Селекция и семеноводство картофеля на основе физиологических тестов и методов клеточной биотехнологии

Актуальность проблемы. Картофель является одним из основных продовольственных культур Таджикистана и его возделывание в экологически чистых горных и предгорных зонах республики имеет большие перспективы как для семеноводства культуры, так и получения высококачественной продукции. Последние годы в сельском хозяйстве страны уделялось недостаточное внимание развитию картофелеводства, что привело к резкому спаду урожайности и производства картофеля в целом. Одна из главных проблем в картофелеводстве Таджикистанаэто отсутствие высокопродуктивных, адаптированных к местным условиям сортов и четкой организации системы семеноводства картофеля.

Известно, что стабильное получение высоких урожаев картофеля, резкое увеличение его валовых сборов и значительное улучшение качества клубней в основном зависят от правильной организации агротехнических и семеноводческих мероприятий. Традиционная селекция картофеля, основанная на внутрии межвидовом скрещиваниям с последующим клоновым отбором, позволила получать ряд высокопродуктивных сортов с комплексом устойчивости к болезням и неблагоприятным факторам (Лорх, 1953; Вукасов, Камераз, 1954; Вудин, 1965; Альсмик, 1970; Росс, 1989; Коршунов, 1999). Однако она становится ограниченной и малоэффективной, потому, что многие сорта не цветут, треть не образуют ягод, у большинства семена стерильные и размножение их вызывает проблемы. С другой стороны, картофель характеризуется высокой гетерозиготностью генома (Н&югс1г1970; Будин, 1986). Поэтому для ускорения селекции картофеля следует наряду с традиционными технологиями использовать физиологические тесты и биотехнологические методы. Еще в 1930;е годы академик Н. И. Вавилов указывал на необходимость кооперирования работы селекционера с физиологами.

— 5 и биохимиками.

Селекцию можно считать одной из древнейших биотехнологий (Бу-тенко, 1983). Но, сегодня селекция вступает в новый этап программированного конструирования идеатипов растений по физиолого-генетическим чертежам. Современные генетико-селекционные технологии и методы биотехнологии позволяют получить любую рекомбинацию генома и создать формы с исключительно высоким потенциалом продуктивности (Насыров, 1986).

Одним из наглядных примеров достижений сельскохозяйственной биотехнологии растений является широкое использование метода культуры апикальных меристем в оздоровлении картофеля от вирусов и других патогенов, который способствовал развитию безвирусного растениеводства. Несмотря на большие достижения культуры апикальных меристем in vitro, существуют сомнения в цитологической и генетической стабильности меристемных растений. При оздоровлении семенного материала картофеля от вирусного инфекционного груза методом культуры апикальных меристем in vitro, крупномасштабном микроразмножении растений-регенерантов, изменчивость, индуцируемая условиями культивирования in vitro, крайне нежелательна. Поэтому актуальным считается изучение путей сохранения генетической стабильности морфо-физиологических и хозяйственно-ценных признаков мери-клонов картофеля.

Селекционная биотехнология основана на широком использовании клеточно-тканевых культур in vitro, важным моментом которого является каллусогенез. Поэтому представляет огромный научный интерес изучение особенностей каллусогенеза и регенерации различных генотипов картофеля в зависимости от типа выбранного экспланта, гормонального состава культуральной среды и времени года. Идентификация.

— 6 и отбор генотипов, обладающих высокой степенью каллусообразования, морфогенеза и регенерации in vitro, необходимые предпосылки получения сомаклональных вариантов с целью дальнейшего их использования в селекционных работах, проведения скрининга устойчивых и продуктивных линий и сортов картофеля на клеточном уровне.

Актуально изучение физиологических особенностей фотосинтетической деятельности и водного режима растений картофеля при переходе от миксотрофного к автотрофному режиму питания. Важно на основе изучения физиологии продуктивности оздоровленных и неоздоров-ленных растений картофеля обосновать необходимость организации семеноводства картофеля на безвирусной основе.

В силу специфичности селекции картофеля, как вегетативно размножаемой культуры, клоновый отбор является одним из важнейших приемов селекционных и семеноводческих программ. Исходя из этого, разработка физиологических тестов представляет важное значение при оценке и клоновом отборе высокопродуктивных генотипов.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является разработка физиологических тестов и принципов культуры тканей in Vitro для практической селекции и семеноводстве картофеля.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

— оценка исходных генотипов картофеля по их каллусообразующей способности, морфогенезу и регенерационному потенциалу in vitro;

— разработка системы организации семеноводства картофеля на безвирусной основе в Таджикистане;

— выявление условий сохранения стабильности и индукции вариабельности морфо-физиологических и хозяйственно-ценных признаков у сомаклонов картофеля;

— изучение физиологических характеристик фотосинтетической 7 деятельности и водного режима мериклонов при переходе от миксо-трофного к автотрофному режиму питания, выявление сортов, формирующих высокие урожаи миниклубней с целью их использования в первичном семеноводстве картофеля;

— изучение физиологии продуктивности оздоровленных и неоздо-ровленных растений картофеля с целью обоснования необходимости организации семеноводства на безвирусной основе;

— изучение новых для условий Таджикистана сортов картофеля, выявление высокопродуктивных генотипов для дальнейшего размножения и их использования как исходний материал в селекции;

— разработка физиологических тестов для клонового отбора высокопродуктивных генотипов и оценки селекционного материала картофеля в условиях in vitro и in vivo;

— определение степени толерантности различных генотипов картофеля к тепловому шоку in vitro и проведение клеточной селекции по принципу многоступенчатого скрининга.

Научная новизна. По результатам проведенных комплексных исследований показано сохранение генетической стабильности и индукции сомаклональной вариабельности морфо-физиологических признаков различных генотипов картофеля in vitro, что очень важно в биотехнологической селекции и семеноводстве картофеля. Установлены закономерный характер и сезонность каллусообразования и морфогенеза соматических клеток в зависимости от состава питательной среды и типа экспланта. Выявлены генотипы с активным каллусообразующим свойством и высоким морфогенным потенциалом, представляющие большой интерес для практической селекции.

Впервые изучены физиологические особенности роста, развития, фотосинтетической деятельности, водного режима, клубнеобразования.

— 8 и продуктивности мериклонов картофеля при их выращивании в полевых условиях. Показана стабильность сохранения закономерностей дневных и сезонных ритмов физиологических процессов у мериклонов картофеля.

В условиях Центрального Таджикистана проведены комплексные исследования по физиологии безвирусных сортов картофеля и показаны их отличительные особенности по сравнению с неоздоровленными. Исследования динамики фотосинтетической деятельности и водного режима позволили обосновать оптимальную возможность реализации потенциала продуктивности картофеля путем оздоровления семенного материала от вирусного инфекционного груза.

Впервые изучен ряд новых сортов картофеля в условиях Таджикистана. Предложены физиологические тесты для клонового отбора и оценки исходного селекционного материала картофеля.

Показана возможность отбора ценных образцов среда сомакло-нальных вариантов. Впервые использован принцип многоступенчатого скрининга для проведения селекции картофеля к экстремальным температурам in vitro.

Практическая ценность. Установленные сроки интенсивного кал-лусогенеза и выбор сортов с высоким морфогенным потенциалом позволяют повысить эффективность клеточной селекции на устойчивость и продуктивность, а сезонный характер приживаемости меристем — организацию работ по оздоровлению картофеля от вирусов, что очень важно для семеноводства культуры.

Выявлены сорта, формирующие высокие урожаи миниклубней. Они рекомендованы для широкого использования в первичном семеноводстве картофеля. Разработана конкретная схема организации семеноводства картофеля на безвирусной основе в горных зонах Таджикистана. По.

— у результатам физиологических исследований обоснована необходимость организации семеноводства картофеля на безвирусной основе для других регионов. Отобранные высокопродуктивные сорта картофеля (Би-нелла, Невский и Сантэ) могут быть успешно размножены в горных и предгорных зонах для развития безвирусного семеноводства картофеля.

Используя методы сельскохозяйственной биотехнологии и принцип многоступенчатого скрининга каллусных клеток получен ряд новых линий — сорто-клонов картофеля, отличающихся скороспелостью, высокой продуктивностью и устойчивостью к повышенной температуре воздуха.

Положения, выносимые на защиту. На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Для клеточной селекции картофеля важно индукция каллусоге-неза. Интенсивность каллусогенеза зависит от генотипа, но в большей степени от типа выбранного экспланта. Наибольшей каллусообразующей способностью обладают фрагменты апикальных и пазушных меристем.

2. Несмотря на то, что изолированные ткани культивируются в условиях in Vitro, у них сохраняются генетически детерминированные биологические особенности роста и развития растений. Установлено, что наиболее активное образование каллусов наблюдается летом и осенью, а усиление морфогенеза и регенерации растений в конце зимы — начале весны, когда в природе происходит пробуждение ростовых процессов.

3. Сельскохозяйственная биотехнология оздоровления семенного картофеля от вирусов и других патогенов основана на стабильном сохранении морфо-физиологических и хозяйственно-ценных признаков растений, полученных в пробирке. Это позволяет осуществлять испытание мериклонов ггри получении миниклубней и существенно сократить схему ведения первичного семеноводства.

4. Повышение урожайности оздоровленных растений картофеля тесно связано с улучшением фотосинтетической деятельности, рациональным распределением и запасанием ассимилятов, накоплением большого количества крахмала в клубнях.

5. Клоновый отбор и оценка селекционного материала картофеля по физиологическим тестам вполне реальны и перспективны. Показана принципиальная возможность использования этих физиологических тестов в практической селекции и семеноводстве картофеля.

6. Биотехнология вариабельности каллусных линий позволяет вести селекцию генотипов с лучшими хозяйственно-ценными признаками. По принципу многоступенчатого скрининга in vitro можно проводить селекцию растений на толерантность к экстремальным факторам среды. Этим методом нами созданы линии картофеля, устойчивые к неблагоприятным факторам.

— 200 -Выводы.

1. Изучение каллусогенеза и морфогенеза выявило связь культивируемых in vitro тканей с биологическими особенностями исходных сортов и с ритмами их роста и развития. Морфогенетический потенциал каллусов находится в прямой зависимости от биологии сорта: ранние и среднеранние сорта картофеля по сравнению со среднеи позднеспелыми обладают более активным морфогенезом и повышенной регенерационной способностью in vitro. Сезонный характер каллусо-образования и морфогенеза растений находится в тесной связи с особенностями онтогенеза: отмечается морфогенетичеекая активизация каллусной ткани в конце зимнего периода и ранней весной. Летом и осенью усиление каллусогенеза идет без признаков дифференциации.

2. Изучение инициации каллусообразования и морфогенеза выявило сорта картофеля с активным каллусогенезом и высоким морфогене-тическим попотенциалом. К ним относятся сорта Невский, Кемеровский, Сантэ, Бинелла и Кардинал, которые могут быть успешно использованы в клеточной селекции картофеля на устойчивость и продуктивность .

3. Изучение роста, развития, фотосинтетической деятельности ж водного режима мериклонов при их выращивании в полевых условиях показало генетическую стабильность морфо-физиологических характеристик сортов картофеля. Среди изученных образцов наиболее продуктивными по формированию миниклубней (16−19 шт/растение) оказались мериклоны сортов Невский, Сантэ и Бинелла. Это свидетельствует о перспективности широкого использования метода мультимеристем для оздоровления растений и получения первичного посадочного материала картофеля.

— 201.

4. Урожайность оздоровленных сортов картофеля (Бинелла, Невский, Сантэ) в условиях Гиссарской долины Таджикистана составляет в пересчете Ш 1 га 450−500 ц. Повышение урожайности оздоровленных растений картофеля связано с улучшением фотосинтетической деятельности, эффективным аккумулированием солнечной энергии, продуктивным использованием оросительной вода, рациональным распределением и запасанием ассимилятов, накоплением большого количества сухих веществ и крахмала в клубнях.

5. Использование физиологических тест-признаков в клоновом отборе и оценке исходного селекционного материала карофеля является вполне реальным и перспективным. Результаты исследования фотосинтетического аппарата растений картофеля по комплексу характеризующих его показателей (площадь листьев, УППЛ, ФП, ЧПФ, интенсивность фотосинтеза и т. п.), а также тесты in vitro и in vivo по регенерационной способности растений могут служить для прогнозирования селекционного процесса на скороспелость, устойчивость к заболеваниям и продуктивность.

6. На основе разработанных физиологических тест-признаков, использования вариабельности и широкой гетерозиготности соматических клеток и тканей картофеля удалось провести отбор генотипов с лучшими хозяйственно-ценными признаками и получить новые сорта-клоны. Нами в результате клеточной селекции получен перспективный сорто-клон R-58. Данный биотехнологический подход позволяет значительно сократить сроки создания перспективных сортов картофеля с заданными свойствами.

7. Применение метода стресс-скрининга из каллусных структур дало возможность получить устойчивые к высокой экстремальной температуре новые линии картофеля. Таким образом, показана эффектив.

— 202 ность клеточной селекции путем многоступенчатого отбора мериклонов и калликлонов в условиях in vitro и доказана необходимость включения нетрадиционных методов и технологий в селекционные программы.

Рекомендации для практики.

1. Для проведения клеточной селекции на устойчивость к экстремальным факторам и фитопатогенам рекомендуем использовать высокопродуктивные сорта Кемеровский, Сантэ, Невский, Винелла и Кардинал, которые характеризуются более активным каллусообразующим свойством и высоким морфогенетическим потенциалом.

2. Учитывая сезонный характер дифференциации и роста соматических клеток картофеля, эксперименты по клеточной селекции следует начинать в летний период, когда усиливается каллусообразующая способность, а зимой и ранней весной — индуцируются морфогенети-ческие процессы. Вычленение меристематической ткани следует проводить с декабря по апрель, когда они обладают наибольшей приживаемостью.

3. Семеноводство картофеля на безвирусной основе следует организовать прежде всего в горных и предгорных районах Таджикистана, как наиболее благоприятных с точки зрения экологических условий. При этом в первичном семеноводстве необходимо широко использовать суперэлитные миниклубни, полученные от оздоровленных растений методом культуры апикальных меристем in vitro.

4. Решением Ученого совета Таджикского аграрного университета предложен Госкомиссии по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур и охране сорта МСХ Республики Таджикистан перспективный сорто-клон картофеля «Шахристан» .

— 203.

Заключение

.

В решении насущных задач картофелеводства Таджикистана весомый вклад могут внести методы сельскохозяйственной биотехнологии и физиологические исследования культуры клеток и тканей. Наглядным примером служит опыт применения метода культуры апикальных меристем в оздоровлении семенного картофеля от вирусов и других патогенов. Перспективным является включение методов клеточной биотехнологии в селекции картофеля на устойчивость и продуктивность.

Проведенные комплексные биотехнологические исследования картофеля показали, что при культуре клеток и тканей in vitro можно изучить механизмы морфогенеза и регенерации растений. При культивировании клеток и селекции картофеля краеугольным камнем является получение регенерантов с константными признаками.

В клеточной селекции ответственным моментом является индукция каллусогенеза. В результате проведенных исследований выяснено, что интенсивность дедифференциации клеток, образование каллуса и его рост, а также морфогенез зависят от генотипа и особенностей выбранного экспланта. Наибольшая генотипическая зависимость интенсивности каллусообразования и морфогенеза была обнаружена в культуре меристематических клеток, как апикальных, так и пазушных, которые отличаются достаточно детерминированностью морфо-биологических признаков.

Экспериментальные исследования по изучению каллусообразования и морфогенеза показали, что зимой и ранней весной у них усиливаются морфогенные процессы, а летом и осенью — активизируется каллу согенез. Эта закономерность, на наш взгляд, связана с генетически детерминированностью ритмов роста и развития растений картофеля. Ее следует учитывать при планировании и проведении работ по.

— 195 оздоровлению и селекции картофеля методами биотехнологии.

Среди изученных генотипов картофеля наиболее высокая каллусо-образующая способность обнаружена у сортов Невский, Кемеровский, Сантэ, Бинелла и Кардинал, которые рекомендуются для широкого использования в клеточной селекции.

Изучение особенностей морфогенеза и активности регенерации различных генотипов картофеля показало, что каллусные клетки листьевого и стеблевого происхождения значительно отличаются от каллусов междоузлий по регенерации. У апикальных меристематических клеток скорость и степень формирования побегов значительно выше, чем у клеток междоузлий. Меристематические клетки легче выживают, обладают большой скоростью роста и тотипотентностью, поэтому они очень удобны при культивировании. Исходя из этого, можно прийти к выводу, что сохранение генетической стабильности морфологических показателей роста и развития растений-регенерантов достигается только при условии строгого соблюдения норм, правил и техники культивирования, особенно при оптимальном гормональном балансе питательной среды.

Дальнейшее выращивание меристемных растений-регенерантов в почвосмеси и изучение физиологических особенностей роста и развития, фотосинтетической деятельности, водного режима и продуктивности позволили доказать стабильность сохранения морфо-физиологических и хозяйственно-ценных признаков мериклонов сортов картофеля. Это позволяет широко использовать методы клеточной биотехнологии для оздоровления высокопродуктивных сортов картофеля от вирусов и других патогенов. Используя этот эффективный метод размножения мериклонов, за короткий срок можно получить большое количество оздоровленного посадочного материала. Как правило оздоров.

— 196 ленные миниклубни небольшие по размерам. Но это не означает, что обычно клубни мелких размеров можно назвать миниклубнями и использовать их в качестве посадочного материала. Под миниклубнями следует понимать только элитные клубни, полученные из пробирочных растений при выращивании их в почвосмеси.

Организация семеноводства картофеля на безвирусной основе позволяет ускорить производство супер-суперэлитного материала. При этом в первый год меристемные клоны — миниклубни, полученные путем выращивания пробирочных растений в тепличных комплексах, высаживают в поле, в питомниках отбора и проводят их испытание с применением метода клубневых единиц.

Нами в ходе проведенных исследований ежегодно было получено порядка 500−600 меристемных растений-регенерантов и около 3−4 тыс. миниклубней каждого сорта. Этот материал передавался в опорные пункты НИИ биотехнологии, расположенные в Шахристанском и Тавиль-даринском районах для дальнейшего размножения и передачи хозяйствам. Среди полученного материала не было случая явно выраженнного изменения морфологических признаков растений. Растения-регенеранты по форме листьев, структуре и окраске цветков и габитусу куста строго соответствовали своим сортовым характеристикам. Сформировавшиеся миниклубни имели идентичность по форме и цвету кожуры, глубине и расположению глазков. Эти признаки позволяют осуществить контроль за чистотой линии, определять нарушения и сомакло-нальные изменения цвета и строения клубня.

Исходя из результатов наших исследований, можно испытание мериклонов осуществлять при получении миниклубней из меристемных растений, что позволяет значительно упростить схему ведения первичного семеноводства. Для этого рекомендуется отобранные из полу.

— 197 ченных образцов миниклубни высаживать для получения супер-суперэлиты и сокращать сроки первичного семеноводства. Но для этого следует методами диагностики осуществить строгий контроль на возможность повторного заражения растений вирусной инфекцией.

Комплексные исследования по сравнительному изучению физиологии оздоровленных и неоздоровленных растений картофеля позволяют сделать заключение о перспективности и большой практической значимости семеноводства картофеля на безвирусной основе. Установлено, что различные заболевания нарушают ход протекания физиологических процессов и накопления урожая у неоздоровленных растений, поэтому они сильно отличаются по всем параметрам от оздоровленных. Результаты исследований воздействия вирусной инфекции на фотосинтетическую деятельность картофеля свидетельствуют об угнетении в течение вегетационного периода у больных растений интенсивности фотосинтеза. Причем глубокую депрессию ассимиляции СО^ вызывает смешанная инфекция вирусов К+З+М по сравнению с одиночной инфекцией этих патогенов. Оздоровление семенного материала картофеля от вирусной инфекции и других патогенов способствует нормальному протеканию морфогенетических и физиолого-биохимических процессов. Безвирусные растения обладают более интенсивными темпами роста и развития. Они отличаются более высоким ростом и увеличением числа стеблей. Известно, что эти два важные морфологические параметры имеют тесную корреляцию с урожайностью картофеля. Повышение урожая безвирусных клубней тесно связано с улучшением показателей фотосинтетической деятельности — оптимальным нарастанием ассимилирующей поверхности и продолжительным ее функционированием, повышением содержания хлорофилла и показателей УПП листьев, интенсивной фиксацией СО^, продуктивным аккумулированием солнечной энергии, рациональным распре.

— 198 делением и запасанием ассимилятов, накоплением большого количества сухих веществ и крахмала в клубнях. Здоровые растения картофеля более интенсивно и продуктивно используют оросительную влагу. В целом, оздоровление картофеля от вирусов и других патогенов способствует более полной реализации его генетического потенциала продуктивности и повышению урожайности клубней (до 500 ц/га) с высоким содержанием крахмала. Экологически чистые горные и предгорные районы, почвенно-климатические условия которых отвечают биологическим требованиям картофеля, благоприятствуют росту, развитию растений и формированию высоких урожаев клубней. Горные районы Таджикистана могут служить центром сохранения и размножения богатого генофонда семенного безвирусного картофеля.

В литературе существует мнение о том, что методы оздоровления картофеля от вирусной инфекции дорогостоящие и малорентабельны. Другие говорят о повторном заражении картофеля вирусными болезнями. Однако, мы считаем, что безвирусное семеноводство картофеля весьма перспективно для нашей республики. Для доказательства необходимости организации семеноводства картофеля на безвирусной основе, следует иметь в виду, что такие, как Y вирус картофеля и ВСЖ отдельно или совместно с вирусом, А могут уничтожить урожаю клубней картофеля на 99%.

Объективным критерием для клонового отбора безвирусных про дуктивных форм является морфологическая и физиологическая оценка генотипов. Урожайность картофеля можно увеличить, если селекционеры будут уделять больше внимания физиологическим параметрам исходных образцов. Результаты исследования фотосинтетической деятельности растений картофеля по комплексу характеризующих его показателей (площадь листьев, УПШГ, ФП, ЧПФ, интенсивность фотосинтеза и др.) могут служить для прогнозирования селекционного процесса на продуктивность. Важными критериями отбора являются тест на регене-рационную способность генотипов in vitro. Но при этом следует отбирать генотипы, стабильно сохраняющие этот признак in vivo, что считается особо ценным при селекции сортов картофеля, устойчивых к вредителям и болезням.

Попытка получения устойчивых к стрессовым условиям новых линий картофеля показала возможность проведения клеточной селекции с целью улучшения хозяйственно-ценных признаков высокопродуктивных сортов растений. Для закрепления признака устойчивости более эффективным приемом является многоступенчатый отбор in vitro. Однако, для повышения эффективности селекции различных сельскохозяйственных культур, в том числе и картофеля, следует применять современные методы генетической инженерии, с помощью которых можно получить растения, устойчивые к вирусам, гербицидам, вредителям и т. д.