Научно-методические основы оценки влияния возбудителей холеры, чумы и туляремии на адаптационно-компенсаторные реакции биомоделей

Актуальность проблемы. Инфекционные болезни, и в их числе особо опасные инфекции, занимают значительное место в структуре заболеваемости и смертности населения многих стран мира, включая Россию [Информ. сборник статистических и аналитических материалов. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации в 2003;2004 г. г., 2005; Оншценко Г. Г., 2006; ЕИКЗР, 2007].

Необходимость получения новых знаний о патои иммуногенезе инфекционного и вакцинного процессов, связанная с реальнойпотребностью создания современных, надежных средств профилактики и лечения особо опасных инфекционных болезней, обусловливает интерес исследователей к всестороннему рассмотрению проблемы взаимодействия микрой макроорганизма [Smith Н., 2000; Бухарин О. В. и др., 2002; Туйгунов М. М. и др., 2003; Железнйкова Г. Ф., 2006]:

Молекулярно-бйологический анализ возбудителей особо опасных инфекций значительно опережает исследования в области изучения различных сторон взаимодействия патогенных бактерий с макроорганизмом. Но данных о внутривидовом и генетическом разнообразии возбудителейхолеры, чумы, и туляремии [Farugue S.M., Nair G.B. et al., 2004; Zhou D., Han Y., Yang R., 2006; Смирнова Н. И., Кутырев B.B., 2006], являющихся основой для получения знаний о ключевых факторах их патогенности и вирулентности, недостаточно для адекватного решения вопросов, связанных с разработкой новых и совершенствованием уже имеющихся средств и методов эффективной борьбы с особо опасными инфекционными болезнями.

Инфекционный процесс, рассматриваемый как результат взаимодействия микрои макроорганизма, отражает состояние нарушенного баланса между уровнями экспрессии детерминант вирулентности первого и адекватностью функционирования защитных барьеров второго [Атауллаханов Р.И., Гинцбург A. JL, 2005; Portnoy D., 2005; Bradley С., Griffiths N., Rowe H. et al., 2005]. В этом аспекте определенный интерес представляют экспериментальные исследования особенностей взаимодействия организма биомоделей с возбудителем инфекции, основанные на выяснении роли молекулярных механизмов патогенности микроорганизма, приводящих к разбалансировке функционирования систем реагирования и контроля макроорганизма. / '.-'" Л' * ' ю7 ^ ' ' ' • '. ;

Решение этой задачи невозможно без расширения методической базы традиционного экспериментального исследования инфекционного и вакцинного процессов при работе с возбудителями особо опасных инфекционных болезней за счет внедрения мррфофункционального и морфометрического анализа адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма на патоген. Так, для объективного суждения о состоянии функциональных систем макроорганизма при моделировании экспериментального инфекционного процесса в количественной оценке нуждаются: выраженность воспалительных и иммунных реакций, интенсивность регенеративных и некротических процессов^ особенности и интенсивность гистохимических и иммуногистохимических характеристик клеток нейроэндокринной системы, элементов мукозального гомеостаза и ряд других параметров.

Эксперименты на лабораторных животных являются важным этапом при доклиническом испытании вккцин. При этом научные основы оценки качества вакцин, несмотря на большой фактический материал, накопленный в этой области, только начинают формироваться. В то же время имеющиеся вакцины против особо опасных инфекционных болезней не лишены недостатков [Медуницын Н.В., 2004; КаЫг Б., 2005], а поиск диагностических и прогностических критериев их безопасности является актуальной научной проблемой, требующей всестороннего изучения.

Важное место в перечне методов доклинической оценки вакцин занимает морфологическое исследование изменений, выявляемых с помощью целого ряда морфологических, гистоэнзимологических, иммуногистохимических приемов [Ширанович М.П., 1987; Назарова Л. С., 1995; Исупов И. В. и др., 2004], которое позволяет получать достаточно информативные данные обо всех структурных изменениях в клетках и тканях макроорганизма. Но в существующих нормативных документах [РД 42−28−8-89- РД 42−28−10−90- СП 3.3.2.561−96- МУ 3.3.1.1113−02- МУ 3.3.1.2075;06- МУ 3.3.1.2161−07] основное внимание при проведении морфологического исследования уделяется верификации тканевых изменений, что в определенной степени нивелирует их связь с функциональными расстройствами отдельных систем, участвующих в реализации защиты подопытных животных.

Оценка степени выраженности изменений в органах и тканях биомоделей при экспериментальном ващинном процессе, базирующаяся на применении тезиса оптимального морфофункционального соотношения" элементов системы для ее эффективной работы [Труфакин В.А., Шурлыгина A.B., 2002], подразумевает широкое использование методов морфометрического анализа. Но многие структурные и функциональные взаимосвязи в работе системы реагирования и контроля макроорганизма (нейроэндокринной, иммунной) при вакцинном процессе, обусловленном препаратами для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии, остаются мало изученными.

В связи с недостаточным изучением проблемы взаимодействия микрои макроорганизма in vivo, комплексное исследование влияния возбудителей Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Fransiceila tularensis с определенным набором детерминант вирулентности на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма особенно актуально для расширения представлений о патогенезе этих заболеваний. Разработка алгоритма проведения патоморфологического исследования экспериментального инфекционного и вакцинного процессов направлена на формирование научно-методической основы для информативной и объективной оценки качества вакцинных препаратов против холеры, чумы и туляремии на этапах их разработки и доклинического испытания.

Цель исследования. Совершенствование научно-методической основы оценки качества вакцинирующих препаратов против особо опасных инфекций, базирующейся на комплексном исследовании влияния возбудителей холеры, чумы и туляремии с различным набором детерминант вирулентности и иммуногенности на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма. Задачи исследования: ¡-.Осуществить подбор штаммов возбудителей V. cholerae, Y. pestis, F. tularensis с различной генетической характеристикой для воспроизведения экспериментального инфекционного процесса и изучить их влияние на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма, определяемые по ряду мор-фометрических параметров. 2. Разработать алгоритм патоморфологической оценки тяжести течения экспериментального инфекционного процесса при холере, чуме и туляремии. Определить возможность его применения при использовании аппаратно-программных компьютерных комплексов.

3. Предложить морфометрические критерии для отбора штаммов У. скоЫгае, используемых в качестве контрольных в морфологических и иммунологических исследованиях.

4. Выявить особенности влияния холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп на клетки АР1Ю-системы кишечника и другие элементы кишечного «барьера» биомоделей.

5. Охарактеризовать течение инфекционного процесса в организме биомоделей, используя природные штаммы чумного и туляремийного микробов с различной вирулентностью. Сопоставить данные морфологического и морфо-метрического анализа изменений во внутренних органах подопытных животных с генетическими особенностями этих штаммов.

6. Провести морфофункциональный и морфометрический анализ адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма при моделировании вакцинного процесса с использованием коммерческих вакцин и экспериментальных пре паратов.

7. Оценить реакцию «барьерных» структур (желудочно-кишечного тракта, лимфоидных органов, дыхательной системы) макроорганизма при введении живых коммерческих вакцин, атгенуированных и рекомбинантных штаммов возбудителей холеры, чумы и туляремии.

8. Изучить реакцию апудоцитов функционально значимых систем организма, клеток мукозального эпителия, образований эффекторной зоны иммунной системы желудочно-кишечного тракта и легких, лимфоидной системы при моделировании инфекционного процесса на фоне предварительной иммунизации биомоделей коммерческими и экспериментальными препаратами для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии.

Научная новизна и теоретическая значимость.

Впервые при изучении влияния на макроорганизм штаммов возбудителей V. ско1егае, У. реяШ и .Р. 1и1агет1 $ с различной генетической характеристикой разработан алгоритм проведения патоморфологических исследований экспериментального инфекционного и вакцинного процессов и определены морфометрические параметры, объективно характеризующие тяжесть течения патологического процесса у биомоделей. Впервые оценена реакция нейроэндокринных клеток.

НЭК) лимфоидных органов, лимфатических структур в легких и кишечнике при особо опасных инфекциях и вакцинации против них. Подобраны морфометриче-ские параметры для характеристики адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма при моделировании инфекционного процесса на фоне предварительной иммунизации против холеры, чумы и туляремии. Обоснована необходимость проведения комплексных исследований при оценке безвредности, реактогенности и иммунологической эффективности вакцин против холеры, чумы и туляремии и показаны возможности применения для этого аппаратно-программных компьютерных комплексов с целью получения стандартизированных объективных результатов. Усовершенствована научно-методическая основа оценки экспериментальных препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии.

Впервые показана возможность применения морфометрических характеристик состояния апудоцитов кишечника, клеток эффекторной зоны иммунной системы и слизеобразующих элементов мукозального эпителия желудочно-кишечного тракта для оценки качества противохолерных вакцин и степени выраженности холерного инфекционного процесса (патент на изобретение № 2 301 075 «Способ оценки качества вакцинных препаратов против холеры»). Впервые предложены морфометрические критерии для отбора штаммов холерного вибриона, используемых в качестве контрольных в морфологических и иммунологических исследованиях (патент на изобретение № 2 254 371 «Авирулентный тест-штамм бактерий Vibrio cholerae биовара eltor серовара Ogawa (ctxA~, tcpA', toxR', zof), используемый в иммунологических, генетических исследованиях и учебном процессе»).

Практическая ценность. Предложенный алгоритм патоморфологического исследования был применен при проведении Государственных доклинических испытаний рекомбинантного штамма V. cholerae eltor КМ184 — кандидата в живые противохолерные вакцины (Протокол № 5 от 15.01.2001 г.).

Результаты исследований использованы в следующих документах:

— Методические указания МУ 3.3.1.2075;06 «Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона», утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко и введенные в действие с 11.07.06 г. взамен методических указаний «Основные критерии оценки вакцинных. штаммов холерного вибриона», утвержденных Госкомсанэпиднадзором России от 17.10.1994 г. № 01 -19/48−11 ;

— Методические указания МУ 3.3.1.2161−07 «Основные требования к вакцинным штаммам. туляремийного микроба», утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации F.F. Онищенко и введенные в действие впервые с 01.04.07 г.;

— Методическое пособие «Моделирование холерной инфекции методом RITARD», одобренное Ученым советом (протокол № 1 от 01.02.02 г.) и утвержденное директором РосНИПЧИ «Микроб» (05.02.02 г:) — ,.

— Методические рекомендации «Оценка эффективности противохолерных вакцин по ряду морфофункциональных показателей адаптационно-приспособительной реакции: биомодели к холерной инфекции», одобренные Ученым советом (протокол № 5 от 11.05.06 г.) и утвержденные директором Pocl 1ИП-ЧИ"Микроб" (12.05.06 г.) —. ¦" «-.¦ ' '' / ¦ - - Методические рекомендации. «Тёжика и прядок забора гистологического материала. для морфометрических исследований от биомоделей, зараженных возбудителями I-II групп патогепности», одобренные Ученым советом (протокол № 3 от 17.06.08 г.) и утвержденные директором РосИИПЧИ «Микроб» (18.06.08 г.).

Научные и практически значимые результаты работы используются в лекционном курсе первичной специализации и усовершенствования врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб».

Опубликованные материалы исследования явились основой для написания монографий:

— «APUD-система кишечника животных при холерной инфекции, интоксикации и вакцинальном процессе».- Деп. ВИНИТИ, 2000;

— «Патоморфологические подходы к доклинической оценке холерных вакцин».- Деп. ВИНИТИ, 2002;

— «Патоморфологические аспекты доклинических испытаний вакцин против чумы, сибирской язвы и холеры».- Саратов: ЗАОПЦ «ИППОЛиТ-99», 2004.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.

Введение

штаммов возбудителей V. cholerae, Y. pestis, F. tularensis с различной генетической характеристикой вызывает в организме биомоделей изменение морфометрических показателей, степень выраженности которых находится в зависимости от полноты набора детерминант вирулентности микроорганизма.

2. Разработанные алгоритмы проведения комплексных исследований влияния возбудителей У. ско1егае, У. резШ, Р. Шагепв{8 на адаптационно-компенсаторные реакции у биомоделей при моделировании инфекционного и вакцинного процессов повышают информативность экспериментального патоморфо-логического исследования.

3. Предложенные морфометрические параметры позволяют отбирать штаммы У. ско1егае для использования в качестве контрольных при проведении морфологических и иммунологических исследований.

4. Применение разработанных коэффициентов и индексов для учета состояния трех групп клеточных элементов в слизистой оболочке кишечника объективизирует и стандартизирует оценку качества противохолерных вакцинных препаратов на доклиническом этапе исследований.

5. Морфометрические и морфофункциональные эквиваленты адаптационно-компенсаторных и иммунопатологических реакций у биомоделей характеризуют направленность процессов иммуногенеза при первичном и вторичном иммунных ответах.

6. Реакция апудоцитов функционально значимых органов биомоделей при инфекционном и вакцинном процессах отражает уровень вовлечения АР1Л> системы макроорганизма в процесс поддержания его гомеостаза.

7. В основе повышения объективности оценки безвредности, реактогенно-сти и иммунологической эффективности препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии на этапах их доклинического изучения лежит широкое применение возможностей базовых аппаратно-программных компьютерных комплексов для денситоморфометрической характеристики состояния клеток и тканей макроорганизма.

Апробация работы.

Исследования проведены в рамках плановых НИР РосНИПЧИ «Микроб» в период 1999 — 2008 г. г.: 025−99 «Изучение иммунобиологических свойств потенциально вакцинных рекомбинантных штаммов холерного вибриона, несущих гетеро-логические антигены» № госрегистрации 01.99.8 392- 006−3-01 «Разработка и усовершенствование унифицированных методов оценки безопасности вакцинирующих иммунобиологических препаратов против особо опасных инфекций» № шсрегистрации 01.200.11150I- 21−4г04.х<�Патоморфологические аспекты изучения нейроэндокринных механизмов в становлений противохолерного иммунитета" № госрегистрации 0120.504 666- 32−3-08 «Изучение взаимодействия возбудителей чумы, туляремии с организмом хозяина при. инфекционном и вакцинальном процессе». Исследованиё иммуногенных и протективных свойств препаратов «теней» клеток холерных вибрионов OI и 0139 серогрупп (VCG/01 с TCP и VCG/01 без TCPVCG/0139 с TCP и VCG/0139 без TCP) выполняли в рамках договора Рос-НИПЧИ «Микроб» с институтом микробиологаи и генетики, Универстйтета г. Вены, Австрия (1999;2000) — ФЦНТЦ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002;2006 годы: Блок I «Ориентированные фундаментшгьные исследования», раздел «Технологии живых систем», подраздел «Защитаотпатогёнов». .:.'• .'•' y" ''''.

Основные результата диссертационно .

•.: — Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в медицине», 13−14 апреля 2001 г., Саратов;

— Общероссийской конференции с международным участием «Проблемы морфологии», 14−16 мая 2002 г., г. Сочи;

— Vin Российской, научно-практической конференции по проблеме «Холера», 4−5 июня 2003 г., г. Ростов-на-Дону;

— XIX съезде физиологического общества им. И. П. Павлова, 19−24 сентября 2004 г., г. Екатеринбург;

— Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», 19−22 мая 2005 г., г. Суздаль;

— XXI Российской конференции по электронной микроскопии, 5−10 июня 2006 г., г. Черноголовка;

— VII Российском съезде врачей-инфекционистов «Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней», 25−27 октября 2006 г., город Нижний Новгород;

— VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в рамках Санкт-Петербургского саммита „Групп восьми“ и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств», 3−5 октября 2006 г., г. Оболенск;

— проблемной комиссии 50.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (50.00) 2000;2006 г. г.;

— IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26−27 апреля 2007 г., г. Москва;

— VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», 27−29 июня 2007 г., г. Москва;

— VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ», 25−26 сентября 2007 г., г. Саратов;

— на научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований» в институте «Микроб» 2000;2008 г. г.

Публикации результатов исследований Основные положения диссертации изложены в 46 печатных работах, опубликованных в период с 1999 г. по 2008 г., из них 15 статей в рекомендованных ВАК изданиях.

Структура работы.

Диссертация изложена на 337 листах машинописного текста, состоит из введения, 7-ми глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 201 отечественный и 182 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 89 таблицами и 47 рисунками.

выводы.

1. В-ответ на введение штаммов У. ско1егае, У. резНэ, Р. Ш1агепз1з с различной генетической характеристикой, рекомбинантных штаммов У. сНо1егае, экспериментальных и коммерческих препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии выявлены особенности изменения ряда морфометриче-ских параметров, характеризующих адаптационно-компенсаторные реакции у биомоделей, дополняющие имеющиеся представления о патои иммуногенезе указанных инфекций.

2.

Введение

штаммов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп с генотипом с? сА+ го? асе+ ?срА+приводит к развитию выраженных морфологических изменений в желудочно-кишечном тракте и внутренних органах биомоделей, вызывая функциональное напряжение клеток 1АР1Ш-системы кишечника с увеличением индекса активности апудоцитов по отношению"к контактному контролю в 24−14 раз соответственно. Изменения в тонком кишечнике биомоделей на введение культур холерных вибрионов штаммов с генотипом. сЬсА~ ^рА+ и ОхА1срА' носят однонаправленный характер, не имеют достоверных отличий между собой и свидетельствуют об умеренном напряжении морфофункционального состояния апудоцитов с увеличением их индекса активности в 3 раза. По предложенным морфометриче-ским параметрам отобран штамм У. ско1егае биовара еЫог, серовара О^алуа (с/хА~, гоЮхК), предлагаемый в качестве контрольного для морфологических и иммунологических исследований.

3. Установлены различия в течении экспериментальной холерной инфекции у биомоделей, зараженных холерными вибрионами 01 и 0139 серогрупп, касающиеся особенностей морфофункционального состояния клеток кишечника, выполняющих барьерные функции: межэпителиальных лимфоцитов, апудоцитов, бокаловидных клеток, клеток собственной пластинки слизистой оболочки кишечника. Изменение соотношения между различными клеточными популяциями, нарушение интенсивности обменных процессов в них отражают уровень повреждающего действия холерных вибрионов на функциональные системы макроорганизма.

4. При испытанииэффе1сгивности. эксперименггальны?си^коммерлеаких^про-тивохолерных вакцин и рекомбинантных штаммовУ. сНо1егае 01 и 0139 серогрупп обнаружены изменения числа и морфофункционального состояния апудоцитов кишечника, клеток эффекгорной зоны иммунной системы желудочно-кишечного тракта и нейроэндокринных клеток в лимфоидных органах, в том числе в лимфоидной ткани, ассоциированной с. кишечником биомоделей, в. зависимости от используемого препарата, способа и кратности его введениястепени выраженности иммунологической перестройки в органах иммунной системы на момент за-. ¦ ражения. ¦ ¦ >- .' • '• •¦':¦ ¦•.'-•• «'¦•,/¦¦» ¦'¦• '¦'¦¦¦¦••'. «'.

5. Разработан способ оценки качества вакцинных препаратов против холеры,. включающий морфологическое исследование гистологического материала от биопроб с использованием мор фометрической характеристики трех групп клеточных элементов в слизистой оболочке кишечника и математическую обработку количественных, показателей. Применение предложенных коэффициентов и индексов учета результатовспособствует объективизации и унификации оценки качества противохолерных вакцин. '. — .

6. При заражении беспородных белых мышей культурами Штаммов Y. pestis pFra+, pPst+, pCad-, Pgm+ иY. pestis pFra+, pPst+, pCacT, Pgmr выявлены, отличия в состоянии функционально значимых систем! макроорганизма по изменению мор-фометрических параметров, характеризующих размер? органа, число и, площадь его функционально. активных структур (фолликулов лимфоидных органов, почечных телец и сосудистых клубочков, легочных альвеол и капилляров), количество клеток разных видов, отвечающих на антигены возбудителя, в том числе апудоцитов, клеток ретикулоэндотелиальной системы, гепатоцитов.

7. Об эффективности защиты морских свинок, предварительно иммунизированных вакцинными штаммами Y. pestis EV линии НИИЭГ и F. tularensis 15 линии НИИЭГ, при введении вирулентных культур этих микроорганизмов свидетельствует отсутствие выраженных изменений морфометрических параметров, отражающих функциональное состояние печени, почек, аэрогематического барьера легких, клеток нейроэндокринной системы макроорганизма.

8.. Выявлен фазныйхарактер изменений количества и морфофункциональ-ного состояния нейроэндокринных клеток в лимфоидных органах и легких при подкожном и аэрогенном способах иммунизации биомоделей вакциной Y. pestis EV, отражающий направленность процессов иммуногенеза и выраженность стресс-реакции макроорганизма.

9. Для повышения объективности характеристики безвредности, реактоген-ности и иммунологической эффективности живых вакцин против чумы и туляремии с помощью экспертной системы предложен алгоритм оценки степени тяжести экспериментальной инфекции и адаптационно-компенсаторных реакций у биомоделей при моделировании вакцинного процесса, основанный на применении мор-фометрических показателей: ядерно-цитоплазматического индекса светлых гепато-цитов, деструктивного индекса, перфузионно-вентиляционного отношения, количества и морфофункционального состояния нейроэндокринных клеток (в лимфо-идных органах, легких, надпочечниках) и клеток ретикулоэндотелиальной системы, определяемых с использованием аппаратно-программных компьютерных комплексов. i.. «304 '.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Ежегодно в мире инфекционные болезни регистрируются более чем у двух миллиардов человек [WER- 2007;. ЕЩСЗР, 2007]. В. результате роста и развития экономической деятельности, открытия границ, миграции населения, увеличения объемов международных сообщений и торговли тенденция к глобализации инфекционных болезнейбудет сохраняться. Одним из стратегических, направлений в борьбе с инфекционными, в том числе и с особо опасными, болезнями является • совершенствование мер и средств их профилактики. Иммунопрофилактика" особо, опасных 6aKTepHajibHbix инфекций проводится в рамках Российского национального календаря? прививок по эпидемическим показаниям [Приказ. Минздрава России от 27.07.2001 № 229- Медуницын F I.В., 2004]. Но все имеющиеся на настоящий момент вакцины против холеры, чумы и туляремии, не лишены недостатков.

Совершенствование средств для специфической профилактикихолеры, чумы и туляремии связано с формированием адекватной системы их доклинической оценки. На решение этой задачи направлены исследования по раскрытию ранее неизвестных сторон, патогенеза особо опасных инфекционных болезней. Знание. каждого-этапа взаимодействия? микрои макроорганизма, основанное. на выяснении взаимосвязиконкретного морфологического описанияшатологического или адаптационно-компенсаторного процесса в макроорганизме, обусловленного особенностями защитных механизмов конкретной биомодели, с характеристикой факторов патогенности и их генетическим контролем у микроорганизма, позволит расширить. представления о сути инфекционного процесса.

Взаимоадаптация патогенаи хозяина определяет динамику развития взаимоотношений, й системе паразит-хозяин: и, соответственно, исход инфекционного процесса [Бухарин 0-В, 2000; Бухарин О .В. и др-, 2005]. Результатом таких взаимоотношений является выработка возбудителем активных молекул-лигандов, способных к узнаванию комплементарных структур (специфических рецепторов) макроорганизма, связьшанию с ними и последующему воздействию на различные мишени вего клетках и тканях с нарушением их функционирование. При этом свойства., бактерийопределяемые .в опытах im vitro, отличаются от свойств, проявляемых ими in vivo в: силу способности патогена адаптироваться к организму чувствительного хозяина [Smith Н, 2000]. Процессы адаптации затрагивают и макроорганизм. Огромная нагрузка ложится на системы реагирования, контроля и защиты макроорганизма — иммунную, нейроэндокринную, в том числе АР1Ю-систему. Разбалансировка в работе этих систем приводит к негативным последствиям, вызывая структурные изменения, порой несовместимые с жизнью.

В" этой связи приобретает все большую актуальность вопрос научно-методического обеспечение исследований, связанных с детальной характеристикой инфекционного и вакцинного процессов. Нами была поставлена цель — провести комплексное изучение влияния возбудителей холеры, чумы и туляремии с различным набором детерминант вирулентности и иммуногенности на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма, что считали необходимым для совершенствования научно-методической основы оценки качества вакцинирующих препаратов против этих инфекций.

Острые инфекционные диарейные заболевания различной этиологии остаются одной из главных проблем здравоохранения всего мира. Седьмая пандемия холеры поставила перед специалистами ряд серьезных задач, решение которых связано с интенсивным и широкоплановым изучением различных аспектовпатогенеза холерной инфекции и родственных ей диарейных заболеваний. Поэтому в первой части работы рассмотрены вопросы, касающиеся оценки влияния холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп с различным набором детерминант вирулентности на организм биомоделей, а также рекомбинантных штаммов холерного вибриона, разрабатываемых в качестве кандидатов в живые вакцины. Дан сравнительный анализ изменений у биомоделей, зараженных вирулентными холерными вибрионами на фоне предварительной иммунизации коммерческими и экспериментальными препаратами для специфической профилактики холеры. Это позволило сформулировать основные направления для совершенствования оценки качества противохолерных вакцин.

Сведения о выделении от больных с холероподобной симптоматикой с1хА~ штаммов холерного вибриона [Ратникова Л.И., Кузьмина Н. Я. 2002; Безсмертный В. Е., Иванова С. М., Титов Г. В. и др., 2003], позволяют считать, что у этого патогена есть целый ряд других, в том числе и еще неизвестных, факторов вирулентности, экспрессия которых обусловливает инфекционный процесс [Монахова Е.В. и др., 2005]. Но экспериментальные животные не являются полностью адекватной моделью для воспроизведения этой инфекции, поэтому и клинические проявления патологического процесса у них имеют свои особенности, в том числе обусловленные полнотой фенотипического проявления присутствующих в микроорганиз-, ме генетически детерминированных факторов: вирулентности.

Основным показателем проявления функционирования тех или иных генов холерного вибриона в макроорганизме являются нарушения, возникающие в, ответ на инокуляцию микроба, морфологическими эквивалентами которых можно считать развитие различных патологических или адаптационно-компенсаторньтх реакцийЖКТ биомоделей обеспечивает первую линию защиты от патогена, будучи местом: тесного, взаимодействия функциональных систем макр. оорганизма — пищеварительной, иммунной, АРТЛЗ. Последняя: объединяет клеткихарактерным признаком которых считается способность поглощать и накапливать предшественники полипептидных гормонов и биогенных аминов. Процессы синтеза и секреции пептидных гормонов, и биогенных аминов-апудоцитами лежат в основе взаимосвязанг ной деятельности различных органов и систем* организма [Райхлин Н.Т. и др., 1993]. Следует подчеркнуть, что клетки АР1Ю-системы, располагаясь пракгически во всех органах и продуцируяжизненно’важные гормоны и БАВвыступают в роли регуляторовгомеостаза, конечным полезным результатом: деятельности которых является, контроль за, течением метаболических и других процессов на определенном уровне.

Для= исследований были отобраны типичные по родовым и видовым свойствам штаммы У. сНо1егае 01 серогруппы, культуры которых при внутрикишечном введении крольчатам-сосункам приводили к развитию холерогенной (вирулентные), энтеропатогенной (слабо вирулентные) реакции или вообще не вызывали видимых изменений со стороныОККТ биомодели (авирулентные). Определив методом ПЦР в геноме отобранных штаммов наличие основных генов, связанных с вирулентностью (с/х и гср), и дополнительных. (гоГ и асе), провели морфометриче-ский анализ гистологических изменений, выявляемых у зараженных ими крольчат-сосунков, и сопоставили полученные: количественные параметры с особенностями генетической характеристики цггаммов’Кс/го/егае 01 серогруппы.

Для объективной оценки выраженности патологического воздействия холерных вибрионов, штаммов с различной генетической характеристикой (с?сА+№рА+ ctxA tcpA± ctxA’tcpA') определяли следующие параметры: количество и функциональное состояние апудоцитов, бокаловидных клеток, энтероцитов и МЭЛ в ЖКТ подопытных животных, а также реакцию клеток и тканейорганов, обеспечивающих детоксикацию организма (печень, почки).

Холерные вибрионы 01 серогруппы при внутрикишечном введении их биомоделям вызывали изменение морфофункционального состояния апудоцитов кишечника. Реакция клеток APUD-системы у подопытных животных находилась в зависимости, с одной стороны, от отдела кишечника, а с другой — от особенностей фенои генотипической характеристики штаммов холерного вибриона, используемых для заражения, и коррелировала со степенью выраженности морфологических изменений в ЖКТ и внутренних органах биомоделей. Для удобства оценки степени функциональной активности апудоцитов использовали разработанный нами индекс функциональной активности (Иап). Так, Иап в тонком кишечнике крольчат, зараженных холерными вибрионами, содержащими полный набор генов патогенности, в 24 раза превышал аналогичный показатель у интактных контрольных животных. При этом наибольшее изменение Иап было характерно для введения холерных вибрионов классического биовара вирулентного штамма V. cholerae 569 В.

Введение

холерных вибрионов штаммов, лишенных гена ctxA, также влияло на изменение Иап у крольчат, но в этом случае показатель не более чем в 3 раза превышал Иап у интактных контрольных животных.

Штаммы с полным набором основных генов, обусловливающих их вирулентность, вызывали у подопытных животных почти 3-х кратное превышение учитываемых морфометрических параметров в почках по сравнению с интакгными крольчатами, изменение в большей степени, чем в других группах, показателей функционального состояния печени. При этом внутри группы у животных, зараженных культурами этих штаммов, имел место определенный разброс величин определяемых показателей, позволяющий выделить среди отобранных культур штаммы, вызывающие максимально выраженные изменения у биомодели. Для ctxA" штаммов холерного вибриона характерным было отсутствие развития типичной холерогенной реакции в кишечнике биомодели, но наличие умеренных изменений учитываемых параметров преимущественно у животных, зараженных культурами штаммов V. cholerae, в геноме которых определялись гены zot и асе, кодирующие продукцию соответствующих токсинов. Наши результаты согласуются с данными Н. И. Смирновой (2007) о незначительном вкладе токсинов Zot и Асе в патогенез холеры.

Таким образом, по результатам морфометрического анализа был выявлен ряд особенностей в реакции функциональных систем макроорганизма на внутри-кишечное введение различных по набору детерминант вирулентности холерных вибрионов. На основании этого были отобраны морфометрические параметры, позволяющие с большей долей достоверности характеризовать морфофункциональ-ное состояние работы систем организма биомодели.

Несмотря на схожесть экспрессируемых факторов патогенности (подвижность, колонизирующая способность, токсические субстанции) у холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп, последние имеют целый ряд особенностей [Ерошенко Г. А., 2004]. Но основным фактором патогенности у вибрионов Ol39 серогруп-пы, вызывающим развитие диареи с тяжелой дегидратацией, также является холерный токсин (CT) [Карагозова A.B., Сальникова О. И., 2000]. Аналогичным образом, отобрав штаммы холерных вибрионов 0139 серогруппы, провели анализ морфо-функциональных изменений апудоцитов и клеток эффекторной зоны иммунной системы у подопытных животных, зараженных ими.

Общая направленность ответной реакции APUD-системы кишечника биомоделей на инокуляцию холерных вибрионов заключалась в дегрануляции клеток, то есть в высвобождении того или иного количества БАВ, принимающих непосредственное участие в патогенезе холерной инфекции. Для APUD-системы кишечника подопытных животных, зараженных холерными вибрионами 0139 серогруппы, характерным было снижение количества апудоцитов и увеличение их функционального напряжения. Так, Иап на введение ctxA+ штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы в 14 раз превышал аналогичный показатель у контрольных животных. Реакция клеток APUD-системы у крольчат, зараженных авирулентными холерными вибрионами штаммов, лишенных ctxA гена, сводилась к умеренному функциональному напряжению элементов системы, пропорциональному развивающимся адаптационно-компенсаторным процессам в органах.

Холерные вибрионы 0139 серогруппы штаммов с генотипом ctxA+ zot* асе tcpA+ приводили к быстрой гибели подопытных животных и развитию выраженных изменений во внутренних органах, близких к патологическим процессам, вызываемым вирулентными холерными вибрионами 01 серогруппы. Но в отличие от холерных вибрионов 01 серогруппы в кишечнике подопытных крольчат наблюдали проявления воспалительного характера с превалированием пролиферативно-инфильтративных процессов над явлениями отека и дистрофического поражения энтероцитов. Эти изменения в ЖКТ протекали на фоне выраженных токсических повреждений паренхиматозных органов. Не исключено, что развитие такого рода патологических реакций в макроорганизме на введение холерных вибрионов 0139 серогруппы обусловлено особенностями строения самого микроорганизма: наличием полисахаридной капсулы, нового соматического антигена 0139, некоторыми отличиями в строении ЛПС микроба [Waldor М.К. et al., 1994; Чеховская Г. В., 1996; Ерошенко Г. А., 2004].

Таким образом, возможность сравнения определяемых количественных параметров позволила выявить среди отобранных штаммов холерных вибрионов как культуры, вызывающие у биомоделей наиболее выраженные типичные для холерной инфекции патоморфологические изменения', так и штаммы, не приводящие к развитию таковых. На основании этого был предложен принцип выбора контрольных штаммов для выполнений экспериментальных исследований по поиску и отбору кандидатов в противохолерные вакцины. Внедрение морфометрического анализа, проводимого с применением новых компьютерных технологий, для такого рода исследований было направлено на повышение информативности и качества морфологических заключений.

Использование метода R1TARD для воспроизведения холеры у взрослых кроликов позволило провести мониторинг инфекционного процесса: наблюдать и оценивать у животных диарею по ее интенсивности и длительности, регистрировать выделение холерных вибрионов в окружающую среду и характеризовать их жизнеспособность. Степень выраженности клинической картины болезни у животных коррелировала с интенсивностью гистологических изменений в ряде функциональных систем макроорганизма и подтверждалась результатами морфометрического анализа, причем изменения учитываемых морфометрических параметров находились в зависимости от серогруппы холерных вибрионов, используемых для воспроизведения инфекции, и носили дозозависимый характер. Так, была отмечена прямая корреляционная связь между количеством апудоцитов тонкого кишечника и величиной отека подслизистой оболочки (г =0,8) у животных, зараженных холерными вибрионами 01 серогруппы.

Для полноценной характеристики выявленных гистологических изменений и оценки состояния эффекторной зоны иммунной системы ЖКТ у взрослых кроликов, зараженных вирулентными холерными вибрионами, исследовали клеточный состав СПС оболочки, состояние секреторного аппарата, МЭЛ и апудоцитов кишечника.

Было отмечено, что содержание клеток в СПС оболочки во всех отделах кишечника у животных, зараженных холерными вибрионами 01 серогруппы, было ниже, чем в контроле, что отражало величину выраженности у них отека слизистой и подслизистой оболочек. На введение же холерных вибрионов 0139 серогруппы регистрировали увеличение плотности клеточного инфильтрата в тонком кишечнике и снижение числа клеток в толстом кишечнике. Следовательно, ответная реакция макроорганизма на введение холерных вибрионов 0139 серогруппы характеризовалась преимущественно экссудативным характером изменений в толстом кишечнике на фоне воспалительной реакции в тонком кишечнике, что подтверждалось и присутствием в слизистой оболочке ПМЯЛ. Холерные вибрионы 0139 серогруппы вызывали более выраженную активацию МЭЛ в тонком кишечнике подопытных животных по сравнению с У. ско1егае 01 серогруппы и оказывали значительное влияние на изменение функционального состояния бокаловидных клеток. Так, у всех животных этой группы имела место тенденция к увеличению числа клеток, содержащих КМПС, в то время как число клеток с секретом, представленным НМПС, резко снижалось, что указывало на снижение защитной функции слизи. Общие закономерности в реакции апудоцитов кишечника на введение холерных вибрионов как 01 серогруппы, так и 0139 серогруппы сохранялись и заключались в уменьшении их количества во всех отделах кишечника на фоне их резкого опустошения и некоторого снижения синтетической активности. В целом реакция апудоцитов зависела от интенсивности развития диареи и тяжести течения заболевания у подопытных животных.

Таким образом, был сделан вывод, что основные направления по экспериментально-морфологическому исследованию патогенеза холеры на современном этапе должны базироваться на поиске морфологических эквивалентов — маркеров заболевания и состояний реактивности организма и быть связаны с оценкой клеточных систем защиты организма биомоделей — иммунной, нейроэндокринной и других.

Препараты для специфической профилактики холеры на основе живых холерных вибрионов, по мнению ряда исследователей, лучше убитых [Резников Ю. Б и др., 2000; Calain Р. et al., 2004; Viret J.F. et al., 2004]. Долгие годы разработка живых противохолерных вакцин признавалась перспективным направлением исследований. Но ключевым являлся вопрос учета возможных нежелательных реакций у биомоделей, связанных с введением холерных вибрионов рекомбинантных штаммов — кандидатов в вакцины.

Расширение арсенала методов морфологического исследования, применяемых для учета влияния рекомбинантных штаммов холерных вибрионов на организм биомоделей, за счет введения информативных и доступных к определению параметров адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма, позволило провести комплексную оценку: штамма Vibrio cholerae eltor КМ184, не имеющего гена, кодирующего синтез холерного токсина (СТ), и несущего гены, детерминирующие экспрессию иммуногенной В-субъединицы СТ и фактора колонизации CFAI E. coliштамма Vibrio cholerae OI 39 КМ182, содержащего рекомби-нантные плазмиды с протективными антигенами — В-субъединицей холерного токсина и адгезином CFAI.

В результате проведенных исследований по изучению рекомбинантных штаммов холерных вибрионов, разрабатываемых в качестве живых холерных вакцин, были получены новые знания о механизмах нейроэндокринной регуляции процессов иммуногенеза. С применением современного компьютерного комплекса для анализа фотоморфометрических параметров клеток в диагностике заболеваний МЕКОС-Ц с программным приложением «Денситоморфометрия» (МЕКОС-ДММ) впервые определены количественные показатели состояния нейроэндокринной системы кишечника и лимфоидных органов, в том числе и в лимфоидной ткани, ассоциированной с ЖКТ.

Динамика изменений морфофункционального состояния апудоцитов кишечника у взрослых кроликов, иммунизированных Vibrio cholerae eltor KM 184, заключались в последовательной смене фаз функциональной активности и покоя клеток. На первом этапе (первые 3-е суток) апудоциты реагировали на стресс, обусловленный способом и характером «обработки биомоделей. Затем, нафоне становления иммунологических реакций, максимальная функциональная активность апудоцитов. кишечника была отмечена. на 14-е сутки (на высоте иммунологической перестройки), но с. возвратом клеток к исходному состоянию физиологического функционального покоя после 21-х суток: Прослеживалась средней силы корреляционная’связь (как прямая, так и обратная) между количеством апудоцитов в кишечнике и иммунологическими показателями в крови подопытных животных. Наблюдали: обратную средней силы корреляционную связь (р = -0,5) между количеством НЭК в лимфоидных органах и уровнем агглютининов к V. с! ю1егае с1ю1егае и прямую средней силы связь (р = 0,5) между количеством НЭК и уровнем агглютининов к V. ско1егае еЫог. Прямая высокой силы корреляционная связь (р = 1) была. отмечена^между количеством-НЭК и титрами антитоксинов. Реакцию НЭК в мезентериальньтх лимфатических узлах и нарастание титров вибриоцидных антител характеризовала обратнаявысокой, силы корреляционная связь (р = -1). Четкая средней силы прямая корреляционная связь (р — 0,5) прослеживалась между количеством НЭК в надпочечниках и уровнем агглютининов. к: V. ско1егае ско1егае и вибриоцидных антител к V. скокгае еЫог.

Подтверждала иммунологические процессы, происходящие у иммунизированных биомоделей, отмеченная динамика активации пролиферирующих лимфоцитов (клеток в 8 и С+М фазах клеточного цикла) в пейеровых бляшках тонкого кишечника в период с 3-х по 14-е сутки, с возвратом к контрольным показателям на 21-е сутки.

Таким образом, в результате анализа динамики морфофункциональных изменений апудоцитов кишечника и лимфоидных органов взрослых кроликов в ответ на введение холерных вибрионов испытуемого рекомбинантного штамма и характера иммунологических реакций в эффекторном звене иммунной системы биомодели была обоснована возможность использования выбранных морфомет-рических показателей в качестве морфологических эквивалентовотражающих характер и направленность иммунологических реакций при противохолерном вакцинном процессе. v'. .281 •: ¦ .¦¦ ¦. ¦ • ;

В" организме крольчат-сосунков холерные вибрионы штамма. КМ184 при 10-кратном пассировании, не вызывая гибели подопытных животных и развития у них холерогенного синдрома, по результатам морфометрического анализа, приводили к некоторому функциональному напряжению апудоцитов кишечника. Так, на фоне относительного уменьшения? числа апудоцитов регистрировали ' более, чем трехкрат ное превышение Иап у иммунизированных крольчат по отношению' к контрольным животнымчто подтвервдало-выводы государственной комиссии по доклинической оценке штамма Vibrio choierae eltor КМ184 о необходимости. его дополнительных исследований в модельных опытах. Реакция, со стороны APUD-системы ¦ соответствовала, описанной1 нами ранее, при изучении влияния ctxA" tcpA+ штаммов холерного вибриона на макроорганизм.

Для оценки эффективности защиты предварительно иммунизированных, испытуемым штаммом биомоделей заражали вирулентными холернымивибрионами, а результаты оценивали по: разработаннойсхеме, включающей оценку: выживаемости подопытных животных к учетному сроку (5-е сутки) и (или) средней продолжительности жизни (вчасах) — клинико-патологоанатомических проявлений инфекционного процесса—гистологических, характеристик-изменений во внутренних органах- • количества и функционального состояния клеток желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и иммунокомпетентных органов биомодели (клеток нейроэндокрин-ной системы — апудоцитов, клеток эффекторной зоны иммунной системы ЖКТМЭЛ, се1феторного аппарата кишечника — бокаловидных клеток, НЭК лимфоид-ных органов) — процессов пролиферации и апоптоза клеток в крови и селезенке.

Регистрировали активацию МЭЛ и апудоцитов у животных, зараженных вирулентнымихолерными вибрионами на фоне предварительной иммунизации испытуемым штаммом. Не отмечали резкого изменения профиля секрета, образующегося в бокаловидных клетках кишечника: В противоположность этому у ин-тактных зараженных кроликов наблюдали уменьшение количества МЭЛ и резкое опустошение, апудоцитов кишечникапроисходящие на фоне снижения количества бокаловидных клеток и изменения их секреторного профиля за счет повышения числа клеток, содержащих КМПС.

Введение

вирулентных холерных вибрионов интактным кроликам: вызывало резкую активацию процессов пролиферации и апоптоза клеток крови и селезенки.

Аналогичное заражение предварительно иммунизированных испытуемым штаммом биомоделей протекало на фоне сохранения исходного уровня пролифератив-ной активности этих клеток, а., количество клеток в состоянии апоптоза не более чем двукратно1 превышало контрольные показатели. По результатам морфо-метрического анализа испытуемый, пггамм, введенный однократно в дозе 5×109 м.к. обладал достаточной: протективной активностью и защищал биомоделей от контрольного заражения 1×109 м.к. вирулентного штамма F. cholerae eltor Ogawa рз 1221 ;

Исследование, холерных вибрионов 0139 серогруппырекомбинантного штамма,)^ cholerae КМ182 проводили по. аналогичной схеме. Несмотря на отсутствие гибели/ и развития характерного патологического симптомокомплекса у иммунизированныхкрольчат-сосунков, при морфометрическом исследовании был выявлен определенныйсрыв < в. работе ряда функциональных систем биомоделей. Тем-не: менее, иммунизация культурами этого штамма взрослых кроликов защищала животных от последующего заражениявирулентнымихолерными-вибрионами.

Несмотря на общую схожесть и относительную доброкачественность, изменений, выявляемых после введения биомоделямрекомбинантных штаммовхолерных. вибрионов как 01, так 0139 серогрупп, которые по результатам ультрамикроскопического анализа можно отнести к компенсаторным реакциям макроорганизма, нельзя не отметить некоторые особенности, связанные с инокуляцией холерных вибрионов рекомбинантного штамма V. cholerae КМ182. Это касалось длительного обнаружения единичных микробных клеток на поверхности слизистой оболочки тонкого кишечника животных, принадлежность которых к холерным вибрионам была подтверждена при люминесцентной микроскопии-, выявленияв составе фагоцитированных включений в гистиоцитах микробных клеток, по морфологии идентичных холерным вибрионам. Факт длительного пребывания холерных вибрионов 0139 серовара (14-е сутки после инокуляции) в слое кишечной слизи у подопытных животных, возможно, объясняет инфильтрацию слизистой и СПС оболочки кишечника значительным количеством эозинофильных гранулоцитов в стадии, активного синтеза. Длительное: пребывание бактерий и последующая их гибель в кишечнике привитых животных — это основная причина риска развития эндоток-сикоза [Holmgren J., Svennerholm А,-М., 1990; Левкович A.A. и др., 1994]. Не исключено, что с этим связано умеренное мембраноповреждающее действие реком-бинантного штамма холерных вибрионов 0139 серогруппы. Накопление иммунных лимфоцитрв, активация больших гранулярных лимфоцитов в пейеровых бляшках у этих животных может свидетельствовать о начале формирования реакций гиперчувствительности замедленного типа при использовании двукратной схемы иммунизации. Преобладание среди клеток СПС оболочки кишечника этих кроликов лимфоцитов по отношению-к зрелым плазматическим клеткам наводит на мысль о несколько ином механизме формирования иммунного ответа при использовании рекомбинантных холерных вибрионов 0139 серогруппы или его временной отсрочке.

По результатам ультраструктурного анализа у кроликов, иммунизированных рекомбинантными штаммами холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, в клетках, несмотря" на усиление активности функциональных систем, сохранялось равновесие между процессами синтеза и распада, что свидетельствует о доброкачественности происходящих в них изменений и, следовательно, об определенной клеточной адаптации’к.воздействию этими агентами.

Таким образом, применение ультрамикроскопического анализа изменений в клетках подопытных животных на этапах авторскогоизучения рекомбинантных штаммов холерных вибрионов, направленное на уточнение значимости тех или иных адаптационно-компенсаторных процессов, выявляемых при световой микроскопии, повышает информативность проводимых исследований.

Ключевым моментом в оценке качества любой вакцины является вопрос о возможности прогнозирования нежелательных последствий ее применения. В основе гомеостатических реакций при вакцинации, в том числе и противохолерной, лежат нейроэндокринные механизмы, которые координируют общую направленность процессов иммуногенеза [Кветной И.М., Ярилин A.A., 2005; Щуковская Т. Н., 2000, 2008]. Зная особую заинтересованность систем реагирования, контроля и защиты (иммуннойнейроэндокринной, пищеварительной и др.) в развитии холерной инфекции, в том числе и на фоне имеющейся специфической иммунологической активности, оценивая морфофункциональное состояние апудоцитов-и клеток эф-фекторной зоны иммунной системы ЖКТ, мы смогли охарактеризовать эффективность экспериментальных и коммерческих средств для специфической профилактики холеры.

От полноценной работы функционально активных клеток ЖКТ зависит t степень защиты организма биомодели от холерной инфекции. В системе мукозаль-ного гомеостаза особое место отведено эпителиоцитам, выступающим в роли реактивного барьера, являющегося мишенью для стимулов, исходящих как из просвета кишечника, так и из внутренней среды организма. Энтероциты, секретируя ци-токины, поддерживающие иммуногомеостаз слизистой оболочки ЖКТ, выступают в роли эффектора, выполняющего медиаторные функции в реакциях воспаления и иммунитета [Kinoshita N. et al., 2002]. Не последнюю роль в нормальном функционировании местной иммунной системы ЖКТ играют клетки СПС оболочки (lamina propria) — лимфоциты, плазматические клетки, эозинофилы, тучные клетки, ней-трофилы [Ипатов Ю.П. и др., 1997; Хаитов Р. М^, Пинегин Б. В., 1997]. Особо следует отметить роль МЭЛ, представляющих большую гетерогенную популяцию лимфоцитов, расположенных в эпителиальном пласте, способных активно покидать эпителий и возвращаться назад в СПС оболочки кишечника, обладающих функцией естественных киллеров и регулирующих работу эпителия, тучных и ' плазматических клеток [Козырева Л.А. и др., 1993; Ипатов Ю. П. и др., 1997].

В отличие от живых, убитые вакцины в больших дозах не вызывают грубых морфологических изменений во внутренних органах подопытных животных [Назарова Л.С. 1981; Исупов И. В. и др. 2004]. Наиболее выраженному воздействию, особенно при энтеральном поступлении препарата, подвергается именно стенка кишечника и местная лимфоидная ткань. Морфологически это может выражаться в качественном и (или) количественном изменении клеточного состава СПС оболочки. В то же время в действующих нормативных документах [МУ 3.3.1.2075;06] морфологические методы не являются ключевыми при оценке протективных свойств создаваемых противохолерных вакцин на этапах их доклинического изучения. Имеющиеся разрозненные сведения о морфологических изменениях, выявляемых при оценке реакций у биомоделей, инфицированных вирулентными холерными вибрионами на фоне предварительной иммунизации против холеры, отличаются разнообразием определяемых оценочных критериев и не позволяют адекватно сопоставлять полученные результаты.

Было проведено исследование особенностей течения инфекционного процесса у биомоделей, предварительно иммунизированных коммерческими (холерной химической бивалентной таблетированной вакциной производства РосНИПЧИ «Микроб», коммерческой вакциной Cholera-Impstoff) и экспериментальными препаратами (препараты «теней» V. cholerae 01 и0139 с токсинкорегулируемыми пи-лями адгезии (VCG-TCP) и без них, полученные путем контролируемой экспрессии гена Е фага PcpiXl74, кодирующего синтез мембранного протеина Е).

Оценку протективных свойств коммерческой холерной вакцины производства РосНИПЧИ «Микроб» проводили с использованием 2-х биомоделей: половозрелых лабораторных мышей (модель — «запечатанные мыши») [Richardson S.H., et al., 1984] и взрослых кроликов (RITARD) [Spira W.M. et al., 1981] по представленной ранее схеме.

Независимо от используемой" биомодели (лабораторные мыши или взрослые кролики) общие тенденции в реакции этих клеток отличались от той, что развивается при инфекционном процессе в интактном организме. У предварительно иммунизированных животных вирулентные холерные вибрионы, вызывали умеренное функциональное напряжение апудоцитов, кишечника-в виде незначительного увеличения их количества и относительного опустошения клеток.

Анализ морфометрических показателей, характеризующих изменения у зараженных на фоне предварительной иммунизации кроликов, выявил определенную зависимость между количеством НЭК в лимфоидных органах биомоделей и степенью их иммунологической перестройки. В частности, имела место средней силы прямая корреляционная связь (г = 0,4) между количеством АГ клеток и величиной гиперплазии фолликулов в мезентериальных лимфатических узлах животных. Описанные изменения количества и морфофункционального состояния апу-доцитов в этих органах отчасти отражали регуляторные свойства синтезируемых ими гормонов (серотонин, гистамин). Под действием этих медиаторов в селезенке и других лимфоидных органах происходит активное антителообразование [Цепе-лев В Л. и др., 2003]. Мобилизация нейроэндокринного окружения иммунокомпе-тентных органов, привитых животных, заключающаяся в достоверном (р < 0,05) увеличении числа апудоцитов по отношению к контролю, свидетельствовала об усилении синтеза ими БАВ и характеризовала стадию ограничения интенсивности иммунопатологических реакций при введении вирулентных холерных вибрионов, что укладывалось в общую закономерность изменений апудоцитов при вторичном иммунном ответе [ Райхлин Н. Т. и др., 1993; Щуковская Т. Н., 2000].

Известно, что избыточное поступление продукта секреции НЭК — серотонина — подавляет иммунологические реакции в организме подопытных кроликов [Смо-лягин А.И. и др., 1990]. Истощение продукции серотонина НЭК в остром периоде ' инфекции в дальнейшем приводит к сенсибилизации макроорганизма, и не исключено, что в комплексе причин развития патологического статуса биомодели лежит именно низкое число выявляемых серотонинпродуцирующих клеток. Другой продукт секреции НЭК — гистамин — сам по себе обладает способностью стимулировать иммунный ответ и путем активации фагоцитоза, и за счет прямого активирующего действия на лимфоциты [Вайсфельд И.Л., Кассиль Г. Н., 1981], но он может выступать и своеобразным ограничителем иммунологической перестройки опосредованно, активируя выброс серотонина [Кветной И.М. и др., 1983]. Аналогичные изменения были характерны и для развития инфекционного процесса в организме кроликов, предварительно иммунизированных коммерческой вакциной Chol era-Impstoff.

Таким образом, вирулентные холерные вибрионы в организме предварительно иммунизированных коммерческими препаратами биомоделей, вызывая развитие минимальных изменений со стороны внутренних органов, в ЖКТ сталкивались с функционирующим вследствие иммунизации «защитным барьером» из плазматических клеток, МЭЛ, активных зон в лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником, и клеток APUD-системы.

При испытании эффективности экспериментальных препаратов были выявлены определенные закономерности в изменении числа, морфофункционального состояния апудоцитов кишечника и НЭК в лимфоидных органах в зависимости от используемого препарата, способа и кратности его введения, степени выраженности иммунологической перестройки в органах иммунной системы на момент заражения, характера последующей обработки биомоделей. Впервые было показано, что оценка состояния апудоцитов кишечника в совокупности с другими морфомет-рическими показателями изменений ЖКТ является достаточно информативным критерием для характеристики инфекционного процесса у предварительно иммунизированных животных.

На основании этого была разработана система оценки показателей морфо-функционального состоянияклеток АРШЭ-системы организма подопытных животных при первичном и вторичном иммунном ответе. Проведено сравнение двух групп экспериментальных препаратов, полученных на основе холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, и показаны преимущества первых перед вторыми.

К применению был предложен способ оценки качества противохолерных вакцин, заключающийся в использовании минимального набора хорошо воспроизводимых гистологических и гистохимических методик в сочетании с морфометри-ческим анализом. Полученные количественные характеристики, отражающие характер и направленность адаптационно-компенсаторных реакций у биомоделей при вакцинации и при развитии инфекционного процесса на фоне предварительной иммунизации животных, было предложено представлять в виде ассоциаций показателей (коэффициентов, индексов), что значительно упрощало дальнейшую трактовку результатов по выявлению преимуществ тех или иных вакцинирующих препаратов. Предложенный способ оценки в целом повышал информативность и обеспечивал объективность доклинических исследований новых противохолерных препаратов.

Исследования во второй части работы касались количественной оценки изменений в организме биомоделей, обусловленных влиянием чумного и туляре-мийного микробов штаммов с различной генетической характеристикой, реакции функциональных систем экспериментальных животных, зараженных вирулентными культурами указанных возбудителей на фоне приобретенной резистентности к чуме и туляремии, возможностей комплексного исследования противочумного и противотуляремийного вакцинного процессов.

Одним из направлений научных исследований является поиск маркеров болезни до наступления ее клинических симптомов [СЬготу В.А. е! а1., 2005]. В этом аспекте характеристика реакций клеток АР1Ю-системы и ряда морфометри-ческих^показателей," 15предёШющйх «работу основных» «систем» жизнеобеспечения макроорганизма в экспериментальных исследованиях инфекционного и вакцинного процессов при чуме и туляремии, направлена на выяснение роли и значения дополнительных морфологических маркеров для оценки степени тяжести течения патологического процесса или уровня формирования адаптационно-компенсаторных изменений в организме биомоделей.

В связи с циркуляцией в природе штаммов Yersinia pestis с атипичными свойствами, отличающими их от характерного для конкретного очага варианта возбудителя, был проведен анализ вызываемых ими изменений у биомоделей, основанный на сопоставлении ряда морфометрических параметров, характеризующих функцию ключевых систем жизнеобеспечения макроорганизма.

Для. сравнительного морфометрического исследования были взяты культуры штаммов Ypestis 231 (pFra+, pPst+, pCad+, Pgm+), Y pestis (pFra+, pPst+, pCad+, Pgm") -штаммов, выделенных в 2006 г. на территории Прикаспийского природного очага чумы и Ypestis ЕV (pFra+, pPst+, pCad+, Pgm") линии НИИЭГ. Для природных штаммов характерным было отсутствие в их геноме, по данным генетического анализа, hmsи уЫ-локуса. Отсутствие гибели мышей, зараженных этими штаммами, укладывалось в общую картину течения инфекции у данной биомодели. До последнего времени продукты хромосомного локуса, обозначаемого HPI (high-pathogenicity island) чумного микроба относили к числу «обязательных» факторов его патогенности [Кокушкин A.M., 1995; Кутырев В. В., 1992; Петровская В. Г., Бондаренко В. М., 1994], а потеря HPI приводила к значительному снижению вирулентности HPI" мутантов в отношении мышей [Анисимов А.П., 2002]. В то же время избирательная потеря способности к экспрессии только генов, локализованных в составе HPI и отвечающих за признак пигментсорбции, не приводит к снижению вирулентности Hms" - мутантов возбудителя чумы [Kutyrev V.V. et al., 1992; billard J.W. Jr. et al., 1999]. Заражение мышей культурами чумного микроба, штаммов Y. pestis (pFra+, pPst+, pCad+, Pgm") 770, 6205, 6215 в РЛУ вызывало изменение числа и активности фолликулов в срезе на фоне умеренной активации НЭК, в то время как в группе ОЛУ гиперпластические процессы в фолликулах были незначительными и не касались реактивного состояния НЭК. Относительная активация фолликулов в селезенке сопровождалась реакцией со стороны НЭК, носящей обратный характер по отношению к лимфатическим узлам. Также были отмечены" отклонения и ряда других морфометрических параметров, отражающих функциональное состояние систем жизнеобеспечения организма биомодели, но от ' - ¦. '' V 289 • «V-''» — •-•:" •¦' личающих эти штаммы по характеру, вызываемых ими изменений как от Y. pestis 231, так ж Y. pestis EV. Несмотря на отсутствие гибели. мышей при подкожном введении им культур Y. pestis 770, 6205, 6215, регистрируемые умеренные изменения морфометрических параметровсвидетельствовали о формировании адаптационно-компенсаторных реакций в организме бйомоделей. При одинаковом наборе известных факторов вирулентности, эти штаммы отличались между собой по степени вызываемых в макроорганизме изменений, при этом фенотипическая и гено-типическаясхожесть штаммов и штамма обусловливает интерес к дальнейшему углубленному их изучению: •. .• • Цо литературным данным, хотя НРГ содержит кластер генов, ассоциированных с «высокой летальностью» для мышей, в то же время на «острове» не выявлено ни одной детерхМинанты, напрямую связанной с патогенностьюГены, входящие в HEIкодируют продукцию иерсиниабактина, который хелатирует железо, связанное с белками эукариотических клеток, и транспортирует эти соединения в микробную клетку [Смирнова Н.И., Кутырев В. В., 2006]. Эти гены в большей мере отвечают за размножение патогенов в макроорганизме, чем за прямое повреждение эукариотических клеток [Анисимов А. П1, 2002]. В условиях нарушенной адаптациичумные микробы таких штаммов в организме теплокровного хозяина лишены возможности безудержного размножения, поэтому развитие определенных адаптационно-компенсаторных сдвигов в работе функциональных систем макроорганизма, по-видимому, обусловлено гибелью бактерий с высвобождением биологически активных токсических субстанций патогена.

В результате учета и сравнения ряда морфометрических характеристик для оценки направленности адаптационно-компенсаторных процессов в организме лабораторных мышей при изучении влияния различных культур чумного микроба среди определяемых морфометрических параметров были выбраны наиболее информативные, апробацию применения которых провели в последующих исследованиях на морских свинках.

Чумные микробы вирулентного штамма Y. pestis 231 при подкожном, введении морским свинкам вызывали в печени двукратноеувеличение ЯЦИ гепатоци-тов, в 4,5 раза повышение ДИ, резкие инволютивные процессы со стороны клеток РЭС на фоне формирования крупных инфильтратов из ПМЯЛ. В то же время у животных, обработанных Y. pestis вакцинного штамма EV, поддерживался определенный адаптационный потенциал функциональных структур.

Вакцинный штамм достоверно не изменял ПВО, а вирулентные культуры чумного микроба в легких влияли на ПВО, понижая этот показатель в 10 раз из-за развития гемодинамических нарушений и воспалительных изменений в органе.

На срыв адаптации у биомоделей, инфицированных Y. pestis 231, указывали: инверсия зон коркового вещества надпочечников и изменение Истресс более чем на 0,5 по отношению к показателю у интакгных животных.

Мерой резистентности организма биомодели является его способность к адаптации, в основе которой лежит активация его защитных сил, поэтому на следующем этапе были охарактеризованы адаптационно-компенсаторные реакции, развивающиеся у зараженных Y. pestis 231 в дозе 200 Del биомоделей на фоне предварительной противочумной вакцинации ЖЧВ в дозе 5×103 м.к.

Защитно-иммунологические реакции, проявляющиеся в специфическом ан-тителообразовании, следует рассматривать как комплекс биологических реакций гомеостатического порядка, протекающих в целостном организме и подчиняющихся основным общефизиологическим закономерностям, морфологическим маркером которых можно считатьформирование защитных адаптационно-компенсаторных реакций в организме биомодели.

У биомоделей, зараженных Y. pestis 231 на фоне предварительной иммунизации, регистрировали взаимосвязь между выраженностью количественных параметров, определяющих степень токсического повреждения функциональных структур макроорганизма, и уровнем иммунологических процессов в лимфоидных органах. Так, ключевые морфометрические параметры, отражающие функциональное состояние систем макроорганизма у этих животных в ответ на введение вирулент-ньту. Y. pestis 231, не выходили за допустимые пределы и были близки к показателям у интакгных контрольных животных. Это позволило считать обоснованным и эффективным применение отобранных морфометрических параметров для характеристики направленности адаптационно-компенсаторных процессов при моделировании инфекции у предварительно иммунизированных биомоделей.

Развитие инфекционного процесса при туляремии определяется способностью микроба к преодолению гуморального и клеточного барьеров неспецифической защиты макроорганизма [Цимбалистова М.В. и др, 1996]. Вирулентные и. авирулентные штаммы туляремийного микробаспособны распространяться в организме лабораторных животных и достигать специфических тканей — мишеней (печень и селезенка), наиболее благоприятных для их размножения. Но динамика этих процессов для культур разной степени вирулентности отлична. Вирулентные культуры.Р.Ыагепш 503/840 уже через 24 ч локализовались в печени и селезенке, а к моменту гистологического исследования (12 -е сутки) обнаруживались в крови подопытных морских свинок. Возбудитель вызывал гнойно-некротические изменения в коже места его введения, в РЛУ,. О ЛУ, в селезенке и формирование в этих органах, особенно в селезенке, эпителиоидноклеточных гранулем. Во внутренних органах имели место: изменение ЖЩ гепатоцитов и семикратное увеличение ДИ в печени, формирование преимущественно эпителиоидноклеточных гранулемпревышение ДИ дляэпителия извитых канальцев почек почти в 9 разснижение ПВО' в 13- раз. О срыве адаптации у биомоделей, инфицированных У7. НйагепаЬ 503/840, свидетельствовал Истресс.= 1,97 (интактный контроль Истресс: — 1,25). Гра-нулематозный характер воспаления в органах, присутствие в. очагах воспаления лимфоидных элементов и макрофагов указывали на формирование иммунного воспаления (ГЗТ), играющего важную роль в патогенезе туляремии;

• Таким образом, принципиальная схема патоморфологического исследования с морфометрическим анализом изменений, отработанная для изучения чумной инфекции, может быть применима и для оценки степени тяжести течения экспериментальной туляремийной инфекции.

Известно, что ЖТВ вызывает стойкую защиту лабораторных животных от последующей гибели при заражении вирулентным штаммом, туляремийного микроба, но при этом нет сведений о процессах, происходящих в органах и системах выживших животных.- Был проведен морфометрический анализ обнаруженных изменений у морских свинок, зараженных 5×103 м.к. вирулентного штамма Р. Ы-arensis 503/840 на фоне их предварительной иммунизации 2×108 м.к. вакцинного штамма Р. Шагеушь 15 НИИЭГ.

Припрактически, полном отсутствии на 30-е сутки после заражения видимых патоморфологических измененищ морфометрический-анализ выявил напряжение в работе функциональных систем макроорганизма в виде умеренной активации РЭС и элементов APUD-системы. Так, в легких 1ШО было в 4 раза ниже,.чем у животных из группы интактного контроля, а количество AT. клеток увелйчива- ' лось. Это вызвало интерес потому, что эндокринный аппарат органов, дыхания представлен как одиночными НЭК — апудоцитами, диффузно. расположенными средиКлеток бронхиального эпителия, так и групповьши скоплсния’ми (нейроэпи-телнальные тельца. -НЭТ). 1 продуцируемые ими. серотонин, бомбсзин, дофамин • .: способны воздействовать на гладкомыпючные элементы бронхиальной стенки, ре-: гулируя воздухораспрсдсление. В то же время подчеркивается особая роль клеток • альвеолярного эпителияне только в поддержании легочного гомеостаза, но и в. .. запуске механизмов врожденного иммунитета при контакте с патогеном [Johnson M. D: et al., 2002]. F. tularensis, взаимодействуя с клетками альвеолярного эпителия, индуцирует каскад реакций, связанных с продукцией/ секретируемых цитокинов, результатом чего является миграцияв очаг иммунокомпетентных клеток [GentryМ., Taormina J. et al., 2007]. 11ри этом изменение морфофункционального состояния НЭК в легких влечет за собой локальное нарушение газообмена и может осложнять течение патологическогоилиадаптивного процесса... — В надпочечниках, регистрировали умеренную активация НЭКна фоне гиперпластических процессов в лимфатических узлах имела место, активацияAT элементов при относительном покое: АГ клеток. В селезенке же, напротив, реагировали АР клетки, AT элементы оставались в покос.

Актуальность исследований в: области создания современных и надежных национальных средств и методовпрофилактики и лечения чумы и туляремии [Онищенко Г. Г., 2006] обусловливает необходимость адекватной и объективной оценки качества препаратов для специфической профилактики этих болезней.

Многолетними исследованиями Т. Н. Щуковской с соавторами [1978;2008] установлено большое значение рецепции иммунокомпетентными клетками нейро-медиаторов — гистамина, серотонина, аденозина — в реализации регуляторных механизмов, контролирующих направленность и интенсивность процессов иммуногенеза при холере, чуме, туляремии и других инфекциях.

Важнаяроль мобилизации иммунной системы и тесно связанной с ней пей-роэндокринной или APUD-системыпри вакцинном? процессе объясняет интерес к выяснению участия апудоцитов в иммуногенезе [Акмаев И.Г., 2001; Пальцев М. А. и др., 2003; Toni D.R., 2004].

Изучение реакции клеток APUD-системы ряда функционально значимых органов биомоделей на Y. pestis вакцинного штамма EV линии НИИЭГ и F. tularen-sis вакцинного штамма 15 линии НИИЭГ, расширяющее представления о механизмах нейроиммуноэндокринных взаимоотношений в макр’оорганизме, было направлено на совершенствование методов оценки безопасности и эффективности вакцин против чумы и туляремии.

В ответ на введение вакцинного штамма Y. pestis EV выявлены изменения реакции апудоцитов в лимфоидных органах, происходящие в соответствии с ролью регуляторных свойств синтезируемых этими клетками биологически активных веществ (БAB) и пептидов. Активность НЭК тимуса в период с 3-х по 7-е сутки, коррелирующая с процессами активации лимфоидных элементов в нем, согласуется с данными о роли этого органа как координатора молекулярных и клеточных нейроэндокринных взаимодействий [Manley N.R., 2000; Maroder М. et al., 2000]. Способность тимусных эпителиальных клеток (ТЭК) секретировать такие БАВ, как серотонин, мелатонин, гистамин и другие [Акмаев И.Г., 1997], и продуцировать сигнальные молекулы — цитокины, играющие важную роль в дифференцировке и пролиферации тимоцитов [Кветной И.М. и др., 2005], позволяет предположить участие НЭК не только в иммуномодулирующих процессах при противочумной вакцинации, но и в ограничении аллергизирующих и общетоксических реакций макроорганизма. Известно, что максимальная экспрессия мышиных рецепторов для интерлейкина-2 на Т-лимфоцитарном клоне [Wagher D.K., et al., 1986], подавляющем образование неспецифических Т-супрессоров, происходит на ранних стадиях иммуногенеза (к 3-м суткам). Вероятно и серотонин может снимать тормозное влияние интерлейкин-2 зависимого Т-клона клеток путем подавления пролиферации антигеннеспецифических супрессоров [Hellstand К., Hermodsson S., 1987]. В периферических органах иммунной системы первоначально регистрируемое снижение количества апудоцитов, направленное на стимуляцию иммунной реакции, в последующем сменяется увеличением их числа, способствуя ограничению интенсивности процесса. С увеличением дозы Y. pestis EV развивающиеся явления острого лимфаденита в РЛУ, по-видимому, сопровождались более ранней (до 3-их суток) активацией апудоцитов, в первую очередь — AT клеток, а к 7-м суткам активность этих элементов резко уменьшалась. К 14-м суткам, когда явления острого воспаления: стихали, число НЭК' начинало нарастать, что являлось отражением ре-гуляторного влияния, продуктовсекреции этих клеток на различные компоненты или фазы воспалительного процесса: Таким образом, активация АГ клеток оказывалавлияние на 'регуляторные механизмы ранней фазы иммуногенеза, «запуская» значительный клон антигеннеспецифических супрсссоров тимуса, что в конечном итоге и определяло количественную основу неспецифической регуляции иммунного ответа. Ранее было установлено, что максимальные изменения пула иммуно-компетенгных клеток с рецепторами для серотонина. и гистамина происходят в ранние сроки после противочумной вакцинации. Этот процесс предшествует развитию невосприимчивости лабораторных животных к: заражению вирулентным штаммом чумного микроба, а отмечаемая разнонаправленность колебаний показателей, как по амплитуде, так и по’вектору, носит дозозависимый и фазный характер [Щуковская Т.Н. и др., 1992].

Извест но, что подкожное введение ЖЧВ далеко йе всегда защищает о т аэрогенного заражения [Самойлова Л.В., 1968]:, ав свете новых данных: о ролимуко-. зальной системы иммунитета возрастает интерес к альтернативным схемам доставки антигенного материала на слизистые оболочки вакцинируемым: [Jones Т. et al., 2006; Alvarez M.L. et al., 2006; Elvin S.J. et al., 2006]. В то же время литературные данные [Белжеларская С.Н., Саттон Ф., 2003] о разнообразии продуктов секреции, расположения клеток, функциональной значимости апудоцитов в лимфоидных органах и в органах дыхания обусловили интерес к выяснению роли и участия элементов APUD-системы при аэрогенном способе введения ЖЧВ.

На фоне изменения ПВО у морских свинок при аэрогенной иммунизации Y. pestis EV регистрировали снижение числа апудоцитов в легких за счет их опустошения. В РЛУ и ОЛУ реакция НЭК находилась в четкой прямой зависимости от выраженности воспалительного компонента: отмечали снижение числа AT клеток вплоть до 21-х суток, а количество АГ элементов несколько превышало контрольные показатели в первые сутки: и на 14-е сутки, когда активизировались гиперпластические процессыК 45-м суткам количество НЭК в ОЛУ практически возвращалась к контрольным значениям. Морфометрические показатели активации гиперпластических процессов в селезенке подопытных животных коррелировали с умеренной активацией НЭК, начинающейся с 3-х суток, максимум которой со стороны АТ клеток приходился на 14-е сутки, а АГ — на 21-е сутки.: Выявленные изменения морфофункционального состояния.апудоцитов. в легких-й иммуноком-петентных органах свидетельствовали, о заинтересованности элементов АР.1Ю-системы при ингаляционном способе поступления антигенного материала: а динамикаих: носил афазный характер. •.

Вслед за характеристикой5 реакции макроорганизма на различные способы введения ЖЧВ* была предпринята попытка сравнения ревакцинирующего эффекта ЖЧВ и препарата ХЧВ. В результате проведенного морфометрического исследования были выявлены более выраженные проявления: вторичного иммунного, ответа к Г4-м:. суткам-наблюдения со стороны иммунекомпетентных органов! морских свинок, ревакцинированных препаратом ХЧВпо сравнению с. ЖЧВ. В РЛУ при ревакцинации ХЧВ гиперплазия лимфатических фолликулов выражалась в увеличении их площади в 2 раза по сравнению с йнтактным контролем: Отмечали в-: 1,3 раза чаще, чем у свинок, реващиниррванных ЖЧВ" - увеличение числа, лимфатических фолликулов со светлыми центрами, характеризующими-процессы активации этих структур. Чуть слабее была реакция со стороны ОЛУ, где гиперпластические процессы в виде увеличения ПКЗ и размеров фолликулов наблюдались с 14-х суток у животных, ревакцинированных как ЖЧВ, так и ХЧВ. Увеличение средней площади лимфатических фолликулов в селезенке животных, иммунизированных ХЧВ, было в 1,7 раза больше, чем после введения ЖЧВ и в 1,3 раза чаще среди них встречались фолликулы с активными светлыми центрами, а ширина Т-зон в органе была в 1,2 раза больше.

Выраженности иммунологической перестройки в лимфоидных органах подопытных животных, регистрируемойшо результатам морфометрического исследования к 14-м суткам после ревакцинации указанными препаратами, соответствовало максимальное накопление антител к Б! у морских свинок? иммунизированных ЖЧВ и ревакцинированных ХЧВ или ЖЧВ. При этом после ревакцинации ХЧВ этот показатель почти в 2 раза превышал аналогичный у свинок ревакцинирован-ных ЖЧВ: ,.

Известно, что уровень специфической перестройки у морских свинок, имму- ' визированных ЖЧВопределяется характером «нестерильной» фазы-иммунитета [Самойлова Л. В1964, 1984]. При повторном, спустя 6 месяцев, введении в организм ЖЧВпроисходит резкое сокращение сроков выделения живых клеток чумного микроба [Дальвадянц С.М., 1990; Овсянников-В-И, 1991]. Поэтому ревакцина-. ция препаратом ЖЧВне способствует быстрой и эффективной вторичной иммунологической перестройке организма биомодели. Повторное введение ЖЧВ в острый период (2-е. сутки) приводилок развитию умеренных альтеративных и. экссу-дативных изменений в тканях места введения.препарата. и РЛУ^разрешающихся к 21-м суткам без грубых некротических изменений и очагов расплавления тканей, вовлеченных в, воспалительный? процесс: В то же время введение препарата ХЧВ лишь в большой дозе (1000 мкг — приблизительно 10 ч/д) и только в. остром периоде вызывало развитие иммунного воспаления в тканях места введения препарата и у отдельных животных — в РЛУ. Однако развитие такого рода изменений, в острый иериод можно считать допустимым-с точки зрениябезвредности препаратов-[Исупов: — ИШи др, 2004;: МУ ЗЗЖ1ИЗ-02]- а эффективность применения ХЧВ-в качестве ревакцинируютцего препарата обоснованной: ¦ • Далее разрабатываемыйпринцип и схему оценки изменений в макроорганизме, обусловленных введением вакцинных штаммов чумного микроба, проверили на архивном материале (архив комиссионных: испытаний 1986;1987 г.), проведя сравнительное, изучение аттенуированного штамма У. резйз 1217 М с эталонным вакцинным, штаммом У. ревНв ЕУ линии НИИЭГ. Выбранный дляисследования штамм У. рехШ 1217 М по результатам комиссионных испытаний был отклонен от внедрения в качестве вакцинного, а нами был взят для проверки правильности выбора наиболее значимых параметров, характеризующих адаптационно-компенсаторные реакции у биомоделей.

Анализ выявляемых изменений проводили по стандартной схеме, предусмотренной действующим нормативным* документом [МУ 3.3.1.1113−02], параллельно выполняя морфометрическое исследование. обосновать.

При общемсходстве, в. направленности: иммунологических процессов в лимфатических узлах и селезенке подопытных животных, иммунизированных чумными микробами штаммаУ. реяШ 1217 М в сравнении с эталонным, регистриро ' ' ¦ • .•297. 1 '•.¦-'¦ - ' • - ' .¦¦ вали ряд особенностей вколичественной характеристике, описьшаемых. изменений.

Введение

УрезШ 1217 М в дозе 1×107 м.к. вызывало на фоне наблюдаемых явлений умеренного серозного, иногда серозно-гнойного процесса в лимфоидных органах. гиперплазию фолликулов в РЛУ и ОЛУ, регистрируемую, морфометриче-скими методами, без активации бластической реакции в них вплоть до 14-х суток. С увеличением иммунизирующей: дозы до 2×109 м.к. нарастал воспалительный. компонент при введении культур как эталонного штамма,. так и испытуемого, а разницамежду определяемыми: морфометрическими параметрами в группах нивелировалась. Адаптационно-компенсаторные реакции во внутренних органах характеризовали состояние функционального напряжения в работе систем жизнеобеспечения биомодели.

Введение

испытуемого штаммав дозе 100 м.к. и 1×107 м.к. вызывалов ранние сроки умеренную активацию клеток РОС в печени. С увеличениемиммунизирующей дозы до 2×109 м.к. наблюдали относительное, истощение РЭС. Эти изменения проходили на фонеусиления деструктивных процессов в: гепатоцитах с изменением ДИ, значение которого вплоть до 45-х сут ок наблюдения отличалось от аналогичного у интактного контроля и превышало показатели, определяемые в группе. животных, иммунизированных культурами-эталонно-. го штаммаАналогичная, закономерность, была установлена и для морфомётриче-ских параметров, характеризующих функциональное состояние почек. В легких инфильтративные процессы при введении культур испытуемого штамма в дозах.

7 9.

1x10 м.к. и 2×10 м.к. приводили к изменению ПВО, понижая этот показатель более чем в 8 раз по отношению к интактному контролю, без достижения контрольного значения к 45-м суткам. В тоже время на введение культур эталонного штамма достоверное изменение ПВО регистрировали лишь при иммунизации в дозе 2×109 м.к. и только в ранние сроки. Если стресс-реакцию организма на введение культур эталонного штамма У. реБйзЕУ в дозах 1×107 м.к. и 2×109 м.к. характери-. зовали незначительные отклонения Истресс. до 7-х суток, что согласуется с литературными! данными о стрессорном действии ЖЧВ, характеризуемом по изменению концентрации 11-оксикортикостероидов? вплазме крови подопытных животных [Анисимова Т.И. и др., 2005], то введение культур испытуемого штамма в аналогичных, дозах приводило к заметному изменению Истресс.> вызывало гиперплазию коркового вещества надпочечников на фоне резкой инверсии его слоев, причем учитываемые морфометрические параметры лишь по отдельным позициям к 45-м суткам возвращались к контрольным значениям.

Таким образом, по полученным данным пггамм У. резйз 1217 М чаще вызывал патологические изменения в органах и тканях подопытных животных, эти изменения по продолжительности были более длительными, а процесс формирования адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма не всегда укладывался во временной промежуток до 45-х суток наблюдения.

ЖТВ, обладая высокой иммуногенностью, является достаточно реактоген-ным препаратом, поэтому не ослабевает интерес к поиску совершенного препарата для специфической профилактики туляремии. Что касается нормативной базы по отбору штаммов-кандидатов в противотуляремийные вакцины, то к настоящему моменту впервые введены в действие Методические указания «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба» [МУ 3.3.1.2161−07]. Но в силу высокой остаточной реактогенности аттенуированных культур Е. ш1агет1з для биомоделей сохраняются определенные трудности с оценкой их безвредности. Границы традиционного патоморфологического исследования биомоделей при введении РЛиХагетш 15 НИИЭГ были расширены за счет введения характеристики реакций клеток нейроэндокринной (АР1ГО) системы функционально значимых органов и морфометрического анализа изменений, отражающих характер адаптационно-компенсаторных процессов в макроорганизме, обусловленных иммуногенезом.

Реакция НЭК в РЛУ заключалась в некоторой активации АТ клеток, особенно на введение вакцинного штамма в дозе 5×107 м.к., в то время как реакция АГ элементов практически не отличалась от аналогичных показателей у интактного контроля. В ОЛУ НЭК реагировали резкой активацией, как АТ, так и АГ клеток на введение культуры вакцинного штамма в дозе 5×109 м.к. и умеренной активацией АГ элементов на иммунизацию 5×107 м.к. Количество НЭК в селезенке достоп верно увеличивалось на введение культур вакцинного штамма в дозе 5×10 м.к.

По результатам морфометрического анализа были отмечены умеренные деструктивные изменения на введение вакцинного штамма, но без резких инволю-тивных процессов со стороны РЭС. Если на введение вирулентных культур регистрировали снижение ПВО в 13 раз по отношению к интактному контролю, то у иммунизированных животных этот показатель отличался лишь в 1,5−1,6 раза. Реакция апудоцитов в легких на 5-е сутки после иммунизации лишь при введении 5×109 м.к. культур вакцинного штамма заключалась в умеренной активации в них синтетических процессов. Меньшая доза вакцинного штамма способствовала умеренному опустошению клеток. АТ клетки АР1ГО-системы в надпочечниках претерпевали дегрануляцию, а в АГ элементах усиливались синтетические процессы.

На введение вакцинного штамма отмечено снижение числа НЭК кишечника морских свинок в 1,3−4 раза, в то время как на вирулентные туляремийные микробы кишечник биомодели реагировал увеличением количества клеток АР1ГО-системы в 1,5−2 раза по отношению к показателю у интакгных животных. Преимущественно реагировали аргентаффинные — ЕС-клетки, продуцирующие серо-тонин и мелатонин. Несмотря на различную направленность процессов активации апудоцитов кишечника у вакцинированных и зараженных биомоделей, Ист как в той, так-и в другой группах изменялся однотипно.

Изменения, возникающие в организме хозяина в результате воздействия бактериального агента, свидетельствуют об их адаптационно-приспособительном характере, направленном на срочную мобилизацию защитных механизмов макроорганизма [Пак С.Г. и др., 2008]. Поэтому ключевой задачей экспериментальных исследований особо опасных инфекций остается дальнейший поиск интегральных показателей оценки морфофункционального состояния регуляторных систем организма биомодели при моделировании конкретного инфекционного или вакцинного процессов.

В результате реализации возможностей комплексного морфометрического анализа полученных данных для характеристики чумного, туляремийного инфекционных процессов и оценки реакций макроорганизма на введение культур вакцинных штаммов этих микроорганизмов намечены перспективы создания экспертных систем (ЭС), направленных на решение проблем, связанных с отбором штаммов — кандидатов в живые вакцины, и задач экспериментальной морфологии.

Алгоритм оценки влияния испытуемых экспериментальных и коммерческих препаратов для специфической профилактики чумы и туляремии разрабатывали таким образом, чтобы количественно оценить: повреждающее действие вакцины остаточную вирулентность) и возможные побочные реакции макроорганизма на неестресс-реакцию макроорганизмароль клеток АРТЮ-системы как системы реагирования и контроля в реализации защитного потенциала макроорганизма при вакцинном процессеизменения морфометрических параметров, определяющих специфическую активность вакцины по анализу устойчивости функционально значимых систем организма биомодели к повреждающему действию конкретно- -го возбудителя.

Для оценки был отобран ряд формализованных признаков: определение функционального состояния паренхиматозных элементов и характера инфильтра-тивных процессов в печени, отражающих степень нарушения дезинтоксикацион-ной, синтетической и защитной функций органаучет количества НЭК в легких, обеспечивающих местную-регуляцию функций дыхательной системы — приспособление кровотока к вентиляции легких и изменение ПВОхарактер микроцир-куляторных нарушений в ренальном звене — функциональное состояние почечных телец и эпителия канальцев, обеспечивающих адекватную работу выделительной системыанализ морфофункционального состояния НЭК лимфоидных органов, выступающих в роли неспецифических регуляторов иммунологических процессовколичественная характеристика изменений в надпочечниках — органе, ответственном за формирование адаптационных реакций.

Таким образом, применение в экспериментальной морфологии особо опасных инфекций аппаратно-программных компьютерных комплексов и стандартных схем морфологического анализа по представленным алгоритмам упростило доклиническую характеристику создаваемых препаратов против холеры, чумы и туляремии, позволило нивелировать зависимость качества конечного результата исследования от субъективизма оценки экспериментатора. Применение морфометрическо-го анализа при изучении патогенеза особо опасных инфекционных болезней направлено на расширение возможностей для совершенствования стратегии профилактики и методов лечения холеры, чумы и туляремии. Важно подчеркнуть необходимость дальнейшего углубленного комплексного изучения различных аспектов нейроэндокринных взаимосвязей в организме биомоделей при экспериментально-морфологических исследованиях особо опасных инфекционных болезней.