «Приборы для определения числа и последовательности нуклеиновых кислот», осуществлённой в рамках Государственного контракта № 40.032.11.13 от 1 апреля 2002 года.