Актуальность проблемы. Наряду с обычными моноклональными антителами (МКА) гибридомная технология позволяет получать биспецифические антитела (БИАТ), несущие места связывания двух различных антигенов [Milstein and Cuello, 1983]. Для получения клонов-продуцентов БИАТ (квадром, тетрадом или триом) сливают две гибридомы (или, в другом варианте, гибридомы и иммунные лимфоциты), которые секретируют различные МКА. В гибридных гибридомах синтезируются легкие (L) и тяжелые (Н) цепи родительских AT и происходит их рекомбинация, в результате чего может образовываться до десяти видов AT, включая БИАТ (рис. 1, А). Несмотря на кажущуюся простоту описанного механизма, многие аспекты процесса образования AT в квадромах остаются неизученными. Прежде всего, это касается факторов, определяющих качественный и количественный состав AT, секретируемых гибридными гибридомами. Исследования по изучению связывания Н и L цепей in vitro [De Preval and Fougereau, 1976; Hamel et al., 1986; Hamel et al., 1987] свидетельствуют, что легкие цепи от двух разных антител могут конкурировать за связывание с одной тяжелой цепью, причем аффинности при связывании могут отличаться более чем на порядок. Таким образом, связывание легких цепей с тяжелыми может быть как случайным (при одинаковой аффинности легких цепей в отношении тяжелой), так и предпочтительным (если одна из легких цепей демонстрирует более высокую аффинность в отношении тяжелой цепи). Подобные механизмы ассоциации легких и тяжелых цепей могут иметь место и в гибридных гибридомах [Milstein and Cuello, 1984]. Важнейшим фактором, влияющим на состав AT (и долю БИАТ), является, по-видимому, способ ассоциации L и Н цепей в гибридных клетках. При случайной рекомбинации должно образовываться много гетерологичных H-L пар, в которых L и Н цепи происходят от-разных родительских AT (см. рис. 1, Аварианты VIII-X). Как правило, плечо AT, образованное сочетанием гетерологичных H-L цепей не обладает АГ-связывающей активностью. В противоположность этому, предпочтительная ассоциация гомологичных L и Н цепей (то есть, цепей, происходящих от одного родительского МКА), теоретически должна способствовать более высокому выходу БИАТ. Изучение взаимодействия L и Н цепей в квадромных клетках и продуктов этого взаимодействия — квадромных AT, осложняется недостаточной разработкой методов анализа иммуноглобулинов, образуемых гибридными гибридомами. Секретируемые антитела представляют собой смесь близких по молекулярному весу и физико-химическим свойствам молекул, поэтому их анализ оказывается достаточно сложной задачей. В особенности это относится к количественным аспектам популяций квадромных AT, которые практически не анализировались. Вместе с тем, вопрос о том, какой тип ассоциации цепей превалирует в квадромах, и как это отражается на составе секретируемых AT, представляет большой теоретический и практический интерес. В теоретическом плане этот вопрос тесно связан с проблемой разнообразия AT. Известно, что одним из факторов, определяющих разнообразие антител, является характер ассоциации L и Н цепей. Сформулирована гипотеза о том, что предпочтительная ассоциация гомологичных L и Н цепей может быть следствием процессов, направленных на отбор высокоаффинных H-L пар во время созревания В-клеток «in vivo» [Preval and Fougereau, 1976]. Существование такого механизма предполагает значительное уменьшение числа потенциально возможных «природных» AT за счет ограничения H-L комбинирования в популяциях лимфоцитов. С практической точки зрения важно то, что предпочтительная ассоциация.
А. СЛУЧАЙНАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ ЛЕГКИХ И ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ Y ^ • y.
Бифункциональные антитела.
•V, А: / ^.
II III IV.
Антитела к антигену 1.
YYY.
V VI VII.
Антитела к антигену 2.
•' Ч—.
VIII IX X.
Неактивные антитела.
Б. ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНАЯ АССОЦИАЦИЯ ГОМОЛОГИЧНЫХ L-H ЦЕПЕЙ.
Y Y.
Анти-АГ].
БИАТ.
Анти-АГ2.
В. ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНАЯ АССОЦИАЦИЯ H-L ЦЕПЕЙ У АНТИТЕЛ К АНТИГЕНУ 1.
Анти-АГ j БИАТ Неактивные AT Анти-АГ2.
Рисунок 1. Изоформы антител, образуемых гибридными гибридомами при различных типах ассоциации легких и тяжелых цепей повышает эффективность квадром как продуцентов БИАТ.
С типом взаимодействия L и Н цепей тесно связан и вопрос об антигенсвязывающих свойствах как обычных МКА, так и наиболее интересного (с точки зрения биотехнологии) продукта секреции гибридных гибридом — БИАТ. Высказывалось предположение, что предпочтительная ассоциация гомологичных H-L цепей приводит к образованию высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов [Hamel et al., 1986, 1987]. Таким образом, если соотнести тип ассоциации Н и L цепей (случайный или предпочтительный) с аффинностью антигенсвязывающих сайтов антител, то можно подтвердить или опровергнуть высказанную гипотезу.
Теоретически, родительские МКА и соответствующее плечо БИАТ имеют одинаковую структуру АГ-связывающих центров (см. рис. 1) и, как следствие, должны проявлять одинаковые АГ-связывающие свойства. Вместе с тем, продемонстрирована возможность сохранения АГ-связывающей активности при сочетании гетерологичных H-L цепей. Образовавшийся при этом АГ-связывающий сайт сохраняет активность AT, от которых происходит Н цепьправда, аффинность таких AT значительно уменьшается [Hudson et al., 1987]. Это может приводить к возникновению «аномальных» БИАТ с измененными АГ-связывающими центрами. Кроме того, в рекомбинантных AT могут наблюдаться нарушения гликозилирования иммуноглобулиновых цепей и конформационные изменения, влияющие на связывание с АГ. Таким образом, встает вопрос: в какой мере АГ-связывающие центры БИАТ, получаемых с помощью биологического метода, сохраняют аффинность родительских AT. Сведения об этом весьма ограничены: подробное исследование АГ-связывающих свойств БИАТ, полученных с помощью гибридизации клеток, было проведено в единственной работе [Allard et al., 1992].
Антитело Антиген Бифункциональное.
Рисунок 2. Связывание моноклональных (монофункциональных) и бифункциональных антител с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. а — моновалентное связывание антител с иммобилизованным антигеномб — бивалентное связывание антител с иммобилизованным антигеномв — связывание бифункциональных антител с иммобилизованным антигеном (может быть только моновалентным).
Весьма важным как с практической, так и с теоретической точки зрения является проблема взаимодействия БИАТ с антигенами, адсорбированными на твердой фазе. Молекула иммуноглобулина класса IgG, несет два АГ-связывающих сайта и может связываться с антигеном, адсорбированным на твердой фазе, как одним АГ-связывающим сайтом (моновалентно, см. рис. 2, а), так и двумя АГ-связывающими сайтами одновременно (бивалентно, см. рис 2, б). БИАТ несут два АГ-связывающих сайта к различным антигенам и, таким образом, могут связываться с адсорбированным АГ только моновалентно (см. рис. 2, в). Очевидно, что бивалентное связывание с антигенами существенно прочнее, чем моновалентное, таким образом, в любом варианте связывания с иммобилизованным антигеном обычные МКА должны быть результативнее БИАТ. Однако большой массив публикаций свидетельствует о высокой эффективности БИАТ в иммуногистохимии, иммуноблоттинге и при взаимодействии со злокачественными клетками. Вместе с тем, отсутствуют теоретические работы, в которых бы корректно сравнивались свойства моновалентных (т.е. БИАТ) и бивалентных антител (обычных МКА) при связывании с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Следовательно, утверждения о высокой эффективности БИАТ в сравнении с обычными МКА представляются весьма спорными. На наш взгляд, для окончательного вывода требуется сравнительный анализ эффективности связывания МКА и БИАТ, несущих тождественные сайты связывания с АГ, с иммобилизованным антигеном. Кроме того, необходим сравнительный анализ эффективности детектирующих моноклональных AT (конъюгатов) и БИАТ, несущих сайт связывания с ферментом, в твердофазном ИФА.
Итак, актуальным является анализ механизмов образования AT в гибридных гибридомах и изучение АГ-связывающих свойств БИАТ как в растворе, так и при взаимодействии с иммобилизованными антигенами. В настоящей работе предпринята попытка исследовать некоторые из этих вопросов, используя панель тетрадом, продуцирующих антитела к антигенам, которые значительно отличаются по структуре и молекулярному весу. Анализируемые МКА и БИАТ несли сайты связывания со следующими АГ: эндорфином (М^бОО), миоглобином (Мг" 18 600), пероксидазой хрена (Мг"40 000) и IgG человека (Мг" 160 000).
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы — анализ взаимодействия БИАТ с антигенами (как в растворе, так и при иммобилизации АГ на твердой фазе), а также разработка экспериментальных подходов, позволяющих проводить количественный и качественный анализ продуктов секреции гибридных гибридом и расшифровывать способ ассоциации L и Н цепей в гибридных клетках.
В задачи работы входило:
I. Проанализировать характер ассоциации легких и тяжелых цепей антител (случайный или предпочтительный), синтезируемых гибридными гибридомами. Для определения типа ассоциации легких и тяжелых цепей:
1) Разработать теоретические модели рекомбинации L и Н цепей в гибридных гибридомах, позволяющие предсказывать типы антител, образуемых квадромой, в зависимости от способа ассоциации (случайного или предпочтительного) легких и тяжелых цепей.
2) Количественно проанализировать продукты секреции квадромы, (бифункциональные антитела, антитела к каждому из антигенов и неактивные антитела (рис. 1, А)), разработав методы фракционирования антител и их количественного анализа.
3) Определить цепьевой состав антител, продуцируемых квадромами (легкие и тяжелые цепи антител), с помощью двумерного электрофореза.
4) Путем сопоставления экспериментальных и теоретических распределений антител и результатов электрофоретического анализа цепьевого состава антител определить способ ассоциации L и Н цепей в квадромных клонах.
И. Соотнести истинную аффинность родительских антител и аффинность тождественных антигенсвязывающих сайтов бифункциональных антител:
1) Определить истинную аффинность (равновесную константу ассоциации в растворе) при взаимодействие бифункциональных антител с антигенами различного молекулярного веса в растворе. Сравнить аффинность родительских антител с аффинностью тождественного антигенсвязывающего сайта биспецифических антител.
2) Определить, каким образом избыток одного из антигенов влияет на связывание бифункциональных антител со вторым антигеном в растворе и, таким образом, сделать вывод о наличии (или отсутствии) кооперативного эффекта при взаимодействии антител с антигенами.
3) Соотнести тип ассоциации Н и L цепей (случайный или предпочтительный) в антигенсвязывающих сайтах антител с аффинностью этих антигенсвязывающих сайтов и подтвердить (или опровергнуть) гипотезу о том, что предпочтительная ассоциация гомологичных Н и L цепей приводит к образованию высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов.
III. Для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) апробировать новую модель: соотнести параметры связывания родительских антител и тождественного антигенсвязывающего сайта бифункциональных антител. Для анализа характера взаимодействия использовать антитела к антигенам различного молекулярного веса и структуры: миоглобину (Мг"18 600), пероксидазе хрена (Мг"40 000) и IgG человека (Мг"160 000). Для определения характера взаимодействия антител с сорбированным антигеном использовать как традиционные методы (радиоиммунологический и твердофазный ИФА), так и анализ с помощью оптического биосенсора IAsys. Соотнести результаты, полученные обоими методами.
IV. Проанализировать относительную эффективность бифункциональных антител, несущих сайт связывания с тестируемым антигеном и пероксидазой в сравнении с традиционными конъюгатами антител с пероксидазой, как детектирующих молекул в твердофазных тестах (твердофазный иммуноферментный анализ и сэндвич-метод).
Научная новизна и научно-практическая значимость исследования. В результате проведенного исследования были впервые количественно проанализированы популяции антител, синтезируемых квадромой. Также впервые проведен анализ H-L состава квадромных антител с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле. Для БИАТ со специфичностью анти-ЭНД/ПХ убедительно доказано наличие гомологичного предпочтения в одной из H-L пар и случайную рекомбинацию в другой. Разработанные в настоящей работе оригинальные экспериментальные подходы и теоретические модели расширяют возможности анализа квадромных антител и механизмов, управляющих образованием этих антител в квадромных клетках. Кроме того, анализ аффинности БИАТ, образованных квадромой, показал, что истинная аффинность любого антигенсвязывающего сайта БИАТ нашей панели тождественна истинной аффинности соответствующих антигенсвязывающих сайтов родительских антител.
Продемонстрировано отсутствие кооперативного эффекта при связывании БИАТ с антигенами. На панели бифункциональных антител показано, что избыток одного из антигенов не влияет на связывание (аффинность) БИАТ со вторым антигеном. Впервые продемонстрировано in vivo (на уровне тетрадом, синтезирующих антитела), что предпочтительная ассоциация гомологичных H-L цепей AT не приводит к образованию высокоаффинных антигенсвязывающих сайтов.
Впервые для оценки характера взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном использована модель, которая предполагает сравнительный анализ параметров связывания родительских моноклональных антител (могут связываться с иммобилизованным антигеном моновалентно и бивалентно) и бифункциональных моноклональных антител, несущих тождественный сайт связывания с антигеном (могут связываться с иммобилизованным антигеном только моновалентно). Характер взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном проанализирован как классическими методами (радиоиммунологическим и твердофазным ИФА), так и с помощью оптического биосенсора IAsys. Показано, что оба метода дают идентичные результаты. Сделан вывод о перспективности биосенсорных систем для оценки взаимодействия антиген-антитело.
Впервые проведен сравнительный анализ эффективности двух типов меченых молекул антител: антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (традиционного конъюгата) и бифункциональных антител, несущих тождественный сайт связывания с тестируемым антигеном и пероксидазой хрена (БИАТ, как меченые молекулы часто называют конъюгатами нового поколения). Сделан вывод об относительной неэффективности БИАТ, как меченых молекул в твердофазных тестах. Доказано, что наиболее корректной моделью для оценки наличия (или отсутствия) бивалентного связывания МКА с иммобилизованным антигеном является сравнительный анализ ассоциации родительских МКА и соответствующего АГ-связывающего сайта БИАТ. Сделан вывод об относительной неэффективности БИАТ, как меченых молекул в твердофазных тестах. Полученные результаты могут представлять интерес для возможного использования этого нового класса биомолекул.
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
В настоящем обзоре мы кратко опишем историю создания БИАТ и области их применения, отсылая, в основном, к обзорным статьям, опубликованным за последние 10 лет. Относительно полно будут освещены только проблемы, которые составляют предмет наших исследований. Акцент будет сделан на моноклональных бифункциональных антителах, получаемых с использованием гибридомной технологии. Мы опишем методы получения клонов-продуцентов БИАТ, механизмы ассоциации L и Н цепей в гибридных гибридомах, механизмы взаимодействия антител с антигенами (включая антигены, иммобилизованные на твердой фазе) и применение БИАТ в качестве меченых антител в твердофазном ИФА.
VI. выводы.
I. Для изучения характера ассоциации легких и тяжелых цепей антител (случайного или предпочтительного) использована гибридная гибридома (квадрома), в которой кодоминантно экспрессируются легкие и тяжелые цепи антител к эндорфину и пероксидазе хрена.
1) Разработаны теоретические модели рекомбинации L и Н цепей в гибридных гибридомах, позволяющие предсказывать типы антител, образуемых квадромой, в зависимости от способа ассоциации (случайного или предпочтительного) легких и тяжелых цепей.
2) Разработаны методы количественного определения типов антител, образуемых гибридными гибридомами. Для определения цепьевого состава антител впервые предложен метод двумерного электрофореза.
3) Доказано, что в квадроме 40E9x36F9, продуцирующей бифункциональные антитела со специфичностью антиэндорфин/антипероксидаза, Н и L цепи антиэндорфиновых антител ассоциируются предпочтительным образом, в то время как Н цепи антипероксидазных антител одинаково эффективно ассоциируются с L цепями как антиэндорфиновых, так и антипероксидазных антител. Таким образом, оба типа ассоциации Н и L цепей — случайный и предпочтительный имеют место в данной квадроме.
4) Показано, что предпочтительная ассоциации Н и L цепей в гибридных гибридомах не является обязательной для образования активного антигенсвязывающего сайта. Таким образом, разнообразие антител не ограничено, существованием такого механизма.
5) Предложены практические рекомендации по получению квадром — эффективных продуцентов бифункциональных моноклональных антител.
II. Показано, что уровень секреции антител родительскими гибридомами (антиэндорфиновой — 40Е9 и антипероксидазной 36F9) не обязательно наследуется тетрад омой (40E9x36F9, специфичностьантиэндорфин/антипероксидаза).
III. Сравнительный анализ истинной аффинности родительских антител и аффинности тождественных антигенсвязывающих сайтов бифункциональных антител позволил доказать:
1) Истинная аффинность (равновесная константа ассоциации, определяемая при связывании антител с антигеном в растворе) родительских антител равна аффинности тождественных антигенсвязывающих сайтов бифункциональных антител (на панели антител к антигенам различного молекулярного веса и структурыэндорфину (Мг"1700), пероксидазе хрена (Мг"40 000) и IgG человека (Мг"160 000).
2) Для бифункциональных антител со специфичностью антиэндорфин/антипероксидаза и анти-Ь^О/антипероксидаза продемонстрировано, что избыток одного из антигенов не влияет на аффинность бифункциональных антител в отношении второго антигена. Таким образом, кооперативный эффект при связывании бифункциональных антител с антигенами (с Mr"1700, Mr"40 000 и Мг"160 000) отсутствует.
3) Впервые продемонстрировано in vivo (на клеточном уровне), что тип ассоциации L и Н цепей (случайный или предпочтительный) никак не связан с аффинностью антигенсвязывающего сайта. Низкоаффинный антигенсвязывающий сайт (например, сайт связывания с эндорфином у антител 40Е9) может быть образован в результате предпочтительной ассоциации L и Н цепей.
IV. Для определения типа взаимодействия антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное) впервые предложена новая модель: сравнительный анализ параметров связывания родительских антител и тождественного антигенсвязывающего сайта бифункциональных антител. Проанализировано взаимодействие антител с иммобилизованными антигенами различного молекулярного веса и структуры: миоглобином (М, л*18 600), пероксидазой хрена (Мг"40 000) и IgG человека (Мг"160 000). Анализ проведен двумя независимыми методами: радиоиммунологическим и с помощью оптического биосенсора IAsys.
1) Доказано, что радиоиммунологический метод и метод с использованием оптического биосенсора IAsys дают тождественные параметры связывания антител с иммобилизованным антигеном.
2) Доказано, что антимиоглобиновые и антипероксидазные антитела связываются с антигеном, иммобилизованным на поверхности иммунных планшетов, преимущественно двумя антигенсвязывающими сайтами одновременно (бивалентно). Вместе с тем, антитела к IgG человека связываются с иммобилизованным антигеном только одним антигенсвязывающим сайтом (моновалентно).
3) Доказано, что бифункциональные антитела взаимодействуют с антигеном, иммобилизованным на твердой фазе, существенно менее эффективно, чем родительские монофункциональные.
V. Исследована эффективность бифункциональных антител, несущих сайт связывания с тестируемым антигеном и пероксидазой хрена, как детектирующих молекул в твердофазных тестах (твердофазный иммуноферментный анализ и сэндвич-метод).
1) Доказано, что бифункциональные антитела, несущие сайт связывания с миоглобином и пероксидазой хрена, взаимодействуют с миоглобином, иммобилизованным на твердой фазе, существенно менее эффективно, чем антимиоглобиновые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена.
2) Доказано, что при тестировании миоглобина сэндвич-методом бифункциональные антитела, несущие сайт связывания с миоглобином и пероксидазой хрена, не дают выигрыша в чувствительности в сравнении с антимиоглобиновыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена.
II.8.
Заключение
.
Выход БИАТ и их антигенсвязывающие свойства могут определяться механизмом рекомбинацией Н и L цепей антител в гибридных гибридомах. Предпочтительная рекомбинация гомологичных Н и L цепей способствует увеличению выхода БИАТ относительно других продуктов секреции квадромы и приводит к образованию антигенсвязывающих сайтов БИАТ, которые идентичны таковым родительских МКА. В этой связи весьма важным является вопрос о том, насколько часто рекомбинация Н и L цепей происходит случайным или предпочтительным образом. Не менее важным как с практической, так и с теоретической точек зрения является и проблема идентичности антигенсвязывающих свойств БИАТ таковым родительских антител. В исследовании этих проблем существенным является корректный анализ антител, продуцируемых каждой квадромой. Пока существуют только единичные работы, посвященные исследованию этих вопросов [De Lau et al., 1991; Allard at al., 1992; Auriol et al., 1994]. Аффинность БИАТ может зависеть от конформационных изменений структуры молекулы, связанных с сочетанием гетерологичных (относящихся к разным субклассам IgG) Н цепей и наличия или отсутствия кооперативного эффекта при связывании антител с антигенами. При анализе антигенсвязывающих свойств МКА актуальны следующие вопросы. Во-первых, — наличии или отсутствии кооперативного эффекта при связывании антител с антигенами. Во-вторых, определение истинной аффинности антител в растворе (аффинности отдельно взятого антигенсвязывающего сайта). В третьих, исследование характера связывания антител с иммобилизованным антигеном (моновалентное или бивалентное). При решении этих вопросов до сих пор, за немногими исключениями, сравнивались параметры связывания нативных AT и их F (ab) фрагментов. Подобное сравнение нельзя признать достаточно корректным, так как нативная молекула IgG в сравнении F (ab) фрагментами является гораздо более жесткой структурой. Моноклональные БИАТ являются более удобной моделью для исследования этих вопросов, так как, во-первых, сравниваются АГ-связывающие свойства одного из плеч БИАТ с таковыми родительских МКА, и, во-вторых, о наличии кооперативного эффекта можно судить, оценивая параметры связывания одного из антигенов в присутствии избытка второго. Пока опубликована только одна работа, посвященная данной проблеме [Allard at al., 1992]. Кроме того, БИАТ, структура которых (исключая структуру вариабельной части молекулы одного из антигенсвязывающих сайтов) тождественна структуре молекул родительских AT, являются идеальной моделью для изучения связывания антител с иммобилизованным антигеномв том числе и вопроса о наличии бивалентного связывания. Весьма актуален и вопрос о сравнительной эффективности БИАТ, несущих сайт связывания с тестируемым антигеном и ферментом, как меченых антител в твердофазных тестах. Решению этих проблем посвящено настоящее исследование.
III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
III.I. Получение клонов-продуцентов моноклональных антител.
При выполнении настоящего исследования были получены клоны-продуценты моноклональных антител к следующим антигенам: пероксидазе хрена, IgG человека, эндорфину человека и миоглобину человека. Мышей линии Balb/c иммунизировали либо одним из упомянутых антигенов (15−20 мкг/мышь), либо, в случае эндорфина человека, антигеном, который был ковалентно связан (конъюгирован) с белком-носителем — бычьим сывороточным альбумином. Раствор антигена в 0,15 М NaCl эмульгировали с полным (первая иммунизация) или неполным (последующие иммунизации) адъювантом Фрейнда. При иммунизации эмульгированный антиген вводили в 6−8 точек подкожно. Общее число иммунизаций варьировало от 4 до 6. За четыре дня до слияния мышь с наибольшим титром антител к антигену в крови (определяли с помощью иммуноферментного метода) получала ежедневные инъекции 100 — 200 мкг антигена в 0,15 М NaCl (внутрибрюшинно). Гибридомы получали по методу Келлера и Милыптейна [Kohler and Milstein, 1975], путем гибридизации спленоцитов иммунной мыши с клетками миеломы мыши Х-63о.
Ag.8.653. К осадку клеток, содержащему 10 лимфоцитов селезенки и 107 миеломных клеток добавляли по каплям в течение 45 секунд 1,5 мл 45%-ного раствора полиэтиленгликоля (Мг"1500) в буфере состава: 0,8% NaCl, 0,04% КС1, 0,177% NaH2P04. H20, 0,2% глюкозы, 0,01% фенолового красного и 10% диметилсульфоксида. В течение последующих 90 секунд объем смеси доводили тем же буфером до 50 мл. Далее суспензию клеток инкубировали 10 минут при комнатной температуре и переносили клетки на селективную среду HAT содержащую 10″ 4 М гипоксантина, 1,6×10″ 5 М тимидина и 4×10″ 5 М аминоптерина и высевали в 96 луночные планшеты по 1,2×105 клеток в лунку. Клоны тестировали на наличие антител к антигену с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ИФА) (см. ниже). Для получения асцитной жидкости клетки клонированных (не менее трех раз) гибридом прививали в брюшную полость мышей линии BALB/c.
III.2. Очистка моноклональных антител с помощью ионообменной хроматографии. Антитела очищали с помощью ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефарозе. Асцитную жидкость (5−10 мл) центрифугировали (2000xg, 20 мин, 0°), супернатант разводили в 5 раз 0,025 М Ыа-фосфатным буфером с 0,15 М NaCl (ФС-буфер) и высаливали антитела добавлением сульфата аммония — 0,4 г/мл. Антитела осаждали центрифугированием (2000xg, 20 мин, 0°) и растворяли в 0,025 М Tris-HCl буфере, рН 9. Раствор диализовали против того же буфера в течение ночи и наносили на колонку с ДЕАЕ-сефарозой-4 В размером 1,6×20 см, уравновешенную 0,025 М Tris-HCl-буфером, рН 9. На колонку наносили от 100 до 500 мг белка. Элюцию проводили градиентом NaCl: 0−0,3 М в том же буфереобъем градиента — 500 мл, скорость элюции 30 мл/час. Фракции пиков пулировали и определяли антигенсвязывающую активность антител (см. ниже).
III.3. Определение антипероксидазной активности антител. Антипероксидазную активность антител определяли двумя методами. Полоски иммунных планшетов (Госниимедполимер, Россия) насыщали ПХ (Calbiochem, Rz>3,0) в течение ночи при комнатной температуре (10 мкг/мл в 0,05 М карбонатном буфере, рН 9,5- 100 мкл раствора на лунку). Готовили разведения антител в концентрациях: 1, 2, ., 4096 нг/мл. Антитела растворяли в буфере состава: 0,025 М Na-фосфатный буфер рН 7,4 с 0,15 М NaCl, 0,2% БСА и 0,05% твином 20 (ИФА-буфер). После четырех — пяти отмывок дистиллированной водой планшеты последовательно инкубировали при 37 °C с разведениями антител (3 часа, 100 мкл на лунку), антимышиными овечьими антителами, мечеными биотином (Sigma, 0,7 мкг/мл в ИФА-буфере, 100 мкл на лунку, 1 час) и авидином, конъюгированным со щелочной фосфатазой (Sigma, 0,5 мкг/мл в ИФА-буфере, 100 мкл на лунку, 1 час). Цветную реакцию проводили с гексагидратом /?-нитрофенилфосфата натрия (PNPP). PNPP (1 мг/мл) растворяли в 9,7% диэтаноламиновом буфере, с 0,01% MgCl2, рН 9,8. Буфер доводили до рН 9,8 с помощью 1 N НС1. Инкубация (100 мкл на лунку) продолжалась 30 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 2N NaOH (50 мкл на лунку). Поглощение регистрировали на плашечном сканере Labsystems при 405 нм.
Второй метод тестирования антипероксидазной активности антител основан на том, что связывание с антителами клона 36F9 не влияет на активность фермента. Полоски иммунных планшетов насыщали аффинно-очищенными AT кролика к IgG мыши (10 мкг/мл в 0,1 М карбонатном буфере рН 9,5- 100 мкл на лунку) в течение ночи при комнатной температуре. Далее планшеты инкубировали 2,5 часа с антипероксидазными антителами (0,1 — 1 мкг/мл, 100 мкл на лунку) в присутствии пероксидазы хрена (5 мкг/мл). Антитела и пероксидазу растворяли в ИФА-буфере). После каждой инкубации планшеты споласкивали 4−5 раз дистиллированной водой. Ферментативную реакцию проводили 20−30 минут при комнатной температуре, используя в качестве субстрата о-фенилендиамин (ОФД), 1 мг/мл в 0,05 М цитратно-фосфатном буфере (ЦФБ) рН 5, в присутствии 0,03% Н202, (100 мкл раствора на лунку). Реакцию останавливали добавления в лунки 50 мкл 1,5 М H2SC>4. Планшеты сканировали на плашечном спектрофотометре фирмы Labsystems при длине волны 472 нм.
III.4 Определение антигеисвязывающей активности антител.
При определении антигеисвязывающей активности антител иммунные планшеты насыщали антигеном (эндорфином, миоглобином или hlgG) в течение ночи при комнатной температуре (2−10 мкг/мл в 0,05 М Na-карбонатном буфере рН 9,5- 100 мкл раствора на лунку). Далее планшеты инкубировали с тестируемыми антителами в концентрации 0,5−10 мкг/мл (100 мкл/лунку, 2,5 часа, 37°) и, после четырех пятикратной отмывки, — с аффинно-очищенными кроличьими антимышиными AT, конъюгированными с пероксидазой хрена (разведение конъюгата 1:3000, 100 мкл на лунку, 1 час, 37°). Антитела и конъюгат растворяли в ИФА-буфере. Ферментативную реакцию с ОФД проводили как описано выше (см. раздел III.2).
III.5. Определение активности бифункциональных антител иммуноферментным методом с двумя антигенами (doubl antigen ELISA-test). Для определения способности бифункциональных антител связывать одновременно два антигена (один из которых пероксидаза) иммунные планшеты насыщали антигеном (эндорфином, миоглобином или hlgG) как описано выше (см. раздел III.3). После отмывки в лунки планшетов добавляли 50 мкл раствора БИАТ (50−1000 нг/мл) и 50 мкл раствора пероксидазы (1 мкг/мл). Антитела и пероксидазу растворяли в ИФА-буфере. Планшеты инкубировали 2,5 часа при 37° и после отмывки проводили ферментативную реакцию с ОФД как описано выше.
III.6. Приготовление аффинных носителей. Антигены (эндорфин, миоглобин, пероксидазу хрена и IgG человека) ковалентно связывали с BrCN — сефарозой в соответствии с рекомендациями фирмы «Farmacia». Один мг антигена (в случае эндорфина 100 мкг) конъюгировали со 100 мг BrCN — сефарозы. Перед конъюгацией необходимое количество BrCN-сефарозы 4 В предварительно промывали 15 мин. раствором НС1 (рН 2−2,5) для удаления стабилизирующих добавок декстрана и лактозы.
Активированную сефарозу промывали большим избытком дистиллированной воды, суспендировали в 5 объемах (по отношению к весу сухой сефарозы) 0,1 М NaHC03 с 0,5 М NaCl и добавляли конъюгируемый белок, растворенный в минимальном объеме того же буфера. Реакции проводили при мягком перемешивании на круговом смесителе (30 об/мин) в течение ночи при 4 °C. Содержимое пробирки центрифугировали (5 минут, 1000g, 0°) и определяли в надосадочной жидкости количество не связавшегося лиганда по оптической плотности при 280 нм. Активные группы инактивировали добавлением глицина (35 мг на мл) с последующим перемешиванием на круговом смесителе при комнатной температуре в течение двух часов. Для удаления нековалентно адсорбированного белка проводили холостую хроматографию с полученным сорбентом: вначале пропускали 0,025 М Ыа-фосфатный буфер рН 7,4 с 0,15 М NaCl, затем 0,1 М уксусную кислоту (до рН 2,5 доводили НС1) и затем Ыа-фосфатный буфер. Эффективность конъюгирования белка с сефарозой указанным методом достигала 98%.
III.7. Аффинная очистка моноспецифических антител.
Моноспецифические антитела (анти-ЭНД, анти-ПХ, анти-Мб и анти hlgG) очищали из асцитных жидкостей соответствующих гибридом с помощью одностадийной аффинной хроматографии. Предварительно IgG асцитных жидкостей осаждали (NHt^SC^ (0,5 г/мл). Осадок, полученный после центрифугирования (4000 об/мин., 0 °C, 20 мин.), растворяли в 15−30 мл 0,025 М Na-фосфатного буфера рН 7,5 (ФБ) с 0,15 М NaCl и три раза пропускали через колонку с иммуносорбентом. Иммуносорбент промывали тем же буфером до исчезновения поглощения при 280 нм. Антитела элюировали 0,1 М уксусной кислотой рН 2,2 (доводили НС1). Элюат нейтрализовали концентрированным аммиаком.
111.8. Аффинная очистка бифункциональных антител.
Аффинную очистку бифункциональных антител из асцитных жидкостей проводили в две стадии, путем последовательных аффинных хроматографий. Все БИАТ нашей панели несли сайт связывания с пероксидазой. Первый этап очистки БИАТ — аффинная хроматография на ПХ-сефарозе (см. предыдущий раздел). Второй этап очисткихроматография на соответствующем антиген-сефарозном носителе (так, для антител со специфичностью анти-Мб/анти-IIX второй этапхроматография на миоглобин-сефарозе). Все процедуры аффинной хроматографии совпадают с описанными в разделе III.7.
111.9. Определение концентрации белка. Концентрацию очищенного раствора миоглобина, очищенных антител и пероксидазы хрена определяли оптическим методом. Полагали, что при концентрации Мб 10 мг/мл и Апонм^^, 2 [Faseuau, 1976]- при концентрации очищенных антител 10 мг/мл [Faseuau, 1976]. Для 1%-ного раствора очищенной ПХ ^знм=22'75 ишшм =7'3 [Ishikawa et al., 1983].
111.10. Фракционирование продуктов секреции тетрадомы для количественного определения антител. Для количественного определения субфракций антител, которые продуцирует гибридная гибридома 40E9x36F9 (анти-ЭНД/анти-ПХ) к фиксированному объему культурального супернатанта добавляли БСА (до 0,2%) и твин 20 (до 0,05%). Схема фракционирования иллюстрируется рис. 6. Элюэнт (0,1 М уксусная кислота рН2,2) также включал БСА и твин 20 в указанных концентрациях. После фракционирования на ПХ-сефарозе антитела разделяли на две субфракции: связавшиеся с ПХ-сефарозой (антипероксидазные и бифункциональные) и не связавшиеся с ПХ-сефарозой (антиэндорфиновые и неактивныесм. также рис 1). После.
Рисунок 6. Схема фракционирования продуктов секреции квадромы 40E9x36F9 (антиэндорфин/антипероксидаза) с помощью аффинной хроматографии. очистки антител, связавшихся с ПХ-сефарозой, на ЭНД-сефарозе выделялись БИАТ (связывались с ЭНД-сефарозой) и антиэндорфиновые AT (не связывались с ЭНД-сефарозой). Антитела, которые на первом этапе очистки не связывались с ПХ-сефарозой, очищали на ЭНД-сефарозе в результате чего выделяли фракцию анти-ЭНД антител и неактивных антител (см. рис. 6). Итогом описанной схемы разделения было получение четырех фракций AT, продуцируемых тетрадомой: бифункциональных, антипероксидазных, антиэндорфиновых и неактивных, которые определялись количественно.
111.11. Приготовление антигенов и антител, меченых 1251.
Эндорфин, миоглобин, hlgG и очищенные антитела иодировали 1 хлораминовым методом (20 мБк I на 1 мкг ЭНД или на 5−10 мкг другого белка). Инкубационная смесь включала: белок или пептид в 10 мкл Н20, 10 мкл 0,5 М ФБ рН 7,5- около 10 мкл раствора, 251 и 10 мкл хлорамина Т (0,5 мг/мл). Реакция продолжалась 30 сек при легком покачивании пробирки. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл ИФА-буфера с 2% меркаптоэтанолом [Greenwood et al., 1963]. Йодированный белок очищали от свободного 1251 путем гель фильтрации на сефадексе G-10, уравновешенном ИФА-буфером или с помощью аффинной хроматографии.
111.12. Определение концентрации меченых I антител после аффинной очистки. Для определения концентрации меченых AT готовили разведения родительских МКА и БИАТ в концентрациях: 1, 2, ., 4096 нг/мл (стандартные кривые связывания). Планшеты, насыщенные антигеном (пероксидазой, hlgG или Мб), последовательно инкубировали со стандартным количеством антител или соответствующими мечеными AT (все пробы в четырех повторах), антимышиными антителами, мечеными биотином и авидином, конъюгированным со щелочной фосфатазой (детали описаны в разделе III.2).
Для определения концентрации БИАТ анти-ПХ/hIgG анализировали их связывание с ПХ и hlgG и рассчитывали среднюю концентрацию. Для определения концентрации БИАТ анти-ПХ/Мб анализировали их связывание с ПХ и Мб и рассчитывали среднюю концентрацию.
111.13. Определение концентрации антител в культуральных супернатантах радиоиммунологическим методом. Для радиоиммунологического определения антител использовалась антисыворотка к суммарным иммуноглобулинам мыши, полученная в.
Институте эпидемиологии и микробиологии им. Гамалея РАМН. 1.
Инкубационная смесь включала меченные I антитела (30 000 ерш), стандартное количество антител или исследуемого образца и антисыворотку, в разведении, которое обеспечивало связывание около 50% иммунореактивного меченого антигена. Концентрацию IgG во фракции неактивных антител определяли с использованием 1-БИАТ в качестве меченого антигенатот же меченый антиген использовался при определении БИАТ. При определении антител к ПХ инкубационная смесь содержала меченные, 251 антитела к ПХ, при определении антиэндорфиновых антител — меченные I антитела к ЭНД. Все компоненты инкубационной смеси растворяли в РИА буфере (см. раздел 8). Инкубационная смесь объемом 1 мл включала 0,1 мл кроличьей антисыворотки против мышиного IgG (при конечном разведении 5×10″ 6, 8×10″ 6 и 1,25×10″ 6 для меченых антител к ЭНД, ПХ и БИАТ, соответственно), 0,1 мл исследуемого образца или стандарта соответствующих антител (в концентрации 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 и 128 нг в пробе) и 0,7 мл ИФА-буфера. При измерении концентрации иммуноглобулинов во фракции неактивных антител в качестве стандарта использовали БИАТ. Пробы инкубировали при комнатной температуре 16−24 часа, добавляли в каждую пробирку 0,1 мл ослиных антикроличьих антител в разведении 1:5, преинкубированных с 5%-ной о нейтральной сывороткой мыши (1 час при 37 С), и 0,1 мл нейтральной сыворотки кролика в разведении 1:50. Через сутки в пробы добавляли 1,5 мл физиологического раствора, центрифугировали (30 мин., 1000 g, 0°С) и после удаления супернатантов определяли радиоактивность в осадках. Контрольная ростовая среда (DMEM с 10% эмбриональной сыворотки телят) не влияла на связывание меченых антител с антимышиной сывороткой. Общую концентрацию иммуноглобулинов в нефракционированных культуральных супернатантах квадром определяли как было описано выше, используя аффинноочищенные БИАТ для приготовления меченого антигена и стандартов.
111.14. Анализ связывания меченых 1251 антител с антигеном, адсорбированным на твердой фазе. Гибкие иммунные планшеты (Titertek) насыщали антигеном, как описано в разделе 4.5 (50 мкл на лунку) и инкубировали 3 часа при 37 °C с растворенными в ИФА-буфере 1251-мечеными антителами (1×103 — 1×107 срт/мл, 50 мкл раствора на лунку). Двукратное увеличение времени инкубации не приводило к достоверному увеличению регистрируемого связывания (данные не приводятся). Планшеты 4−5 раз споласкивали дистиллированной водой, высушивали ночь при комнатной температуре, вырезали лунки и просчитывали на у-счетчике GammaTrac 1191. Для определения общего количества 1251-меченых антител из каждого разведения просчитывалась аликвота объемом 50 мкл.
111.15. Определение равновесной константы ассоциации при связывании антител с антигенами. Параметры связывания антител с антигенами определяли в соответствии с теорией, которая изложена в разделе II.5.1. Равновесные константы ассоциации в растворе (Ка) монофункциональных и бифункциональных антител с ЭНД, hlgG и миоглобином определяли радиоиммунологическим методом. При определении констант делалось допущение, что меченый и «холодный» антиген связываются с антителами одинаковым образом. Кривые вытеснения меченого лиганда «холодным» строили в координатах Скэтчарда [Scatchard, 1949]. Из графика зависимости B/F (отношение доли связанного антигена [В] к свободному [F]) от концентрации связанного [В] определяли равновесную константу ассоциации Ка. При расчетах исходили из того, что в реакции связывания с антителами участвует не весь меченый антиген, а только его «иммунореактивная» часть. Иммунореактивный антиген определялся как та доля меченого антигена, которая связывается с антителами при их относительном избытке. Доля «иммунореактивного» антигена определялась для каждой партии меченого 1251 лиганда. Концентрация свободного (F) и связанного (В) лиганда вычислялась по формулам: В0 (ерш) = 0,5 х ТиВ (нМ) = {Во (cpm) — Bj (ерш)} х кF (нМ) = С0 (нМ) — В (нМ), где.
Ти — суммарное количество, 251-антигена в инкубационной смеси, способного связываться антителами, (иммунореактивный лигандопределяли из предварительных экспериментов по связыванию);
Во — 1251-антиген, связавшийся с антителами в отсутствие немеченого антигена, ершк — коэффициент, переводящий соответствующее количество меченого антигена из ерш в нМ (например, из расчета следует, что 15 000 ерш соответствуют 1,5×10″ 11 М ЭНД);
Bj — меченый антиген, связавшийся с антителами в присутствии данной концентрации немеченого, cpm;
В — концентрация связавшегося с антителами немеченого антигена, нМ.
F — концентрация «свободного», т. е. не связавшегося с антителами немеченого антигена;
Со — общая концентрация немеченого антигена в инкубационной смеси, нМ.
Наклон прямой, построенной в координатах Скэтчарда (по оси абсцисс — В, по оси ординат — B/F), определял Ка.
Сходным образом строили графики Скэтчарда при определении параметров связывания меченых 1251 антител с антигенами, иммобилизованными на твердой фазе. Однако в этом случае полагали, что 100% меченых антител обладают способностью связываться с иммобилизованным антигеном. Это допущение вполне оправдано, так как все антитела очищались с помощью аффинной хроматографии на антиген-сефарозе. При компьютерном построении графиков была использована программа Microsoft Exel.
111.16. Определение равновесной константы ассоциации антипероксидазных антител. Связывание пероксидазы хрена с монофункциональными и бифункциональными антителами, несущими тождественный сайт связывания с ПХ проводили твердофазным ИФА, как описано в разделе Ш. 2. После насыщения планшетов антипероксидазными или бифункциональными антителами в планшеты добавляли 100 мкл раствора ПХ в концентрациях от 6,2×10″ 12 М до 8×10″ 10 М. В качестве субстрата ПХ для специфического окрашивания использовали ОФД. Все измерения проводили в трипликатах и концентрацию связанной ПХ определяли из калибровочной прямой с известными концентрациями ПХ. В предварительных экспериментах было показано, что активность ПХ не меняется при связывании с избытком антител. Концентрацию свободной ПХ вычисляли вычитанием связанной концентрации из общей и Ка определяли из наклона графика Скэтчарда (см. раздел III. 14).
111.17. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствие додецилсульфата натрия. Электрофорез в полиакриламидном геле с SDS-Na проводили в вертикальных пластинах толщиной 1 мм по методу Лэммли [Laemmli, 1970]. Разделяющий гель содержал 12,5% акриламида и 0,1% метиленбисакриламида в 0,375 М трис-HCl буфере, рН 8,9. Концентрирующий гель включал акриламид и метиленбисакриламид в концентрации 3% и 0,5% соответственно в 0,125 М трис-HCl, рН 6,8. Оба буфера включали 0,1% SDS-Na и 0,025% тетраметилэтилендиамина. Для инициации полимеризации вносили персульфат аммония в конечной концентрации 0,1%. Высота концентрирующего геля составляла 7−12 мм. Электродный буфер — 0,025 М трис, 0,192 М глицин (трис-глициновый буфер, рН 8,3) с 0,1% SDS-Na. Электрофорез проводили при напряжении 6,25 вольт/см до тех пор, пока краситель бромфеноловый синий не проходил в разделяющем геле 70−80 мм. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор низкомолекулярных стандартов для электрофореза фирмы «Farmacia» .
111.18. Двумерный электрофорез. Двумерный электрофорез антител, очищенных из асцитных жидкостей квадромы 40E9x36F9 (БИАТ, анти-ЭНД/ПХ) и родительских AT (анти-ЭНД и анти-ПХ) был выполнен по методу О’Фаррелл [O'Farrel, 1975], с использованием 20 мкг белка на пробу. Окрашивание гелей проводили Кумасси голубым.
111.19. Анализ связывания антител с иммобилизованным антигеном с помощью оптического биосенсора IAsys. В настоящей работе определение параметров связывания антител с иммобилизованным антигеном было выполнено с помощью биосенсора резонансное зеркало, IAsys, фирмы Fisons Applied Sensor Technology, UK, (FAST). Этот прибор позволяет следить за процессами взаимодейст.
Оптический биосенсор резонансное зеркало lAsys.
Вибромешалка.
Раствор антител.
Слой с низким индексом преломления.
Биослой.
Слой с высоким индексом преломления Поляризатор
Детектор
Передвижение лазера (10).
Резонансный свет.
Свет при резонансном угле Н Свет при веек других углах Н Б.
Сигнал.
Время, с.
Рисунок 7. Устройство и принцип действия оптического биосенсора IAsys.
А. Схема оптического биосенсора IAsys.
Б. Иммобилизация пероксидазы на поверхности кюветы (связывание с карбоксиметилированным декстраном). 1 — активация декстрана EDC и NHS- 2 — промывка кюветы PBST- 3 — промывка кюветы 10 тМ натрий ацетатным буфером- 4 — добавление HRP- 5 -деактивация этаноламином. вия антиген-антитело на границе раздела фаз, непосредственно в то время, когда они происходят, без использования меченых реагентов [Cush et al., 1993, Buckle et al., 1993, Davies et al., 1994]. Важным преимуществом подобных биосенсоров при изучении связывания антител с иммобилизованными антигенами является возможность быстрого определения не только наблюдаемой равновесной константы ассоциации (К^), но и наблюдаемых кинетических констант ассоциации и диссоциации (kass и kdiss) [Karlson et al., 1991, Roggenbuck et al., 1994, George et al., 1995, Yeung et al., 1995, Nice et al., 1996, Nieba, 1996, Reinartz et al., 1996]. Принцип действия IAsys (рис. 7) заключается в следующем: поверхность биосенсора освещают лазером, при этом в поверхностном слое возникает быстро исчезающее волновое поле, позволяющее детектировать малейшие изменения индекса преломления и (или) плотности поверхностного слоя биосенсора (резонансного зеркала). Например, при иммунологической реакции антител с иммобилизованным антигеном плотность поверхностного слоя увеличивается, и соответствующим образом увеличивается регистрируемый биосенсором сигнал. Физические основы работы и конструкция используемого прибора более подробно описаны ранее [Davies et al., 1994]. Полученные экспериментальные данные были обработаны и сохранены с помощью программного обеспечения к прибору (IAsys software, FAST). Все измерения были выполнены при 25 °C. В биосенсоре IAsys используется система, в которой отдельная передвижная кювета может быть вставлена в измерительную ячейку прибора. Рабочий объем раствора в кювете во всех экспериментах составлял 200 мкл. В биосенсоре IAsys применяется вибрационный тип перемешивания: используется мешалка, которая эффективно перемешивает раствор. Скорость перемешивания раствора в кювете равнялась 7200 оборотов в мин (60 единиц прибора).
111.20. Иммобилизация антигенов (HRP и hlgGl) на поверхность кюветы биосенсора Iasys. Пероксидазу и hlgGl ковалентно привязывались к поверхности аналитической кюветы, покрытой карбоксиметилированным декстраном, с помощью метода подробно описанного ранее [George et al., 1995, Yeung et al., 1995]. Химия метода заключается в присоединении антигена через аминогруппу к карбоксильной группе декстрана. После активации карбоксиметилированного декстрана 1 -этил-З-(З-диметиламинопропил)-карбодиимидом, и N-гидроксисукцинимидом в кювету добавлялись пероксидаза или hlgGl (25 мкг/мл) в 0,01 М ацетатном буфере рН 5,5. Свободные карбоксильные группы декстрана блокировались добавлением 1 М этаноламина рН 8,5. Кювету отмывали от нековалентно связавшегося белка двух трехкратным ополаскиванием 0,05 М НС1. Кривые иммобилизации были обработаны и сохранены с помощью программного обеспечения прибора, IAsys software (рис 7-Б).
Зная абсолютную величину сигнала биосенсора, который дает иммобилизованный антиген, при помощи инструкции к IAsys software, поставляемой вместе с биосенсором, можно рассчитать поверхностную концентрацию антигена. Для HRP сигнал составлял 1700 arc second, что эквивалентно поверхностной концентрации HRP равной 10,5 нг/мм или (26±-2)х10″ 14 моль/мм2. Для hlgGl сигнал составлял 5500 arc second, что эквивалентно поверхностной концентрации hlgGl равной 33,5 нг/мм или (21±-1)х10″ 14 моль/мм2.
111.21. Кинетика связывания антител с иммобилизованными HRP и hlgGl. Ассоциация антител с иммобилизованными HRP и hlgGl регистрировалась после добавления значительного избытка антител по отношению к иммобилизованному антигену (диапазон концентраций антител 3−1031 нМ). Аналитическая кювета с иммобилизованным антигеном уравновешивалась 180−195 мкл 0,025 М Na-фосфатного буфера рН 7,4 с 0,15 М NaCl и 0,5 мл/л твина 20 не менее 5 мин. После этого в кювету добавляли 5−20 мкл раствора антител и регистрировали связывание 5−10 мин. Процесс диссоциации антител регистрировался в течение 5−15 мин, после удаления раствора антител и однократного добавления в кювету 200 мкл 0,025 М Na-фосфатного буфера рН 7,4 с 0,15 М NaCl и 0,5 мл/л твина 20. Кювету регенерировали добавлением 0,05 М НС1 в течение 2 мин. Все антитела были проанализированы при 5−8 различных концентрациях. Полученные данные были обработаны и сохранены с помощью программного обеспечения прибора (IAsys software).
Для обсчета данных, полученных с помощью биосенсора IAsys, использовалась специальная программа FASTfit, позволяющая математически обрабатывать кривые ассоциации и диссоциации, получаемые с помощью биосенсора IAsys. Программа позволяет пользователю выбирать зоны обсчета базовой линии, ассоциации и диссоциации. Кроме того, пользователь может выбирать начальные точки ассоциации и диссоциации. Во всех экспериментах базовая линия обсчитывалась не менее 2 мин перед началом ассоциации. Зона обсчета ассоциации начиналась через 5 с после добавления антител. За это время происходило перемешивание раствора, и прекращался сдвиг сигнала, вызванный изменением буфера после добавления раствора антител. Ассоциация обсчитывалась в течение 300 с после добавления антител. Зона обсчета диссоциации начиналась через 10с после удаления раствора с остатками антител и добавления буфера. Диссоциация обсчитывалась в течение 300 с после добавления буфера.
111.22. Преобразование кинетических кривых, получаемых с помощью оптического биосенсора. В биосенсоре IAsys концентрация комплекса антиген-антитело ([В]) измеряется непосредственно как сигнал ® измеряемый в arc seconds. Уравнение 9, описывающее ассоциацию антител с иммобилизованным антигеном при псевдопервом порядке реакции, в программе FASTfit (раздел 2.2.7) преобразуется следующим образом: где Ro — сигнал, при t=0 (arc seconds). Эта величина специально вводится, чтобы скорректировать возможный первоначальный сдвиг сигнала, вызванный изменением буфера после добавления раствора антител. Е называется степенью реакции и аналогична [B]r/J в уравнениях 9 и 10 (arc seconds).
Уравнение 13, описывающее необратимую диссоциацию антител от иммобилизованного антигена, в программе FASTfit преобразуется следующим образом: где Rq1SS — сигнал, при t=0 (arc seconds), эта величина аналогична [В]0 в уравнении 13. Программа FASTfit использует повторяющуюся процедуру обработки экспериментальных данных по ассоциации и диссоциации для получения величин уравнений 16 и 17. В настоящей работе ошибки рассчитывались при помощи матричной инверсии [O'Shannessy et al., 1993].
R = R0 +E (l-e~k°nt).
16),.
R = R.
17),.
