Деление клеточной мембраны — это такое топологическое преобразование, в результате которого происходит формирование новых мембранных структур. Оно лежит в основе фундаментальных клеточных процессов, таких как митоз, эндоцитоз, деление органелл и многих других. Для сохранения замкнутости объемов делящихся структур деление соединяющего их мембранного перешейка должно сопровождаться формированием так называемой структуры полуделения (Kozlovsky and Kozlov, 2003), когда внутренний монослой перешейка локально сливается, а внешний остается интактным. Эти перестройки сопряжены с большими изгибными деформациями мембраны. В клеточных системах они создаются специализированными белковыми структурами (см. рис. 1), собирающимися на поверхности перешейка (Lee amd Schekman, 2004), который при этом зачастую представляет собой цилиндрическую мембранную нанотрубку (НТ) (Lollike and Lindau, 1999).
Динамин является одним из ключевых белков, опосредующих деление мембран в различных клеточных системах (van der Bliek and Meyerowitz, 1991; Chen et. al., 1991). Существуют предположения, что именно он за счет энергии гидролиза ГТФ разрывает мембранную НТ, деформируя ее соответствующим образом (Sever et. al., 2000). Блокировка ГТФазной активности динамина in vivo приводит к остановке эндоцитоза на стадии деления мембраны. При этом хорошо видно, что белок образует плотные полимерные спирали или стопки колец вокруг мембранных НТ, удерживающих отпочковывающиеся везикулы (Takei et. al. 1995). Известно, что такая полимеризация запускает кооперативный гидролиз ГТФ (Tuma and Collins, 1995), так что его скорость увеличивается в тысячи раз, причем молекулы белка одной спирали практически одновременно гидролизуют ГТФ. Считается, что выделяющаяся при этом энергия расходуется на деформирование и деление мембранной НТ (Song and Schmid, 2003). О механизме превращения химической энергии в механическую работу известно мало, при этом существующие на сегодняшний день представления зачастую противоречивы. Большинство из предложенных гипотез были основаны на результатах анализа взаимодействия динамина с модельными липидными мембранами. Динамин проявляет механическую активность in vitro: так было показано, что он формирует длинные НТ из липидных везикул, навиваясь вокруг них спиралью (Carr and Hinshaw, 1997). При последующем добавлении в систему ГТФ происходит расщепление НТ на небольшие липосомы (Sweitzer and Hinshaw, 1998). Предполагают, что расщепление нанотрубок в таких системах происходит в результате структурных изменений динаминовой спирали, таких как ее сужение, удлинение или скручивание (Sweitzer and Hinshaw, 1998; Stowell et. al., 1999; Roux et. al., 2006). Однако до сих пор остается неразрешенным вопрос, каким образом такие трансформации спирали обеспечивают быструю, локальную и безутечечную перестройку бислоя, необходимую для формирования везикул.
В клетке динамин функционирует в присутствии ГТФ. Протяженные динаминовые структуры, которые образовывались in vitro на поверхности НТ, формируются in vivo только при блокировании гидролиза ГТФ (Takei et. al., 1995). Следовательно, функциональная белковая единица, опосредующая деление, относительно коротка и нестабильна. К сожалению, высокая скорость деления и низкая разрешающая способность использующихся экспериментальных методов серьезно усложняют идентификацию деформаций НТ, вызываемых динамином. Дело в том, что электронная микроскопия, которая являлась важнейшим инструментом в исследовании взаимодействия динамина с мембранами, даёт статическую картину и не позволяет следить за делением в режиме реального времени.
Рис. 1 Образование везикулы в процессе эндоцитоза. а — схематическое изображение формирования эндоцитозного пузырька и белков, участвующих в этом процессе (Lee and Schekman, 2004). б — последовательно сделанные электронные фотографии отпочковывающейся везикулвидно, что на последних стадиях мембранный перешеек, соединяющий везикулу с плазматической мембранной, представляет собой цилиндрическую нанотрубку (Brodin et. а!., 2001).
В нашей лаборатории была разработана методика вытягивания липидных трубок из плоской бислойной липидной мембраны (БЛМ) с помощью стеклянной микропипетки (Frolov et. al., 2003). Было показано, что в зависимости от длины трубки она может находиться в одной из двух форм: катеноидальная микротрубка (МТ) или цилиндрическая нанотрубка. Особенности формирования таких трубок позволяют вести непрерывное наблюдение за изменениями ионной проводимости их внутренних каналов. Поэтому полученные таким образом НТ могут быть использованы для исследования быстрых процессов деления мембран динамином. Учитывая ключевое значение динамина в широком круге клеточных процессов, детальное изучение данной проблемы представляется весьма актуальным.
ВЫВОДЫ.
1. Разработан метод определения механических параметров мембраны нанотрубки НТ (модуль изгиба, латеральное натяжение), основанный на анализе стационарной формы НТ, к концам которой приложена разность потенциалов. Показано, что жесткость многокомпонентной мембраны уменьшается с ростом ее кривизны. Это может быть связано с перераспределением молекул липида, имеющих разное значение спонтанной кривизны, между внутренним и внешним монослоем мембраны. Когда радиус кривизны становится сравним с толщиной бислоя, модуль изгиба уменьшается вдвое.
2. Показано, что модель динамин-отрицательно заряженная липидная нанотрубка, адекватно воспроизводит основные стадии деления клеточной мембраны специализированным белком динамином. Динамин сжимает НТ, сорбируясь и формируя стабильную структуру на ее поверхности. Возможность деления НТ динамином в присутствии ГТФ определяется жесткостью ее мембраны, причем деление происходит без образования проводящих дефектов в стенке НТ.
3. Показано, что конформационные изменения динаминовой спирали в результате гидролиза ГТФ не вызывают ни дальнейшего ее сужения, ни увеличения ее шага. Гидролиз ГТФ приводит к исчезновению стекинг-взаимодействия между витками спирали, они разъединяются, а спираль в итоге теряет жесткость. Показано, что деление НТ осуществляется короткой динаминовой спиралью, имеющей 3−5 витков.
4. Радиус, до которого динамин сжимает НТ, является критическим параметром, определяющим возможность деления, а он в свою очередь зависит от модуля изгиба мембраны. Таким образом, нами показано, что молекулы липида наравне с динамином могут выполнять регуляторную роль в процессе деления клеточной мембраны.
5. На основе полученных данных было выдвинуто предположение о механизме деления НТ динамином. Согласно ему энергия гидролиза ГТФ расходуется на разъединения витков спирали динамина, в результате чего последняя теряет жесткость. Дальнейшая эволюция НТ зависит от радиуса, до которого ее сжал динамин, и длины участка спирали, гидролизовавшего ГТФ.
