Теоретические основы поиска плотностно-зависимых факторов в микробных сообществах

Актуальность темы

исследования Одной из важных проблем экологической биофизики является изучение биофизических механизмов, регулирующих численности видов и структуру сообщества. Глубокие теоретические разработки в этой области существенно стимулируются практическими задачами, такими, как направленное изменение и управление видовым составом экосистем, искусственное создание новых сообществ с заданной видовой структурой, оценка границ устойчивости сообщества к веществам антропогенного происхождения, прогноз последствий состояния экосистем при различных внешних нагрузках и другими (Одум, 1975).

Названные вопросы актуальны и по отношению к сообществам микроорганизмов, которые с возрастающей интенсивностью используются в различных отраслях микробиологической промышленности. Даже культивирование (нестерильное) монокультуры фактически является культивированием сообщества микроорганизмов. Понятно, что для получения продукта заданного качества или для увеличения эффективности процесса поликультура должна иметь определенный видовой состав, управлять которым нельзя, не зная законов формирования и механизмов регуляции структуры сообщества. При этом из-за сложности поведения смешанных культур использование математических моделей для описания и предсказания поведения культуры приобретает важное значение.

В решении этих задач наиболее интегративным и мощным оказался метод математического моделирования, особенно в исследовании водных экосистем (Свирежев, 1978). Вне зависимости от применяемого математического аппарата и цели работы создаваемая модель должна учитывать характерные, специфические свойства изучаемого объекта. Именно знание специфических закономерностей взаимодействий в сложной системе, «вложенное» в соответствующую модель, приводит к пониманию и установлению законов динамики более высокого иерархического уровня. Такой путь исследования («снизу») с физической точки зрения не нов и является достаточно реальным при моделировании сообществ будь то естественный водный биоценоз или смешанная проточная культура микроорганизмов.

Понятно, что натурной информации о динамике естественного объекта недостаточно для точного однозначного установления характера взаимодействий и понимания динамики системы на основе моделирования. Проблему адекватного моделирования можно было бы решить в сочетании с экспериментальными методами физического масштабирования. Однако, в отличие от чисто гидрофизических натурных наблюдений вряд ли возможно промасштабировать взаимодействие гидрофизических, химических и биологических процессов (Айзатулин, Лебедев, 1977).

Поэтому пока наиболее реальный путь взаимодействия экспериментальных и теоретических методов — это выделение отдельных процессов и элементов или их небольших сочетаний и экспериментирование с ними в строго контролируемых и управляемых условиях с последующей интеграцией данных в модели (Никоноров, Трунов, 1985). Однако, на этом пути исследователи сталкиваются с трудностями следующего характера. Казалось бы, как и в физике, возможно проведение парно-популяционных экспериментов и из этих знаний возможно «конструирование» всех взаимодействий в сообществе микроорганизмов. Такова, например, методология оценки (расчета) гравитационных сил, действующих на какое-либо тело от всех окружающих его тел. При этом известно, что включение в систему взаимодействующих тел еще одного тела не меняет силы взаимодействий между исходными телами. В биофизике сообществ этот тезис (фактически о суперпозиции сил) не имеет места: интродукция новой микробной популяции может привести не только к изменению «силы» взаимодействия между исходными популяциями, но даже изменить «знак» взаимодействия. Поэтому изучение взаимодействий необходимо проводить в целом сообществе, что принципиально усложняет задачу. Такое различие связано с тем, что физическое тело — это элементарное тело, состояние которого описывается массой, а популяция — не элементарная единица взаимодействия, которая имеет много состояний и может их изменять.

Одним из немногих экспериментальных методов, позволяющих количественно исследовать взаимодействия в микробных сообществах является способ непрерывного культивирования. Непрерывный процесс по сути имитирует свойство открытости реальных экосистем по отношению к потоку вещества и энергии. Селективная или неизбирательная элиминация членов сообщества физически моделирует отбор (смертность). Различная интенсивность обмена в системах идеального перемешивания определяет градации турбулентности, позволяя исключить из рассмотрения пространственную неоднородность и изучить вклад только биологических взаимодействий. Список возможностей таких систем может быть продолжен.

Таким образом, исследование взаимодействия популяции со средой в простейших лабораторных экосистемах одного трофического уровня является первым и естественным шагом на пути к пониманию законов функционирования природных биоценозов (по крайней мере — водных).

Кроме исследований природных экосистем существует область, для которой непрерывная культура микроорганизмов представляет собой основной объект изучения — это научная база различных отраслей биотехнологии, от простого производства биомассы до очистных сооружений. Здесь особенно актуальным является применение знаний, полученных при исследовании лабораторных микробных сообществ.

Цели и задачи работы. Целями настоящей работы являлись теоретический анализ модели микробного сообщества в хемостате, направленный на развитие методики выявления плотностно-зависимых факторов в таких сообществах, и экспериментальная апробация развиваемой методики на простом лабораторном объекте — непрерывно-проточной монокультуре микроорганизмов.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать динамику стационарных уровней плотностно-зависимых факторов в модели хемостатного сообщества для случая нелинейных функций удельных скоростей роста популяций.

2. Теоретически разработать схему проведения экспериментов в хемостате, позволяющую определять коэффициенты чувствительности стационарных концентраций химически неидентифицированных компонент и метаболитов к изменениям их входных концентраций.

3. Теоретически проанализировать изменения стационарных уровней плотностно-зависимых факторов в хемостате, вызванные изменениями кинетических характеристик сообщества (в результате микроэволюции сосуществующих видов или интродукции новых видов в систему).

4. Экспериментально выявить плотностно-зависимые факторы в хемостатной монокультуре, определив коэффициенты чувствительности стационарных концентраций компонент в культуральной среде к изменениям их входных концентраций.

Научная новизна и практическая значимость работы.

1. В предлагаемой работе на основе теоретического анализа общей модели сообщества с произвольным видом зависимостей удельных скоростей роста от факторов среды доказано свойство «квантования» коэффициентов чувствительности плотностно-зависимых факторов, контролирующих рост и данного сообщества. Это свойство было ранее доказано только для модели хемостата с линейными зависимостями скоростей роста, причем линейное приближение сильно ограничивало адекватность модели. В настоящей работе показано, что данное оригинальное свойство является на самом деле более общим, и следует ожидать его выполнения в реальных экспериментах с большей достоверностью, чем это предполагалось ранее.

2. Впервые предложена оригинальная схема проведения экспериментов с хемостатными культурами, позволяющая определять коэффициенты чувствительности неидентифицированных компонент среды, а следовательно — выявлять контролирующие факторы среди таких компонент. Основную идею, благодаря которой это становится возможным, составляет процедура рециркуляции фильтрата культуральной среды, разработанная в настоящей диссертации.

Кроме того, предложенная схема экспериментов с рециркуляцией фильтрата позволяет определять коэффициенты чувствительности веществ метаболитной природы, которые в принципе отсутствуют в составе питательной среды, но могут тем не менее являться «внутренними» факторами-регуляторами для сообщества.

3. Впервые предложен метод определения важных ростовых характеристик — коэффициентов трансформации и приспособленности сосуществующих в хемостате видов без вмешательства в структуру сообщества, а только на основе измерения концентраций компонент системы в стационарных состояниях. Предложенный экспериментальный метод определения характеристик отдельных видов в сообществе может применяться к исследованию сообществ в биотехнологических установках и природных водных экосистемах.

4. Впервые получена оценка направления изменения фоновых уровней факторов-регуляторов в хемостате со многими лимитирующими факторами в результате микроэволюции сосуществующих или интродукции новых видов в систему.

5. Впервые экспериментально измерены коэффициенты чувствительности для двух химических факторов, являющихся компонентами среды реальной конкретной системы — хемостатной монокультуры дрожжейи таким образом выяснена роль каждого из исследованных веществ в данной системе на основе биофизического подхода, развиваемого в настоящей работе.

6. Создан комплект управляющих программ для лабораторной малой автоматизированной системы управления культивированием микроорганизмов «ЛАМУС», работа которой осуществляется на релейном принципе управления.

7. На основе численного эксперимента с моделью двух стационарно сосуществующих популяций исследованы границы применимости релейного способа управления скоростью протока и продемонстрирована возможность практического применения указанного способа к культивированию монои смешанных культур (с учетом области устойчивости последних).

Полученные в диссертации научные результаты позволили сформулировать положения, выносимые на защиту:

1. Эффект «квантования» суммы коэффициентов чувствительности плотностно-зависимых факторов среды, контролирующих рост микробных популяций в хемостате, доказанный на основе теоретического анализа модели хемостата для любого произвольного вида функций скоростей роста.

2. Универсальный метод определения коэффициентов чувствительности неидентифицированных компонент и метаболитов в хемостате, основанный на рециркуляции фильтрата культуральной среды.

3. Правило изменений стационарных концентраций плотностно-зависимых факторов в хемостате за счет микроэволюционных или сукцессионных переходов в сообществе: невозможны однонаправленные изменения стационарных концентраций всех плотностно-зависимых факторов в том случае, когда эти факторы имеют однотипный характер отношений с популяциями (т.е. одинаковый «знак» связей «концентрация фактораудельная скорость роста»).

Апробация работы и публикации Материалы диссертационной работы докладывались на международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды» (г. Томск, сентябрь 1995), международном симпозиуме «Environment and Interaction». (г. Порто, Португалия, ноябрь 1996), на семинарах Института биофизики СО РАН.

По теме диссертационной работы опубликованы 6 печатных работ (две статьи и 4 тезиса докладов на конференциях), еще одна работа находится в печати.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, списка литературы и приложений. Общий объем работы в 112 страниц (основной текст — 82 страницы) включает 7 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемой литературы насчитывает 79 наименований (50 русских и 29 иностранных).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

1. Доказана теорема о «квантовании» суммы коэффициентов чувствительности для модели хемостата с произвольным видом функций удельных скоростей роста популяций от факторов среды. Сумма коэффициентов чувствительности всех плотностно-зависимых факторов в модели хемостата равна разности числа этих факторов и числа сосуществующих в хемостате популяций. Данное соотношение сохраняется при любом виде функций удельных скоростей роста.

2. Теоретически разработана схема проведения экспериментов в хемостате, позволяющая определять коэффициенты чувствительности неидентифицированных химических компонент среды и метаболитов. Предлагается использовать фильтрат культуральной жидкости для изменения входных концентраций всех химических компонент среды, что позволяет избежать равенства нулю детерминанта системы линейных уравнений, из которой вычисляются коэффициенты чувствительности.

3.Теоретически показано, что при одновременном действии нескольких плотностно-зависимых факторов, имеющих однотипные отношения с популяциями, результат микроэволюционного процесса при сосуществовании, или сукцессии при внедрении другого вида, не приводит к одновременному снижению фоновых уровней факторов в среде, а должны наблюдаться их разнонаправленные изменения. Случай обязательного разнонаправленного «сдвига» фоновых уровней плотностно-зависимых факторов является одной из закономерностей в динамике стационарных состояний открытых лимитированных веществом биологических систем. Вопрос об общем критерии эволюционирования таких систем остается открытым.

4. В непрерывно-проточной культуре дрожжей Candida utilis экспериментально определены коэффициенты чувствительности двух компонент среды — глюкозы и ионов водорода. На основании величин коэффициентов чувствительности выявлена роль каждой из компонент в данной системе. В зависимости от условий культивирования плотностно-зависимыми факторами являлись либо только энергетический субстратглюкоза, либо глюкоза и ионы водорода одновременно.

5. Экспериментально продемонстрировано, что коэффициент трансформации по некоторым факторам (в нашем случае — по ионам водорода) может изменяться в ответ на изменение условий культивирования. Подобные изменения «искажают» значение коэффициента чувствительности по данному фактору, что вносит неопределенность в оценку его роли в исследуемой системе.

Работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Рогозин Д. Ю., Дегерменджи А. Г. Теория поиска плотностных биохимических факторов поддержания биоразнообразия в микробных сообществах.// Докл. АН. — 1995, — 345, N 1. С. 127−129.

2. Рогозин Д. Ю., Дегерменджи А. Г., Адамович В. В. Теория динамики и микроэволюции плотностно-зависимых факторов в микробном сообществе. Докл. АН. — 1998. т. 359, N 2.

3. Рогозин Д. Ю., Дегерменджи А. Г., Адамович В. В. Поиск плотностных химических факторов, контролирующих динамику биологических компонент водной экосистемы. // Тезисы докладов международной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы охраны окружающей среды». 12 -16 сентября 1995 г., Томск. С. 101−102.

4. Degermendzhy A.G., Rogozin D.Y., Adamovitch V.A. The biophysical principles of coexistence of microbial populations in aquatic ecosistems // Fifth SETAC — Europe Congress, Copenhagen 25 — 28 June 1995, Abstracts, P 249.

5. Degermendzhy A.G., Adamovitch V.V., Rogozin DY. Density-dependent growth factors and the laws of organization of the stable microbial water community: хЦ theory and experiments // 4 International Conference on Aquatic Ecosystem Health, May 14 — 18 1995, Coimbra, Portugal, Abstracts, P — 7.

6. Rogozin D.Y., Degermendzhy A.G., Adamovitch V. Interactions between microbial populations through density-dependent chemical factors // International Symposium and Workshop «Environment and Interaction», Porto, Portugal, 18−19 November 1996. Proceedings, P — 28.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В настоящей работе сделаны некоторые шаги в направлении дальнейшего развития биофизического подхода к исследованию надорганизменных систем — в частности, лабораторных малых экосистем, являющихся модельным аналогом водных сообществ микроорганизмов одного трофического уровня.

Биофизический подход состоит в использовании математической модели в качестве инструмента для получения истинного знания об исследуемом биологическом объекте. Важным этапом такого исследования является сопоставление расчета с экспериментом, т. е. проверка пригодности модели. Именно здесь находится «узкое место», сдерживающее развитие количественного анализа. Действительно, составить математическое описание, записать математическую модель, как правило, намного легче, чем ее проверить. Отражением этой ситуации является наличие большого числа математических моделей динамики популяций микроорганизмов, из которых лишь единицы подвергались экспериментальной проверке после того, как модель была построена (Печуркин Н.С., Брильков A.B., 1980). Гораздо чаще модель должна «проваливаться», по крайней мере, модифицироваться, чем подтверждаться. Таким образом, процесс разработки эвристической модели выглядит как итерационный, многоступенчатый, но именно так идет накопление знания об объекте, приближение к истине. Одна «итерация» такого процесса сопоставления модели и эксперимента была проделана в настоящей работе.

Если модель обладает некоторыми нетривиальными свойствами (например, эффектом «квантования» коэффициентов чувствительности компонент, описанным в работе), неизбежно возникает вопрос: в какой степени данное свойство справедливо для реальной системы? В данной работе сделан шаг в направлении обобщения модели хемостата, а именно — «уход» от линейного приближения в описании скоростей роста популяций. Очевидно, что нелинейность по скоростям роста усиливает адекватность модели, и следовательно — ее предсказательную способность. Тот факт, что свойство «квантования» остается справедливым и для модели с обобщенной формой записи функций скоростей роста, дает еще больше оснований предполагать, что данная тенденция будет проявляться и в реальных сообществах.

Другой значительной идеализацией модели является линейность по функциям трансформации компонент среды растущей биомассой. Действительно, эффект «квантования» справедлив только в предположении постоянства коэффициентов трансформации. Как было экспериментально показано в настоящей работе, в действительности такое приближение не всегда справедливо. Поэтому, дальнейшее обобщение модели хемостата на случай нелинейности по трансформации представляется перспективным в плане поиска закономерностей организации подобных систем.

В рамках проделанной экспериментальной работы справедливость эффекта «квантования» коэффициентов чувствительности плотностно-зависимых факторов была подтверждена лишь частично. Однако, наиболее ценным результатом экспериментальной проверки является то, что продемонстрирована ограниченность применимости такого подхода (основанного на измерениях чувствительности факторов к возмущениям их входных уровней) к получению знаний о структуре сообществ.

Подход к исследованию сообщества в хемостате, развиваемый в настоящей работе, основан на фундаментальном свойстве плотностно-зависимых контролирующих рост факторов — эффекте аутостабилизации. Качественное проявление этого эффекта как тенденции является наиболее общим свойством открытых систем. Однако, при попытке решения обратной задачи — выяснения внутренней структуры «черного ящика» — исследователь сталкивается с необходимостью постулировать некоторые свойства его внутренней организации. Поэтому при разработке количественных методов «расшифровки» взаимодействий внутри системы на основе анализа внешних измеряемых величин (в нашем случае — концентраций химических веществ и биомассы) мы вынуждены изначально предполагать заведомо упрощенную структуру сообщества и линейность основных его функций. Однако, такой шаг является единственно возможным, если учесть всю сложность взаимодействий в реальных системах и недостаточность наших знаний о них.

Рассмотренный в работе вопрос о микроэволюционных изменениях в хемостате представляет интерес как один из частных случаев общей картины эволюции открытых систем. Существует предположение, что глобальным критерием, задающим направление всех эволюционных переходов, происходящих в биосфере, является увеличение потока энергии, приходящегося на единицу биологической структуры (Печуркин, 1982). В качестве одной из иллюстраций данного критерия приводится экспериментально полученная картина микроэволюционных переходов в хемостате, когда эволюционирующая популяция постепенно снижает остаточный уровень энергетического субстрата в среде, тем самым увеличивая поток используемой энергии.

В настоящей работе теоретически показано, что в случае многофакторной системы, когда имеется несколько субстратов, невозможно одновременное снижение их остаточных уровней. Следовательно, если предположить, что данные субстраты являются источниками энергии, то для такой системы нельзя делать вывод об однозначном увеличении потока используемой энергии — по крайней мере, в результате «единичного» шага микроэволюции. В целом, однако, общие критерии эволюционных изменений в отдельных экосистемах представляют интерес для дальнейших теоретических исследований.