Помощь в учёбе, очень быстро...
Работаем вместе до победы

Антигенные свойства инфекционных и термоинактивированных препаратов вакцинных штаммов вируса болезни Марека

Диссертация: Антигенные свойства инфекционных и термоинактивированных препаратов вакцинных штаммов вируса болезни Марека
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

1. За основу выделения иммуноглобулинов класса G желтка яиц кур был взят метод двукратного переосаждения ПЭГ-6000 с доочисткой обог тащенной IgG фракции на сефадексе G-200 (43). Первоначально желток отделя ли от белка на сите, отмывали от липидного слоя фосфатным буфером (0.01 М К-ФБР, рН 7,5 с 0,1 М NaCl) и гомогенизировали с двумя объемами этого же буфера. От липидов и пигментов освобождались… Читать ещё >

Содержание

  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
  • 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
    • 1. 1. ВИРУС БОЛЕЗНИ МАРЕКА
  • 1. Л .1. Классификация ВБМ
    • 1. 1. 2. Биологические характеристики ВБМ, ВГК и ВГИ
    • 1. 1. 3. Морфология и морфогенез
    • 1. 1. 4. Патогенез и типы взаимодействия вируса с клеткой
    • 1. 2. ВИРУСНЫЕ БЕЛКИ И АНТИГЕНЫ
    • 1. 2. 1. Основные антигены ВБМ и ВГИ
    • 1. 2. 2. Другие белковые комплексы, кодирующие ВБМ и ВГИ
    • 1. 3. ВАКЦИНОНРОФИЛАКТИКА БОЛЕЗНИ МАРЕКА
    • 1. 3. Л. Вакцины на основе штаммов серотипа
    • 1. 3. 2. Вакцины на основе штаммов серотипа
    • 1. 3. 3. Вакцины на основе штаммов серотипа
    • 1. 3. 4. Поливалентные вакцины
    • 1. 3. 5. Рекомбинантные вакцины
    • 1. 4. СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВБМ, ВГК И ВГИ
    • 1. 4. 1. Серологические методы
    • 1. 4. 2. Применение ИФА для идентификации антигенов ВБМ, В) К и ВГИ и антител к ним
    • 1. 5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ПЦР) ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ВБМ
    • 1. 6. 3. АКЛЮЧЕНИЕ
  • СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
    • 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
  • 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
  • 3. Л. СИНТЕЗ ИММУНОГШРОКСИДАЗНОГО КОНЪЮГАТА
  • ЗЛЛ. Выделение, очистка и концентрирование из жел тков яиц
    • 3. 1. 2. Исследование в РДГ1 и в ИФА антисывороток кО кур, полученных на баранах и кроликах
  • ЗЛ.З. Выделение из гипериммунных сывороток баранов и кроликов специфических антивидовых антител к желткам кур методом аффинной хроматографии
  • ЗЛЛ. Конъюгация бараньих и кроличьих анти
    • 0. антител кур с пероксидазой и подбор их рабочих разведений
    • 3. 2. ИЗУЧЕНИЕ ФРАКЦИОННОГО И МОРФОЛОГИЧЕСКО! О СОСТАВА БЕСКЛЕТОЧНОГО ВГИ (ПРОИЗВОДСТВЕННЫЕ СЕРИИ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БМ НА ОСНОВЕ ШТАММА БС-Ш).'
    • 3. 3. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГ ЕНОВ ВБМ, РАЗЛИЧАЮЩИЕСЯ ПО ПЕРЕКРЕСТНОЙ СЕРОТИПИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ТЕРМОДЕНАТУРАЦИЯ)
    • 3. 3. 1. Влияние термоденатурации на антигенную активность препаратов на основе ВГИ
    • 3. 3. 2. Изучение антигенных свойств препаратов на основе вируса герпеса кур (ВГК)
    • 3. 4. ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ ЛИШИЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА
    • 3. 5. ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЬЮТЕРНОЙ ПРОГРАММЫ ДЛЯ О! I-РЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ВИРУСА В ВАКЦИНЕ ПРОТИВ БМ
  • Cl 1ИСОК СОК РА ЩК11 НИ
  • ЛГ — антиген
  • ACJI — антиген сенсибилизирующие лимфоциты
  • AT — антитело
  • БМ — болезнь Марека
  • ВБМ — ни рус болен ш Марека
  • ВВА — нирусный внутренний антиген вВБМ — вирулентный ВБМ ввВБМ (ОВВБМ) — высоковирулентный (особовирулентпый) ВБМ ввВЬМ I — ВБМ с наиболее высокой вирулентностью
  • В1И — ВБМ 3 серотипа
  • В ПС — ВБМ 2 серотипа
  • BMA — вирусный мембранный антиген
  • ВОЗ — Всемирная Организация Здравоохранения
  • ГКГ — главный комплекс гистосовместимости
  • Д- дальтоп, кД- килодальтон (1000 дальгон)
  • ДМСО — диметилсульфоксид
  • Д1IK — дсзоксирпбопуклеиповая кислота
  • ДС11 — додецилсульфат натрия
  • ИФ — нммуно (|)люоресцеицпя
  • ИФА — пммуноферментный анализ
    • I. CIC — культура клеток

    KICK'") — культура клеток куриных эмбрионов КК1Г) — культура клеток перепелиных эмбрионов ЮСУ') — культура клеток утиных эмбрионов 1СРС — крупный рогатый скот МАТ — мопоклопапьпые антитела Ol 1 — оп тическая плотность

    OPC c) i крытая рамка считывания

    ПЛАТ полиакриламидный гель п.и. — пары нуклеотидов

    ПХ — пероксидаза хрена

    I НДР — полимеразная цепная реакция

    ПЭГ-6000 — полиэтиленгликоль с мол. массой 6000 Д

    РГ 3 Г — реакция гиперчувствительности замедленного типа

    РДП — реакция диффузионной преципитации

    PI IPC) — реакция непрямого розеткообразования

    РЭА — рестрикционный эндонуклеазный анализ см1 — кубический сантиметр

    СФГЛ — сахарозо-альбуминовая среда

    ТИА — тонкослойный иммунный анализ

    УЗ — ультразвук

    ФИ ГЦ — флюоресцнп изотиоциоиат

    ХАО — хорион аллаптоиеная оболочка

    ЦПД — цнтопатическое действие

    ЭПФ — >iiuгелий перьевых фолликул

    1а — связанный с 1-областыо ан тиген

    IgG — иммуноглобулин класса G g- гликонротеин с большой молекулярной массой gp — гликонротеин с низкой молекулярной массой рр — фосфопротеии iFPV-g? — рекомбипаптный вирус оспы, экспрессирующип gIJ-ген HUM

    RZ — показа тель чистоты (от нем. Reinheil-Zahl)

    SPP — свободный от специфических патогенных возбудителей

    Ui — большая уникальная область

    Us — малая уникальная область

Антигенные свойства инфекционных и термоинактивированных препаратов вакцинных штаммов вируса болезни Марека (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность проблемы. Вирус болезни Марека (ВБМ) — высоко патогенный i ерпесвирус, который может вызывать: 1) Т-клеточные лимфомы- 2) изменения периферических нервов, характеризующиеся лимфопролифера-тивной инфильтрацией и демиелинизацией, как правило, приводящие к параличу или слепоте- 3) различные проявления иммунодефицита и 4) атеросклероз у цыплят с нормальной холистеринемией, необыкновенно схожие с болезнями человека (37,16).

В настоящее время определены три серотипа ВБМ. К первому серо-типу относятся патогенные (опкогенные) и аттенуированные (неонкоген-пые) штамма. Ко второму серотипу — природные непатогенные штаммы вируса герпеса кур (ВГК). К третьему — антигенно-родственный ВБМ, вирус герпеса индеек (ВГИ) (59, 64, 85, 152).

Согласно принятой классификации данный ДНК-содержащий вирус в нас тоящее время относится к подсемейству Gammaherpesvirinae (36, 64). Однако в многочисленных сообщениях по структуре генома ВБМ и перекрестным антигенным реакциям с вирусом простого герпеса (ВПГ) человека. его предлагают отнести к подсемейству Alphaherpesvirinae (54,56, 57, 58, 7'}/)3).

Гак, Davidson I. et al. показали в своей работе (78), что чувствительные к назреванию олигомеры структурного антигена В ВБМ содержат конфирмационные энитопы, родственные олигомерам гликопротеина В (gB) альфагерпесвирусов ВГТГ-1 и ВПГ-2. Brunovskis и Velicer предполагают, что по антигенной структуре ВБМ и ВГИ филогенетически более связаны с альфа-, чем с гаммагерпесвирусами.

Хотя три серотипа различимы в серологических реакциях, они имеют много общих антигенов. Сыворотка против одного серотипа ВБМ обычно перекрестно реагирует с антигенами других серотипов, но гораздо cjimGcc, чем с гомологичными (85, 82). ффектиш1ым инструментов для идентификации вирусных антигенов являются моноклопальпые антитела (МАТ), которые позволяют изучит! структуру и функции вирусных белков (106, 112, 134, 160). Так, недавно, Bullow и Biggs подтвердили, что А-АГ является группоепецифиче-ским, по тем не менее имеет и типоспецифические детерминанты (64,1 36).

Davidson I. и Malkinson М. показали, что серотип-общие нейтрализующие домены располагаются в термостабильных олигомерных формах В-АГ с высокой молекулярной массой, а термолабильный мопомериый комплекс В-АГ имеет серотин-ограниченные эиитопы (74, 76, 105).

В последнее время для идентификации патогенных и пепатогенных штаммов и изолятов ВБМ широко применяют такие высокочувствительные методы исследования генома, как рестрикционпый анализ, полиме-разная цепная реакция, молекулярная гибридизация и секвенирование (60, 75, 138, 140, 167).

1 применение рестрикционного эпдопуклеазпого анализа показало существенное различие между образцами ДИК 1, 2 и 3 серотипов, а также между ДНК вирусов низкого и высокого пассажа в культуре клеток (93, 104, 128).

Результаты проведения ДНК-ДНК гибридизации между геномами ВБМ и ВГИ показали, что уровень гомологии нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих gA составляет 73%, а сравнение генов, кодирующих gB трех серотипов ВБМ выявило наличие в них существенных различий (26).

Многие годы значительный процент от всех вакцин, применяемых для профилактики БМ приходился на препараты па основе штамма FC-126 ВГИ, выделенного от индеек К a warn ига и Witter (независимо друг от друга) (94, 97). Однако, в последние годы, в связи с селекцией полевых штаммов и появлением ОВВБМ данный тип вакцин значительно снизил эффективность, а порой и полностью утратил способность защищать птицу от БМ. Высоковирулентные мутанты содержат антигены-мишени, несоответствующие таковым на вакцинном вирусе (16, 91, 106, 158).

Всестороннее углубленное изучение антигенных особенностей ВБМ и его взаимосвязей с другими представителями Herpesviridae будут способствовать в дальнейшем изготовлению новых поколений вакцинных препаратов, препятствующих селекции ВБМ в природных условиях и появлению высоковирулентных патотипов вируса.

Таким образом, представляется своевременным и обоснованным изучение антигенных свойств инфекционных и инактивированных препаратов сухой вакцины па основе ВГИ (штамм FC-126) с привлечением МАТ.

Данные литературы также свидетельствуют о необходимости разработки более чувствительных и специфичных диагностических тест-систем, особенно для выявление латентных и персистирующих форм ВБМ.

Перечисленные выше обстоятельства явились основополагающими в определении выбора темы диссертационной работы.

Цель и задачи исследования

.

Целью работы: изучить антигенные свойства инфекционных и термомнактивированных препаратов вакцинных штаммов вирусов болезни Марека с использованием полии моноклональных антител, а также ПЦР для выявления и типирования ДНК ВБМ.

В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:

Получить высокоактивные иммунопероксидазные антивидовые коныогаты (анти-IgG кур).

— Изучить фракционный и морфологический состав вирусной популяции в производственных сериях вакцины против БМ на основе ВГИ.

— Получить антигены ВБМ, различающиеся по перекрестной серотипиче-скон активности, применив приемы термоденатурации.

— Разработать варианты ИФЛ с применением полии моноклональных антител для выявления структурных белков ВБМ.

— Разработать компьютерную программу по обработке данных титрования антигенов в ИФА.

— Подобрать специфичные праймеры и оптимизировать условия постановки попимеразной цепной реакции для выявления и типирования ДНК вируса болезни Марека.

11аучная новизна работы.

Разработан новый способ получения чистого препарата из желтка яиц кур. Показана возможность исследования полученных гипериммунных сывороток кО кур в РДП и в ИФА (подана заявка на получение патента).

11олучсны и исследованы в ИФА специфичные и стабильные антигенные комплексы в пепрогретых и прогретых ультразвуковых лизатах клеток, инфицированных тремя серотипами ВБМ.

Впервые для анализа антигенного сходства поверхностных белков gB и gD разных серотипов ВБМ и ВПГ человека в ИФА были применены МА Г, направленные к белкам ВПГ.

Подобраны специфичные праймеры, комплиментарные гену гликопротеина, А и последовательностям внутренних инвертированных повтор ров, позволяющие выявлять ДНК вирулентных, онкогенных штаммов 1 серотина и вакцинных штаммов вируса 3 серотипа, определены оптимальные параметры постановки ПЦР для обнаружения вирусной ДНК.

ЛИГЕ РАГУ 141Ы Й ОБЗОР.

3. ВЫВОДЫ.

3.1. Разработан новый способ выделения иммунохимически чистого препаратаС желтка яиц кур. Показано, что гипериммунные антивидовые сыворотки, полученные иммунизацией чистым препаратом необходимо контролировать не только в РДП, но и в ИФА. Была использована баранья анти-^О кур сыворотка для синтеза высокоактивного и специфичного иммунопероксидазного конъюгата с рабочим титром 1:2000.

3.2. Проведенное исследование фракционного и морфологического состава вакцинного препарата ВГИ гель-фильтрацией на колонке с сефадек-сом С-200, в системе водорастворимых полимеров и электронной микроскопией, позволило получить антигеннои инфекционно активную фракцию вируса с высокой (99,3%) степенью очистки от балластных белков.

3.3. Используя приемы термоденатурирования препаратов ВБМ разных серотипов, получены следующие антигенные комплексы: а) перекрестно реагирующие с АТ к вирусу 1 серотипа и с АТ к ВГИб) реагирующие только с АТ к ВГИв) реагирующие только с АТ к вирусу 1 серотипа. Получены неинфекционные, термоденатурированные, сухие антигены, сти-! мулируюгцих выработку антител, обладающих преципитирующей и вирус-нейтрал изующей активностью.

3.4. Используя модификации ИФА с использованием МАТ 4f6 и поли-клональньтх антител, было выяснено, что ВБМ и ВПГ содержат общую антигенную детерминанту в белке gD, исследование которого позволяет четко идентифицировать ВБМ 2 и ВБМ 3. Показано, что ВБМ не содержит антигенной детерминанты, опознаваемой МАТ 2С к белку gB ВПГ человека.

3.5. Разработана компьютерная программа для определения активности вируса в вакцине против БМ иммуноферментным методом.

3.6. Отработаны оптимальные условия постановки ГЩР с использованием гтраймеров, комплиментарных вариабельным участкам последовательности гена гликопротеина, А ВБМ 1 и 3 серотипов, позволяющие выявлять ДНК вакцинных и вирулентных штаммов в пробах патматериала и зараженных культур клеток, содержащих 100 ФОЕ/см вируса.

3.7. Амплификация фрагментов генома ВБМ с использованием прайме-ров, фланкирующих инвертированные повторы длиной 132 п.н., позволяет дифференцировать онкогенный штамм HPRS-16 от вирусов 2 и 3 серотипов.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Разработанные «Методические указания по выявлению ДНК вируса болезни Марека с помощью полимеразной цепной реакции», могут быть использованы для выявления вирусной ДНК в патологическом материале и вируссодержащей культуралыюй жидкости, а также для идентификации возбудителя.

Разработанные «Методические указания по применению компьютерной программы для определения активности вируса в вакцине против БМ иммуноферментным методом» позволяют по трем разведениям достоверно определять активность вируса в производственных сериях вакцин против БМ.

Разработанные методические указания и методы исследований рассмотрены и одобрены на заседаниях методического совета и утверждены директором ВНИТИБП.

1.6.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Возбудителем БМ является клеточно-ассоциированный ДНК-содсржащий герпесвирус подсемейства Оагшт^егрезушпае (36, 64). Однако, большое количество сообщений в последнее время подтверждает гомологию ВБМ и вирусов подсемейства А1рЬа11егре5Утпае (7, 54, 56, 57, 58, 79, 89, 93). р

Как видно из обзора литературы, важное значение приобрело изучение структурных белков и антигенов ВБМ. Функционально охарактеризовать АГ в последнее время стало значительно легче благодаря усовершенствованию технологии получения типоспецифических АТ. Появление технологии г ибридом сделало возможным продуцировать МАТ высокой специфичности (64, 101).

Охарактеризовано 6 основных антигенов ВБМ и многие другие белки (33, 64, 70, 73, 76, 98, 119, 136). Основными белками, играющими важную роль в развитии иммунитета при БМ являются gA и gB. А-АГ считают группоспецифическим (общим) для всех серотипов. Хотя, появление шпор в РД! I и результаты перекрестного взаимодействия говорят о наличие и типоспецифических детерминант (26, 64, 136, 166). Установлено, что А-АГ не имее т отношение к онкогенности (45, 96, 136). В-АГ-комплекс играет центральную роль в нейтрализации вируса в организме хозяина (37,136). Однако недавние исследования показали на действительное значение отдельных фракций (76). Было показано, что серотип-общие нейтрализующие домены располагаются в термолабильных олигомерных формах В-АГ с высоким молекулярным весом, а термостабильный комплекс В-АГ имеет серотип-ограничснные эпитопы. ВБМ 1 серотипа и ВГИ имеют близкую антигенную взаимосвязь, тогда как ВБМ 2 серотипа обладает уникальными антигенным статусом (26, 74, 76, 78, 105).

Вакцинопрофилактика является основным методом борьбы с БМ. На сегодняшний момент в качестве вакцинных препаратов используют: 1) ат-тенунрованпый вирус 1 серотипа (НРН.8−16) — 2) авирулентный частично аттенуированпый вирус 1 серотипа СУ1 988 (штамм Шзреш) — 3) природные неонкогенные вирусы 2 серотипа (8В-1, 301 В1, штамм «42+50»), используются в бивалентных вакцинах- 4) авирулентный вирус 3 серотипа, известный как ВГИ- 5) бивалентные вакцины ВГИ + 10−20% штамма 8В-1- 6) рекомбинантные вакцины на основе вируса оспы, ретрои бакуловиру-сов (37).

Многолетняя вакцинация препаратами на основе ВГИ способствовала селекции полевых штаммов и появлению высоковирулентных (а после 1995 г вв+ и вв++) изолятов ВБМ (152, 153, 157, 161, 100, 195). Обладая высокой эффективностью в первое десятилетие после внедрения (I970−1980), в последующие годы вакцины из штаммов ВГИ значительно снизили, а нередко и полностью утратили способность защищать птицу от БМ (16, 91, 106, 158).

Основными проблемами, затрудняющими идентификацию и дифференциацию изолятов и штаммов ВБМ общепринятыми методами (серологические реакции) являются персистенция вирулентных и авирулентных штаммов и вариантов, а также высокий резерв изменчивости, которых играет значительную роль в изменении патогенных и онкогенных свойств вируса (30, 32, 63, 90). Кроме того, существующие методы не позволяют выявлять находящийся в латентной форме вирус. Актуальность данной проблемы связана с тем, что животные, инфицированные ВБМ, становятся пожизненными его носителями и в любой момент возможна реактивация латентного вируса.

53 р

Одним из подходов к изучению структуры генома и дифференциации существующих изолятов ВБМ является использование метода ПЦР, РЭА и картирование ДНК (125).

Рестрикционный эндонуклеазный анализ ДНК ВБМ позволяет: 1) дифференцировать три серотипа ВБМ- 2) различать индивидуальные изо-ляты- 1) устанавливать вирусы более высокого пассажа (104, 128, 140).

Данные литературы свидетельствуют о возможности применения ПЦР: 1) для выявления ВБМ в различных органах и тканях и инфицированной птицы- 2) в оценке функционального значения некоторых участков генома- 3) для дифференциации вирулентных изолятов ВБМ от вакцинных штаммов- 4) для выявления генома вируса в латентной стадии инфекции (55,60,75, 1 17, 138, 167).

Собственные исследования.

2. Материалы и методы.

2.1. Вирус. В работе использовали:

2.1.1. Промышленные серии нативной и сухой вакцины против БМ на основе штаммов ВГИ FC-126 и FC-126M;

2.1.2. Штаммы 1 серотипа: Jm ВБМ, любезно предоставлен Е.В. Баррос-Палома (ВГНКИ) в виде инактивированного формалином и лиофилизиро-ванного ультразвукового лизата эпителия перьевых фолликулов инфицированных SPF-цыплятHPRS-16 (ВГНКИ).

2.1.3. ВГК (ВБМ серотипа 2): шт. «42», шт. «50» и SB-1- промышленные серии нативной поливалентной вакцины против БМ (ВГИ+ВГК);

2.1.4. В качестве контрольных препаратов использовали культуральную р жидкость, собранную с пеинфицированных клеток;

2.1.5. Ультразвуковые лизаты неинфицированных культур КККЭ и ККПЭ и перьевых фолликулов маховых перьев неинфицированных цыплят.

2.1.6. В качестве контрольных препаратов в ПЦР использовали: ИЛТ птиц, штамм I IT и ИРТ КРС, штамм ТК-А.

2.2. Антигены. В качестве антигенов использовали:

2.2.1. Ультразвуковые лизаты инфицированных КККЭ в виде свежеприготовленных, а также длительно хранившихся серий сухой вакцины против БМ на основе ВБМ третьего серотипа:

— исходные сухие;

— сухие термоденатурированные в динамике при 100°С- -восстановленные физраствором до исходного объема и термоденатурированные в динамике при 100 °C;

2.2.2. Ультразвуковые лизаты инфицированных КККЭ в виде препарата на основе ВБМ второго серотипа (ВБМ 2) с высокой степенью цитопатиче-ского эффекта (ЦПД):

— исходные сухие;

— сухие термодеиатурированные в динамике нри 100° С- -восстановленные физраствором до исходного объема и термодеиатурированные в динамике при 100° С;

2.2.3. Ультразвуковые лизаты неинфицированных КККЭ:

— исходные сухие;

— сухие термодеиатурированные в динамике нри 100° С- -восстановленные физраствором до исходного объема и термодеиатурированные в динамике при 100° С;

2.2.4. В качестве антигенов в серологических реакциях использовали также все препараты, перечисленные в разделе 2.1.

2.3. Культура клеток и среды. Трипсинизацию тканей эмбрионов SPF-кур и приготовление клеточных культур проводили по общепринятым методам, описанным в литературе (4, 19, 30, 36). Для размножения и титрования внеклеточного вируса использовали первичные культуры клеток 10−12 дневных эмбрионов SPF-кур. Бесклеточный ВГИ титровали в односуточ-ной КККЭ, а клеточно-ассоциированный вирус титровали в 2-х суточной культуре клеток. Учет цитопатического действия вируса проводили на 5−6 сутки по числу фокусообразующих единиц (ФОБ) в см3 после окрашивания клеточных культур с использованием красителя амидового черного («Reanal», BMP) и растворов уксусной кислоты по методике (30). Для обработки и трипсимизации тканей эмбрионов использовали солевой раствор Хенкса и 0,25% раствор трипсина («Дифко», США), а для съема и дезагрегации клеточных культур — 0,125% раствор трипсина.

3 лабораторных условиях клетки и вирус выращивали в стационар

3 1 ном положении в 50 см и 1500 см флаконах с площадью поверхности соответственно 20 и 300 см³.

Применяли среды ИГЛА, ГЛАЭ, 199 или их смеси и сыворотку КРС производства Московского мясокомбината в концентрации 5−10% (для ростовой среды) и 2% (для поддерживающей среды). В культуральные среды перед использованием добавляли антибиотики пенициллин — 100 Ед/см и стрептомицин — 100 мкг/см .

2−4. Защитные среды. В состав криозащитных сред для консервирования инфицированных вирусом клеток входили: среда Игла (рН 7,4−7,6) — 40%, ГЛАЭ (рН 7,4−7,6) — 40%, сыворотка КРС — 10%, диметилсульфоксид (ДМСО, хч) -10%. Для. бесклеточного вируса использовали стандартную среду СФГА, а также среду на основе безбелкового стабилизатора — 8% сахарозу.

2.5. Термообработка вируссодержащих лизатов. Сухие и восстановленные физраствором ультразвуковые лизаты клеток, инфицированных ВБМ 2 и ВБМ 3, подвергали либо термостатированию при 37,5° С разные сроки, либо термоденатурированию при 100° С в течение 5−15, 30, 45 и 60 мин. Антигенную активность, специфичность и инфекционность термообрабо-танных и необработанных лизатов устанавливали в РДП, ИФА и титрованием па культуре клеток эмбрионов БРГкур.

2.6. Экспериментальные животные. В опытах по получению анти-1§ С желтка яиц кур использовали кроликов и баранов. Сыворотки к неинфек-ционпым препаратам ВБМ получали от морских свинок. Цыплята были использованы для получения ультразвуковых лизатов перьевых фолликулов. Специфические к ВГИ (штамм БС-126 М) сыворотки брали от 50−90 дневных 8РГ-цыплят. Пробы селезенки и фабрициевой сумки для проведения ПЦР были взяты от 7-ми, 14-ти и 21-подневных цыплят, вакцинированных в суточном возрасте ВГИ.

2.7. Схемы иммунизации. Морских свинок иммунизировали по следующей схеме: препараты вводили внутримышечно по 0,5 см³ трехкратно через недельный интервал. Через 7 дней после последнего введения брали сыворотки крови.

Для получения ультразвуковых лизатов перьевых фолликулов препараты ВБМ вводили БРЕ-цыплятам. Через 14 дней получали лизаты фолликул маховых перьев, озвучиванием очинов на ультразвуковом дисперга-торе УЗД! I-1 при силе тока 1=0,4 А в течение 3 сек. пятикратно.

Специфические к ВГК (штаммы «42″ +» 50″) сыворотки получали от 47−50~дневных цыплят, иммунизированных в суточном возрасте препара.

5 3 тами вируса в дозе 1×10″ ФОЕ/0,2 см'.

Специфические к ВГИ штамм ЕС-126М сыворотки получали от 50р

90-дневных цыплят, иммунизированных в суточном возрасте препаратами в дозе 2×105 ФОЕ/0,2 см³.

Для диагностики БМ методом ПЦР в патологоанатомическом материале суточным 8РЕ-цыплятам вводили 10-ти кратную дозу ВГИ, штамм ЕС-126.

Для получения антивидовых сывороток к желтков яиц кур, использовали кроликов и баранов, которых иммунизировали препаратамиС по схемам С. В. Кузнецовой (44) и Б. Б. Першина (3), соответственно. 2.8. Фракционирование ВГИ. Бесклеточный препарат ВГИ фракционировали на колонке модели К 29/100, заполненной сефадексом С-200 (8). Образец восстанавливали в рабочем буфере (0,05 М Трис-НС1, рН 8,6), наносили на подготовленную и откалиброванную колонку, скорость потока устанавливали равной 1 капля/15 сек. Объем фракций составлял 3 см .

Профиль элюирования белков с колонки вычерчивали по данным измерений оптических плотностей (ОП) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 1=280 нм. Активность и специфичность фракций вируса определяли на культуре клеток и в ИФА, а однородность и чистоту — методом электрофореза в иолиакриламидном геле (ПААГ) (6).

2−9. Концентрирование и фракционирование внеклеточного ВГИ методоммежфазного разделения вирусных частиц в водных растворах полимеров.

Работу проводили в соответствии с методом, предложенным Альбертсо-иом (1974), используя внеклеточный ВГИ. Для выбора точки концентрирования построение фазовых диаграмм для каждой серии препарата производили по методике, разработанной во ВНИТИБП (24, 34). Затем в ви-руссодержащую суспензию приливали растворы полимеров (20% раствор Т-фракций декстрана м.м. 500 кД, производства фирмы «Pharmacia», Швеция), 40% раствор полиэтиленгликоля м. м. 6 кД и 5 М раствар NaCl до конечной концентрации, соответствующей выбранной точке концентрирования вируса. После перемешивания на магнитной мешалке в течение 30 мин смесь переливали в делительные воронки и оставляли на холоде (5:): 1°С) па 18−20 ч, в течение которых наблюдалось полное расслоение фаз. Затем фазы анализировали на наличие вируса титрованием в культуре клеток, методами ИФА и электронной микроскопии. 240. Электронная микроскопия. Морфологию ВГИ изучали методом ультратонких срезов и негативного контрастирования (А.Ф. Марыгина, 1987). Образцы исследуемого материала наносили на коллодиевую пленку, укрепленную углем, и контрастировали раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, (рН 7,0). Полученные препараты просматривали в электронном микроскопе ДЖГМ-100Б (Япония). Электронограммы получали на фотопластинках MR типа «ядерные» с последующим экспонированием на фотобумагу. Работа выполнялась в институте теоретической и экспериментальной биофизики (г. Пущино), в лаб. ультраструктуры нейрона совместно со ст. науч. сотр. И. М. Санталовой (зав. лаб. проф. Д.А. Мошков).

2.11 .Выделение и очистка иммуноглобулинов класса G желтка яиц кур.

2.1 1.1. За основу выделения иммуноглобулинов класса G желтка яиц кур был взят метод двукратного переосаждения ПЭГ-6000 с доочисткой обог тащенной IgG фракции на сефадексе G-200 (43). Первоначально желток отделя ли от белка на сите, отмывали от липидного слоя фосфатным буфером (0.01 М К-ФБР, рН 7,5 с 0,1 М NaCl) и гомогенизировали с двумя объемами этого же буфера. От липидов и пигментов освобождались экстрагированием полиэтиленгликолем (ПЭГ) с м.м. 6000 Д (3,5% вес/объем) и центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 10 мин. Глобулиновую фракцию осаждали из супернатанта двукратной преципитацией ПЭГ-6000 до конечной концентрации 12%. Иммунохимически чистый IgG желтка яиц кур получали из глобулиновой фракции гель-хроматографией на се-фадексс G-200 («Pharmacia», Швеция) на колонках К 26/100 («Pharmacia», Швеция) общепринятыми методами (1). Профиль эшоирования белков с колонок регистрировали с помощью СФ-26.

2.11.2.Концентрацию IgG подсчитывали, учитывая величину оптической плотности ОП28(ь по формуле: i. uG) V х (()I I, so /1,31), где.

IgG) — выход иммуноглобулина G в мгV — объем раствора в см 3;

ОП280 — оптическая плотность раствора- 1,31 — экстинкция раствора IgG с концентрацией 1 мг/см.

2.11.3. Чистоту выделенных препаратов IgG проверяли совместно с зав. лаб. биохимии ВНИиВВиМ, А. Д. Середой методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСП), используя в качестве маркеров набор белков с определенной молекулярной массой (м.м.) (6). После построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы по статистической обработки Stargraff, находили м.м. белков в исследуемых пробах. Специфичность выделенных препаратов проверяли методом иммуно-электрофореза с полиспецифической сывороткой, полученной на протеины желтка яиц кур на стеклах размером 6×9 см в 1%-ном агаре «Дифко» по общепринятым методикам (13, 36).

2.12.Активность и специфичность гипериммунных сывороток кроликов и баранов, содержащих анти-IgG антитела кур определяли в РДП и в ИФА.

2.13.Выделение специфических антител из сывороток крови.

Антитела из гиперимунных антивидовых сывороток крови баранов и кроликов выделяли методом аффинной хроматографии на колонках 26×40, предварительно проведя двукратное высаливание сульфат риванолом. Специфические сорбенты получали ковалентной иммобилизацией иммуноглобулинов класса G на активированной BrCN-сефарозе 4 В («Pharmacia», Швеция) и BrCN-агарозе отечественного производства (1, 22). Сорбцию иммуноглобулинов класса G, добавленных в соотношении 1:1- 1:3, проводили при постоянном перемешивании на роторной мешалке в течение 16−18 ч при +4°С. Затем промывали носитель 500−1000 см 26 мМ фосфатного буферного раствора, содержащего 0,15 M NaCl (рН 7,1) на р стеклянном фильтре. Готовый сорбент осушали с помощью вакуумного насоса и переносили в колонку. Вносили 20 см³ кроличьей антисыворотки (с титром преципитирующих антител 1:16—1:32). Для выделения специфических антител из бараньей антисыворотки 20 см³ ее (с титром — 1:128) наносили на сорбент. Инкубировали сыворотки с сорбентом путем подачи па колонку элюирующего буфера в течение 4−5 ч со скоростью подачи 30 см3/с. Диссоциацию комплекса антиген — антитело вызывали снижением рН до величины 2,2−2,8 после предварительного отмывания иммуносор-бента от неспецифически связавшихся белков сыворотки. Раствор антител нейтрализовали добавлением 1 М К2НРО4 до величины рН 7,2−7,4.

Выделенные антитела концентрировали до содержания белка 7 мг/см на ультрафильтрационной ячейке ФМ02 с мембраной УАМ при давлении 0,3 МНа при (5-Ы°С). Чистоту и специфичность антител контролировали методом нммуноэлектрофореза в агаре с IgG желтка яиц кур (13).

2.14. Комыогация антител с пероксидазой. Синтез конъюгатов пероксида-зы (1IX) с аффинно очищенными антителами осуществляли перйодатным методом, описанным Р. К. Nakane и A. Kawaoi (110) и М.В. Wilson и Р. К. Nakanc и A. Kawaoi (150). Для этих целей использовали ПХ с RZ (показатель чистоты) = ОП403/ОП280 > 2,8.

Концентрацию конъюгата оценивали спектрофометрически по количеству I1X, входящей в его состав, используя формулу, предложенную Р. Keilin (150). Активность и специфичность полученных конъюгатов определяли в ИФА титрованием с IgG желтка яиц кур (гомологичные иммуноглобулины, положительный антиген), и IgG кролика (гетерологичные иммуноглобулины, отрицательный антиген), адсорбированными в лунках полистироловых микроплат. За рабочее разведение конъюгата принимали наибольшее разведение, для которого в реакции с положительным антигеном ОГ1.150 > 1,5 опт. ед., а в реакции с отрицательным антигеном ОП450 < 0,05 опт. ед. Конъюгаты консервировали глицерином (1:1). Антимышиные антитела, меченные ПХ, получали в институте вирусологии им. Д. И. Ивановского.

2−15. Иммуноферментный анализ.

2.15.1. Иммуноферментный анализ для определения серотипоспецифиче-ских антигенов ВБМ с использованием иммобилизованных антигенов и моноклоиальных антител, направленных к белкам ВПГ человека. В качестве дифференцирующих антител применяли мышиные моноклональные антитела (МАТ любезно предоставленные зав. лаб. института вирусологии им. Д. И. Ивановского, проф., Кущ A.A.) к структурным компонентам ВПГ:

— MAT 4f6, направленные к гликопротеину Д ^Д);

— MAT 2С, направленные к гликопротеину В (gB);

— копъюгат мышиных анти — gD антител с ПХ.

2.15.2. Твердофазный ИФА — «сендвич» метод с использованием МАТ к gu.

96 — луночные микропланшеты сенсибилизировали анти — gD МАТ (4Г6) в рабочих разведениях в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5) в течение ночи при 20 °C. На втором этапе вносили раститрованные (прогретые и непрогретые) ультразвуковые лизаты и клеточно-ассоцпированные препараты вируса (см. п.п. 2.1.4. и п.п. 2.2.), затем вносили мышиные антиgD антитела, конъюгированные с ПХ. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамшт. Учет результатов проводили р па автоматическом считывающем фотометре при длине волны 450 нм. 2.15.3. Твердофазный ИФА с прямой сорбцией антигена.

Микропланшеты сенсибилизировали антигенами на физиологическом растворе в течение ночи при 4 °C. На втором этапе вносили поликло-нальные куриные и моноклопальные мышиные антитела. На третьем этапе вносили соответствующие антивидовые конъюгаты с ПХ. Затем завершали ИФА как описано выше,.

2.16. Реакция нейтрализации. Реакцию нейтрализации вирусной активности проводили на культуре ККЭ. Для этого сыворотки морских свинок разводили с двукратным интервалом от 1:4 до 1:512. В качестве вируссо-держащего материала использовали одну серию вакцины на основе ВГИ (штамм ?С-26) с предварительно оттитрованной дозой вируса (300 ФОБ в 0,1 см3). Разведенный вирус с постоянной дозой смешивали с равным объемом разведений испытуемых сывороток. Смеси вируса и сывороток перемешивали встряхиванием при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую смесь вносили по 0,2 см³ в плоскостенные 50 см³ флаконы с мо-нослойной культурой с предварительно слитой питательной средой и оставляли для контакта в течение часа при 37 °C. Затем добавляли поддерживающую среду. Учет реакции нейтрализации проводили на 7-й день. Титром антител считали то наивысшее разведение сывороток, которое подавляет фокусообразование не менее чем на 50% во всех зараженных данной смесью флаконах.

2.17. Реакция непрямой иммунофлюоресценции (ИФ).

Для постановки реакции непрямой ИФ КККЭ выращивали на покровных стеклах в течении 24 ч. Затем монослои КККЭ инфицировали ВГИ или ВГК из расчета 200 фокусообразующих единиц на см площади покровного стекла. Через 24, 48 и 72 ч после заражения инфицированные клетки промывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,4, высушивали на воздухе, фиксировали холодным ацетоном 10 мин. На фиксированные препараты наносили очищенные МАТ, направленные на белок gB и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C. Затем промывали проточной водой и наслаивали антивидовую сыворотку, меченную ФИТЦ, с AT ко всему gB (производство НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи) в течение 30 мин. При 37 °C. Окрашенные препараты исследовали с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМИНИ-1. 2−18. Двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони (РДП).

Реакцию ставили общепринятым методом (13, 36). Вырезанные в слое агарового геля равномерной толщины лунки заполняли препаратами, перечисленными в п.п. 2.1. и 2.2. и антисыворотками. Реакцию учитывали после образования иммунных комплексов (через 24−72 ч), которые визуально выявлялись в виде линий преципитации. 2.19. Реактивы и ферменты, используемые для постановки ПЦР.

В работе использовали реактивы отечественного производства: борная кислота, уксусная кислота, фенол, спирт этиловый, хлороформ, натрий хлористый, магний хлористый, калий фосфорнокислый двухзамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый одно-замещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный.

Импортные реактивы: трис основной, ЭДТА-Ыа2 соль, бромистый этидпй, доделил сульфат натрия, бычий сывороточный альбумин, ацетат.

Н М натрия, дсзоксирибопуклеотидтри-фосфаты («Serva», ФРГPharmacia;

Швеция). Ферменты: Taq-полимераза производства фирмы «Fermentas», Литва);

2.20. Оборудование для проведения ПЦР.

Амилификатор «Touch Down», Hybaid, Англиякомплект типа Эп-пендорф, состоящий из центрифуги, термостата, миксеранабор автомата^ ческих микропипеток «Gilson», Франциясистема для электрофоретиче-ского разделения ДНК «Hoeffer Scientific Instruments», СШАтрансиллюминатор, США.

2.21. Выделение ДНК из препаратов вируса.

К 0,5 см вирусной суспензии в буфере ТЕ (20 мМ Трис, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА) добавляли протеиназу К (100 мкг/см) и инкубировали 30 мин при температуре 56° С. Затем в эту смесь добавляли 10% раствор ДСН до конечной концентрации 0,5% и выдерживали при температуре 56° С в течение 20 мин. К суспензии добавляли равный объем 80% свежеперегнан-иого фенола (рН 8,0) и осторожно смешивали водную и фенольную фазы. Разделение фаз осуществляли центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 5 мин. Водную фазу, содержащую ДНК, осторожно отбирали и повторно обрабатывали фенолом и смесью фенол: хлороформ в том же режиме. ДНК переосаждали 2,5 объемами перегнанного этанола при -20° С. По лученные препараты ДНК хранили при -20° С.

2.22. 1 ¡-остановка ПНР.

Пробу исследуемой ДНК в объеме 10 мкл амплифицировали в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1 тМ каждого праймера, 200 мкМ каждого dNTP, 10 тМ Tris НС1 (рН 8,3), 50 тМ КС1, 3,0 тМ MgCl2 и 2,5 ед. Taq-полимеразы. Амплификация гтроходила в термоциклере Hybaid (Англия) но следующим программам: 3 цикла (денатурация ДНК при 94° С — 30−00 сек, отжиг ДНК при 50−60° С — 30−90 сек, синтез при 72° С — 60−90 сек), следующие 30 циклов (денатурация при 94° С — 30 сек, отжиг при 50°.

С — 40 сек, синтез при 72° С — 50 сек). Аликвоты ПЦР продуктов объемом 5−10 мкл разделяли в 2,0% агарозном геле.

Учет результатов амплификации проводили при помощи электрофореза в агарозпом геле по размеру ГЩР-продуктов. Сравнивая размеры и расстояния пробегов маркерных ДНК (рестрикцированная Hind III ДНК фага лямбда), и полученных ПЦР продуктов вычисляли размеры исследуемых фрагментов ДНК (9, 75). Работу с использованием ПЦР проводили совместно со ст. науч. сотр. лаб. биофизики ВНИИИиМ Цыбановой JI. Я. 2.23. Статистическия обработка результатов исследований.

Все опыты ставили с числом повторпостей (>3), обеспечивающих получение достоверных результатов. Цифровые данные подвергали статистической обработке величин и их ошибок (Меркурьев Е.К., 1979; Урбах В. Ю., 1975; Лакин Г. Ф., 1980). Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стью-дента — Фишера, согласно которому для большинства биологических экспериментов уровень вероятности Р>0,05, свидетельствует об отсутствии закономерных отличий между сравниваемыми величинами.

При разработке компьютерной программы для определения активности вируса в вакцине против БМ иммуноферментным методом был использован пакет прикладных программ Microsoft Developer Studio. Для аппроксимации результатов вычислений применяли математический метод наименьших квадратов. Молекулярные массы белков в препаратах IgG находили после построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы по статистической обработки Stargraff.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Аффинная хроматография. Методы. / Под ред. П. Дина, У. Джонсона, Ф. Мидла. М.: Мир, 1988, 278 с.
  2. И.В., Хлопина А. Ф., Придыбайло Н. Д. Определение клеточного иммунного ответа при болезни Марека. // Тез. докл. конф. по птицеводству. Сергиев Посад: 1995, с. 101−102.
  3. Вирусология. Методы. / Под ред. Б.Мейхи. М.: Мир, 1988, 344 с.
  4. Выделение и использование апатогенных штаммов вируса болезни Марека второго серотипа. / Лукина В. А. и др. // Сб. Производство и контроль мед., вет. препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ. п. Вольгинский: 1999, с.48−49.
  5. Э., Медьеши Г., Верцкеи JI. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. // М.: Мир, 1982, с 214−224.
  6. М. Диагностика болезни Марека с использованием ДНК зондов. // Птицеводство, № 2. М.: 1996, с 27−28.
  7. A.C., Титов И. Н. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных. М.: 1971, с. 136−141.
  8. Е.В., Сатина Т. А. Вирусные болезни кур. // Из кн.: Ветеринарные аспекты вет. паталогии животных. Владимир: 1998, с.128−146.
  9. Э.Д., Кудрявцев Ф. С., Кожемяка Н. В. Эффективность вакцинации против болезни Марека. // Ветеринария, № 9. М.: 1999, с. 28−30.
  10. Диагностическая ценность ускоренного иммуноферментного метода. /В.А.Мищенко, М. Г. Костюченко, А. Б. Смирнов и др. // Сб. Вирусные и микробные бол. жив-х. Владимир: 1995, с. 143−146.
  11. М.С., ГТрибытько С.П. Иммуноморфологические реакции в крови и органах цыплят, вакцинированных против БМ совместно с иммуностимулятором натрия тиосульфатом. // Ученые записки Витебской гос. акад. вет. мед. — Витебск: 1994, т.31, с. 93−96.
  12. Иммунология. / Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1987, т. З, 360 с.
  13. Клонирование и секвенирование генов, кодирующих гликопротеины, А и В-антигенов онкогенного штамма Jm вируса болезни Марека. / Бедристов А. И., Бахтина М. М. и др. // Молек. генет., микробиол. и вирус. № 3. 1996, с. 6−11.
  14. Р.И., Зеленский В. П. Болезнь Марека, лейкоз и саркома птиц. // Метод, рекомендации. JI.: 1989, с. 5−32.
  15. Р.И., Придыбайло И. Д. Основы профилактики болезни Марека // Тез. докл. конф. по птицеводству. Сергиев Посад: 1995, с.99−100.
  16. В.А. Разработка иммуноферментного анализа для изучения свойств вируса герпеса индеек. // Тез. докл. 4-й Всесоюз. конф. «Научн. основы технологии промышленного произв. вет. биол. препаратов». -М.: 1991, с. 107- 108.
  17. В.А. Теоретические и экспериментальные предпосылки изготовления moho-, би- и поливалентной вакцины против болезни Марека. // Тез. докл. научно-произв. конф. «100 лет Курской биофабрике и агробиопромышленности России». Курск: 1996, с. 1841 89.
  18. Е.В., Панферова С. М., Бойко A.A. Сравнительная характеристика препаративных методов очистки антивидовых иммуноглобулинов.// Передовой научно-произв. опыт в биологической промышленности. М.: 1985, № 8, с. 34−36.
  19. Г. П., Лукина В. А., Дьяконов Л. П. Методические указания по концентрированию вируса герпеса индеек из безклеточных препаратов вакцины против болезни Марека. -М.: 1981, 8 с.
  20. .П. Болезнь Марека у цыплят первых дней жизни. / Из докладов ВАСХНИЛ, 1991, № Ю, с. 53−54.
  21. C.B., Андреев В. Г., Куляшбекова Ш. К., Гусев A.A. Использование метода полимеразной цепной реакции для детекции и гепогипирования вируса болезни Марека. // Современные аспекты ветеринарной патологии животных, Владимир, ВНИИЗЖ, 1998, с. 159 167.
  22. Н.Д., Коровин Р. Н., Афанасьева Г. Е. Эффективность сочетанного применения вакцины против болезни Марека и иммуномодулятора тималина. // Вестн. с.-х. науки, 1991, № 7, с. 136 138.
  23. Производственные испытания экспериментальных серий бивалентной вакцины из штаммов FC-126 и SB-1. / Куляшбекова Ш. К., Гусев A.A., Родичкин В. И. // Тез докл. конф. «Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных». Владимир: 1997, с. 154−155.
  24. Специфическая профилактика и механизм иммунитета при болезни Марека. /Лукина В.А., Демидов Л. Н. и др. // Из сб. Курская биофабрика. -К.: 1996, с. 422−451.
  25. Способ повышения биологической активности и иммуногенных свойств производственного штамма FC-126 вируса герпеса индеек./ Куляшбекова Ш. К., Гусев A.A. и др. // Кн.: Современные аспекты вет. патологии животных. Владимир: 1998, с. 146−151.
  26. Способ получения антигена вируса болезни Марека. / Писеева Г. П., Лукина В. Л., Кузнецов П. П., Дьяконов Л. П. // Авторское свидетельство № 1 034 232, 08.04.1983.
  27. Справочник ветеринарного врача. / Составитель Кунаков A.A. М.: Колос, 1996, с. 127−129.
  28. В.Н., Белоусова Р. В., Фомина Н. В. / Болезнь Марека // Кн.: Диагностика вирусных болезней животных. Справочник. М.: Агропромиздат, 1991, с. 101−116.
  29. В.Н., Самуйленко, А .Я., Соловьев Б. В., Фомина Н. В. Болезнь Марека. // Кн.: Вирусные болезни животных. М.: ВНИТИБП, 1998, с. 689−690.
  30. В.Н., Белоусова Р. Н., Фомина Н. В. Семейство герпесвирусов. // Кн.: Ветеринарная вирусология. -М.: 1991, с. 362−365.
  31. И.П. Модель фенотипической классификации герпесвирусных частиц. // Ветеринария, № 7. М.: 1993, с. 24−25.
  32. И.П., Джавадов Э. Д. Тонкослойный иммуный анализ для выявления миелинспецифических антител в сыворотке крови кур при болезни Марека. // Ветеринария, № 4. М.: 1992, с. 29−31.
  33. Ультразвуковой фонофорез. / Акопян В. Б., Рыхлецкая О. С. и др. // Птицеводство, № 7. -М.: 1991, с. 35.
  34. Л.Д., Мазуренко Н. И., Виноградов В. И. Изучение свойств штамма Кекава вируса болезни Марека в опытах на цыплятах. // Вопросы вирусологии, № 5. -1973, с. 588.
  35. Е.И., Шкварчук Т. Я., Бойко A.A. Получение антисыворотки к JgG желтка кур. // Бюллетень ВИЭВ им. Коваленко Я. Р. Выпуск № 68. -М.: 1988, с, 43−45.
  36. A bivalent vaccine consisting of chinese strain of serotype 2 virus Z4 and FC-126 against Marek’s disease: experimental studies and field trials. // X.1.u, R. Zhang et al. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p.305−309.
  37. Aly M.M., Fadly A.M., Witter R.L. Effects of serotype 2 Marek’s disease virus on development of viremia, antibody and lymphoma induced by reticuloendotheliosis virus. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam. 1992, p. 272−276.
  38. Analysis of transcriptional and translational activities of Marek’s disease (MD) virus genes in MD central nervous system lesions in chickens. / K.-O. Cho- D. Endoh- M. Onuma- C. Itakura. // Avian Pathology. V.28. — N.l. -2000, p. 47−53.
  39. Antigenic variability of Marek’s disease vaccine viruses. / Lukina V.A., Yarigina E.I., Bikova N.N., Samulenko A.Y.// 26-th World Veterinary Congress WSA, Franse, Lyon, http: w.w.w. mondiavet-99, com.
  40. Bacon L.D., Witter R.L. Influence of B-haplotype on the relative efficacy of Marek’s disease vaccines of different serotypes. // Avian Disease. V.37. -1993, p. 53−59.
  41. Bacon L.D., Witter R.L. B-haplotype influence on the relative efficaci of Marek’s disease vaccines in commercial chickens. // Poultry Sci. V.73. -N.4.- 1994, p. 481−487.
  42. Becker Y. Comparative molecular biology of alphaherpesviruses: genes involved in virus pathogenicity. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p. 104−107.
  43. Bradley G., Hayashi M. Structure of the MDY BAM HI-H gene family: A gene potentially important for tumor induction. // In B.: Advances in Marek’s Disease Research. 1989, p. 69−75.
  44. Brunovskis P., Chen X. and Velicer L.F. Anakysis of Marek’s Disease virus glycoprotein D, I and E. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p. 118−121.
  45. Brunovskis P., Velicer L.F. The Marek’s disease virus (MDV) unigue short region: Alphaherpesvirus homologous, fowlpoxvirus — homologous and MDV — specific genes. // Virology. — V.206. -N.l. — 1995, p.324−338.
  46. Brunovskis P., Velicer L.F. Genetic organization of the Marek’s Disease virus unigue short region and identification of Us-encoded polypeptides. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p.74−79.
  47. Bulow Won, Biggs P.M. Differentiation between strain of Marek"s disease virus and turkey herpesvirus by immunofluorescense assays. // Avian Pathol.-N.4. 1975, p. 133−162.
  48. Bumstead N., Silibourne J., Rennie M., Ross N., Davison F. Quantification of Marek’s -Disease Virus in Chicken Lymphocytes Using the Polymerase Chain Reaction with Fluorescence Detection. // J. Virol. Methods, 1997, 65, p. 75−81.
  49. Calnek B.W. Lymphomagenesis in Marek’s disease. // Avian Pathol. Oxfordshire: Carfax Pablishing Company. V.27., 1998, p. 54−64.
  50. Calnek B.W., Adldinger N.K. and Kahn D.E. Feather follicle epithelium: A sourse of enveloped and infections cell-free herpesvirus from Marek’s disease. //Avian Dis. -N.14., 1970, p. 219−233.
  51. Calnek B.M., Harris R.W. Relationship between the immonosupressive potential and the pathotype of Marek’s disease virus isolates. // Avian Disease. V.42. — 1998, p.124−132.
  52. Calnek B.W., Witter R.L. Marek’s disease. // In: «Disease of poultry», 9-th -1991.
  53. Central nervous system lesion induced experimentally by a very virulent strain of Marek’s disease virus in Marek’s disease resistent chickens. / Cho. -K.O., Endoh. D., Qian. — J.F. et al. // Avian Pathol. — V.27 (5). — Oct. 1998, p.512−517.
  54. Churchill A.E., Biggs P.M. Agent of Marek’s disease in tissue culture. // Nature. N.215. 1967, p. 528−530.
  55. Coman T., Coman S. Determination of the apathogenecity of Marek’s disease herpesvirus SB-1 strain after succesive passages in chicken embryo fibroblasts. // Arch. Vet. N.19. — 1990, p.93−102.
  56. Coman T., Coman S. Study on the morphological modification induced by the apathogenic Marek’s disease herpesvirus SB1 strain in cell cultures. // Arch. Vet. 19 II.- 1990, p. 103−111.
  57. Comparison of glycoprotein D (gD) genes of Marek’s Disease virus and Herpesvirus of turkeys. / Zelnik V., Ross L.J.N., Smith G.D. et al. // In: 19th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p. 114−117.
  58. Cui Z., Qin A. and Lee L.F. Expression and processing of Marek’s disease virus pp 38 gene in insect cells and immunological characterization of the gene product. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam -1992, p. 123−125.
  59. Cui Z., You Y. and Lee L.F. Indentification and localization of the Marek’s disease virus group-common antigen p79 gene. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V. 1. Amsterdam 1992, p.89−92.
  60. Dandapat S. Anti-idiotype antibodies to Marek’s disease associated tumour surfase antigen in protection against Marek’s disease. // Vet. Immunology and Imtnunopathology. — N.40. — 1994, p. 353−366.
  61. Davidson I., Becker Y., Malkinson M. Virus neutralization domains on the oligomeric (230 kDa) forms of antigen B herpesvirus turkeys and Marek’s disease virus in cross-serotypic activity. // J. Vet. Med. B. — V.42. -1995, p. 100−109.
  62. Davidson I., Borovskaya A. and Malkinson M. Use of the polymerase chain reaction for the diagnosis of natural infection of chickens and turkeys with Marek’s disease virus and reticuloendotheliosis virus. // Avian Pathology. -N.24. 1995, p. 69−94.
  63. Davidson I., Tanaka Akiko, Novoyama M. Common antigenic epitopes are present on heat-labile oligomers of MDV glycoprotein B and on HSV glycoprotein B. // Virus Res. V. 35. — N.3. — 1995, p.233−245.
  64. Delecluse H.-J. and Hammershmidt W. Status of Marek’s disease virus in established Lymphoma cell lines: Herpesvirus integration is common. // J. Virologc, Jan. 1993, p. 82−92.
  65. Detection of poultry infection with the virus of Marek’s disease using different laboratory methods. / Gagic M., Durisis S. et al. // Acta Vet. V.45. — N.2−3. — 1995, p. 127−135.
  66. Efficacy and safety of recombinant fowl pox Marek’s disease vaccine. / Kinney N., Page D., Taylor J. et al. // Zootecnica — International. — V.18. -N.9. — 1995, p. 32−33.
  67. Enhanced expression of Marek’s disease virus specific phosphoproteins afler stable transfection of MSB-t cells with Marek’s disease virus homologue of ICPU. / Pratt W.-D., Cantello J., Morgan R.W., Sehat K.A. // Virology.-V.201.N.1.- 1994, p. 132−141.
  68. Expression and purification of recombinant Marek’s disease virus serotype 1 specific phosphorylated protein pp 38 in E. Coli. / Endoh D., Niikura M. et al. // J. Vet. Med. Sei. V. 56. -N.5. — 1994, p. 823−826.
  69. Expression Marek’s disease virus (MDV) serotype 2 gene with has partial homology with MDV serotipe 1 pp 38 gene. / Oho M., Maeda M.K., Kawaguchi Y. Et al. //Virus. Res. V.35. — N.2. — 1995, p. 223−229.
  70. Expression of Marek’s disease virus genes in recombinant fowlpox vims and protection of chickens against MD. / Nazerian K., Yanagida N., Lee L.F. et all. // in: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p.136−139.
  71. Expression of the A antegen (gp 57−65) of Marek’s disease virus by recombinant baculovirus. / Niikura M., Matsuura Y. et al. // J. Gen. Virol. -V.72.- 1991, p. 1099−1104.
  72. Gavora J.S. Genetic aspect of interactions between Marek’s disease viruses and their hosts. 11 In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam -1992, p. 175−180.
  73. Gene indentification and effective expression of Marek’s disease virus B antigen (gp 100, gp 60, gp 49). / Niikura M., Matsuura Y., Endoh D., Okuma M. and Mikami T. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam -1992, p. 100−102.
  74. Genetics and vaccines for the future countrol of Marek’s disease. / Witter R.L., Bacon L.D., Hunt H.D. and Cheng. // Proc. Annual nat., beeders round table. S. l .1994, p.90−96.
  75. Gingerich E. Tools for controlling Marek’s disease. // Egg. Ind. V. 95. N.3. — 1989, p. 29.
  76. Hong Y., Frame M., Conssens P.M. A 14-kDa immediate-early phosphoprotein in specifically expressed in cells infected with oncogenic Marek’s disease virus strains and their attenuated derivatives. // Virology. -V. 206. N. 1. — 1995, p. 695−700.
  77. Isolation from turkeys of a cell-associated herpesvirus antigenically related to Marek’s disease virus. / Witter R.L., Nazerian K. et al. // Am. J. Vet. Res. V.31. -1970, p. 525−538.
  78. Isolation of serotype 1 Marek’s disease viruses from vaccinated Australian floks./ De Laney D.B. et al. // Veter. Microbiol. V. 46. — N. l/3 — 1995, p. 213−219.
  79. Istort J.R., Kung H., Velicer L.F. Indentification of the gene encoding Marek’s disease herpesvirus A antigen. // J. Virol. V. 61. — N.8. — 1987, p. 2614−2620.
  80. Kawamura II., King D.J. and Anderson D.P. A herpesvirus isolated from kidney cell culture of normal turkeys. // Avian Dis. Y.13. — 1969, p. 853 863.
  81. Kazuhiro Nakajima. Syntesis and processing of a gp 28/32 membrane glycoprotein induced by Marek’s disease virus serotype 2. // J. of General Virology. -V.71.- 1990, p. 1807−1810.
  82. Kreager K.S. Chicken industry strategiens for countrol of tumor virus infections. // Poultry- sci. Savoy, IL: V. 77(8). Aug. 1998, p. 1213−1216.
  83. Kross I., Davis P.J., Shilleto R.W. Isolation of highly cytolytic MDV strains from Germany and Spain. // Avian Pathol. V.27(3). — June 1998, p. 313−315.
  84. Lee L.F. and Witter R.L. Humoral immune responses to inactivated oil-emulsitied Marek’s disease vaccine. // Avian Disease. -N.35. 1991, p. 452 459.
  85. Liberona P. Marek’s disease vaccine still a treat! // Poultry adv. -V.XXIII. -N.l. 1990, p. 65−69.
  86. Lin J.A., Tsong-Shymen Lee. Genetic susceptibility to Marek’s disease virus of local chickens in Taiwan. // Avian Disease. V.40. — 1996, p. 576 581.
  87. Lindenmaier W., Bauer H.J. Cosmid Cloning and Restriction-Endonuclease Mapping of the Herpesvirus of Turkeys (Hvt) Genome. // Arch. Virology, 1994, 135, p. 171−177.
  88. Malkinson M., Davidson I. and Becker Y. A novel immunological approach to the structure and function of antigen B. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p. 239−241.
  89. Marek’s disease: a comprehensive view. / Prajapat K.S., Joshi B.P. et al. // Poultry Guide. V.27. — N. l2. — 1990, p. 67−72.
  90. Marek’s disease field experience and vaccination strategies. // Poultry International. — N. l 1. — 1993, p. 33−36.
  91. Molecular analysis of the glycoprotein C negative phenotype of attenuated Marek’s disease virus. / Wilson M.R., Southwick R.A. et al. // Virology. V.199. — N.2. — 1994, p. 393−402.
  92. Nagang G., Kharole M.U. Effects of levamisole on the efficacy of turkey herpesvirus vaccine against Marek’s disease. // Indian J. Virol. V.ll. -N.I.-1995, p. 13−22.
  93. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase labelled antibodi: a new methods of conjugation. // J. Histochem. Cytochem. — V.22. — N.12. — 1974, p. 10 841 091.
  94. Nazerian K., Burmester B.R. Electron microscopy of a herpesvirus associated with the agent of Marek’s disease in cell culture. // Cancer Res. -V.28.- 1968, p. 2454−2464.
  95. Nazerian K., Witter R.L., Lee L.F. Protection and synergism by recombinant fowl pox vaccines expressing genes from Marek’s disease virus. // Avian Disease. V 40. — 1996, p. 368−376.
  96. New vaccine for old problem. // International Poultry Production. V.3. -N.6. — 1995, p. 17−19.
  97. Ono M. Preparation of monoclonal antibodies against Marek’s disease virus serotype 1 glycoprotein D expressed by a recombinant baculovirus. // Virus Res. V.38. — N.2−3. — 1995, p. 219.
  98. Palya V. Manual for the production of Marek’s disease, Gumboro disease and Newcastle disease vaccines. 1989, p. 3−54.
  99. Parcells M.S., Anderson A.S., Morgan R.W. Retention of oncogenicity by Marek’s disease virus mutant lacking six unigue short region genes. // J. Virology. V.69. — N. 12. — 1995, p. 888−898.
  100. Polymerase chain reaction analysis of MDV-1 DNA. / Becker Y., Asher Y. et al. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p.216−219.
  101. Powell P.C., Lombardini F. Progress in vaccination against Marek’s disease. // Clin. Vet.-V. 110.- N.I.- 1987, p. 36−41.
  102. Preparation of monoclonal antibodies against Marek’s disease virus serotype 1 glycoprotein D expressed by a recombinant baculovirus. / Mitsuru O., I iyung-Kwan, Ken M. et al. // Virus Res. V.38. -N.2−3. — 1995, p. 219 230.
  103. Protection against Marek’s disease by fowlpox virus recombinant expressing the glycoprotein B of Marek’s disease virus. / Nazerian K., Lee L.F. et al. // J. Virol. V.66. — 1992, p. 1409−1413.
  104. Protection studies against Marek’s disease using baculovirus-expressed glycoproteins B and C of Marek’s disease virus type 1. / Jang H.-K., Kitazawa T., Ono M. et al. // Avian Pathology. V.25. — N.l. — 1996, p. 525.
  105. Rapid detection and titration of Marek’s disease virus vaccine on CER-cell line. / Wassel M.S., Suzan E.-M. et al. // Serum and vaccine Res. Instr. ARC, Abbasia, Cairo, ARE 1996.
  106. Relationship between the immusuppressive potential and the pathotype of Marek’s disease virus isolates. / Calnek,-B.W., Harris,-R.W., Buscaglia,-C. et al. // Avian Dis. Kennett Sguare, Pa. V.42(l). — Jan./Mar. 1998, p. 124−132.
  107. Rodriguez J.M. Detection of Animal Pathogens by Using the Polymerase Chain Reaction. // Vet. J., 1997, 153, p. 287−305.
  108. Ross L.J.N. Recombinant vaccines against Marek’s disease. // Avian Pathol. Oxfordshire: Carfax Publishing Company. V.27. (Suppl 1) — Apr. 1998, p. 865−873.
  109. Ross I., Miln B., Biggs P. Restriction endonuclease analysis of Marek’s disease virus DNA and homology between strains. // J. Gen. Virol., 1993, 64, p. 2785−2790.
  110. Sarma G. Field trial and immunogenecity studies on the polyvalent Marek’s disease vaccines in chickens. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam. 1992, p. 310−314.
  111. Schat K.A., Taylor R.L., Jr., Briles W.E. Resistance to Marek’s disease in chickens with recombinant haplotypes of the major histocompatibility (B) complex. // Poultry Science. N.73. — 1994, p. 502−508.
  112. Schat K.A., Calnek B.W. Characterization of an apparently nononcogenic Marek’s disease virus. // J. Natl. Cancer Inst. V.60. — 1978, p. 1075−1082.
  113. Shat K.A. Immune responses against Marek’s disease virus. // In: 19-th World s Poultry Congress. V.l. Amsterdam. — 1992, p. 233−238.
  114. Scholten P., Hilgert L.A.T. Detection of Marek’s disease virus antigen in chickens by a novel immunoassay. // J. Virol. Meth. V.27. — N.2. — 1990, p. 221−226.
  115. Serotype-specific polypeptides of Marek’s disease virus identified by monoclonal antibodies reactive in enzyme-linked immunosorbent assay. / Lee L.F., Ren D., Li Y. and Sui D. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam. 1992, p. 127−130.
  116. Shapiro D. Practical advice on Marek’s vaccination. // Egg. Ind. V.96. -N.2.- 1990, p. 28−29.
  117. Shunsuke Yachida. Comparative studies on antigens induced by Turkey Herpesvirus and Marek’s disease virus. 1. Agar gel precipitation and neutralization studies. //Zbl. Vet. Med. B. 30 1983, p.609−618.
  118. Significance of Marek’s disease virus serotype 1-specific phosphorylated proteins in Marek’s disease skin lesions. / Cho K.-O., Endon D., Kimura T. et al. // Avian Pathology V.26. — 1997, p. 707−720.
  119. Silva R.F. Differentiation of Pathogenic and Nonpathogenic Serotype-Marek's Disease Viruses (Mdvs) by the Polymerase Chain-Reaction Amplification of the Tandem Direct Repeats within the MDV Genome. // Avian Diseases, 1992, 36, p. 521−528.
  120. Silva R.F., Galvert EG., Lee L.F. A simple immunoperoxidase plague assay to detect guantitate Marek’s disease virus plagues. // Avian Disease. -V.41. 1997, p. 528−534.
  121. Silva R.F. and Barnett J.C. Restriction endonuclease analysis of Marek’s disease virus DNA differentiation of viral strains and determination of passage history. // Avian Disease. 1991, p. 487−495.
  122. Sithole I., Coussens P.M., Lee L.F. Identification of Marek’s disease herpesvirus B antigen’s precursor polipeptide and the gene encoding it. // In B.: Advances in Marek’s disease research. 1989, p. 148−154.
  123. Strivastava R.N., Raushik A.K., Prasad S. Enzymelinked immunosorbent assay of serum antibodies of Marek"s disease virus in vaccinated chickens. // Acta Virol. V.26. — 1982, p. 302.
  124. Syngeneic lysis of reticuloendotheliosis virus transformed cell lines transfected with Marek’s disease virus genes by virus — specific cytotoxic T cells. / Zehava U., Pratt W.D. et al. // Vet., Immunol, and Immunopathol. -V.44. — 1994, p. 57−69.
  125. The early pathogenesis in chickens inoculated with non-pathogenes serotype 2 Marek’s disease virus. / Lin J.A., Kodoma H. et al. // J. Vet. Med. Sei. -V.53. -N.2. 1991, p. 269−273.
  126. The use of blood from selected chickens as an immunizing agent for Marek’s disease. / Zander D.V., Hill R.W. et al. // Avian Dis. V.16. — 1972, p. 163−178.
  127. Use of recombinant pp 38 antigen Marek’s disease virus to identify serotype 1-specific antibodies in chickens sera by Western blotting. / Li D.S., Green P.F., Skinner M.A. et al. // J. Virol. Meth. -V.50. N. l-3.- 1994, p. 185−196.
  128. Uspjesnost uzg oja tovnin pilica vakciniranin protiv Marekove bolestiuz visestruku upotrebu stelje. / Nemarnik D., Mazija H. et al. // Praxis Veter. -V.40.-N.2. 1992, p. 159−173.
  129. Venugopal K., Payne L.N. Molecular pathogenesis of Marek’s disease -recent development. // Avian Pathol. V.24. — N.4. — 1995, p. 597−609.
  130. Wilson M.R., Tieber V.L. Molecular basis for reduced expression of glycoprotein C (GP 57−65) in attenuated Marek’s disease virus. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V.l. Amsterdam. 1992, p. 108−111.
  131. Witter R.L., Lee L.F., Sharma. Biological diversity among serotype 2 Marek’s disease viruses. // Avian Disease. V.34. — 1990, p. 944−957.
  132. Witter R.L. Very virulent Marek’s disease viruses: importance and control. // World’s Poultry. V.45. — N.l. — 1989, p. 60−65.
  133. Witter R.L. Low enhancement serotype 2 vaccine for Marek’s disease. // United States Department of Agriculture patents. Washington. — Oct. 15. -1996, (5,565,202) 1 p.
  134. Witter R.L., Lee L.F. Polyvalent Marek’s disease vaccines. Safety, efficacy and protective synergism in chickens with maternal antibodies. // Avian Pathol. V.13. — 1984, p. 75−92.
  135. Witter R.L., Silva R., Lee F.L. New serotype 2 and attenuated serotype 1 Marek’s disease vaccine viruses: selected biological and molecular characteristics. // Avian Dis. V.31. — 1987, p. 829−840.
  136. Witter R.L. Attenuated reventant serotype 1 Marek’s disease virus: safety and protective efficacy. // Avian Dis. V.3. — 1991, p. 877−891.
  137. Witter R.L. Recent development in the prevention and control of Marek’s disease. // In: 19-th World’s Poultry Congress., V. 1. Amsterdam. 1992, p. 298−304.
  138. Witter R.L. Very virulent Marek’s disease viruses: impotance and control. // World’s Poultry. -V.45. -N.l. 1989, p. 60.
  139. Witter R.L. Attenuation of lymfoid lenkosis enhancement by serotype 2 Marek’s disease virus. // Avian Pathology. V.24. — 1995, p. 665−678.
  140. Witter R.L. Increased virulence of Marek’s disease virus field isolates. // Avian Dis. -V.41.-N.l. 1997, p. 149−163.
  141. Wu P., Lee L.F., Reed W.M. Serological characteristics of membrane glycoprotein gp 82 of Marek’s disease virus. // Avian Dis., Kennett Sguare, Pa: American Association of Avian Pathologists Inc. V.41(4). — Oct./Dec. 1997, p. 824−831.
  142. Wu C.X., Zhang R.K., Liu X.F. Comparative efficacy trials of different dose proportions of the component viruses in the Marek’s disease bivalent vaccine Z4+FC-126. // Acta Vet. Zootechsin. V.25. — N.3. — 1994, p. 279 283.
  143. Jurajda V., Halouzka R. Incolace a studium biologickych viastnosti neonkogennich nukecich herpesvirus markovy nemoci. // Veter. Med., Praga. -N.9−10. 1992, p. 535−542.
  144. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК
  145. ВСЕРОССИЙСКИЙ НА УЧНО-ИССЛЕДОВА ТЕЛЬСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
  146. Утверждаю ор ВНИТИБП респондент РАСХМ А.Я. Самуйленко2000 г.
  147. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ ДНК ВИРУСА БОЛЕЗНИ МЛ РЕКА С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗИОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ1. ЩЕЛКОВО -2000 г.
  148. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК
  149. ВСЕРОССИЙСКИЙ И, А УЧПО-ИССЛЕДОВА ТЕЛЬСКМЙ ТЕХНОЛОГИ ЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
  150. УТВЕРЖДАЮ: Директор ВНИТИБП1. ГРр^шеспондент РАСХИ1. Самуйлепко А.Я.2000 г. 1. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
  151. ПО ПРИМЕНЕНИЮ КОМПЬЮТЕРНОЙ ПРОГРАММЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ВИРУСА В ВАКЦИНЕ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МА РЕКА ИММУНОФЕРМЕИТНЫМ АНАЛИЗОМ1. Щелково 2000 г.
Заполнить форму текущей работой

Пора сдавать?